Analyse de suivi des nanoparticules pour la quantification et la détermination de la taille des vésicules extracellulaires

Les résultats de la NTA sont très sujets au biais de l’opérateur. Ce protocole démontre les effets de la modification des paramètres de l’ATN sur les résultats obtenus. Une méthode normalisée aidera à accroître la rigueur et la reproductibilité dans l’analyse NTA.

L’analyse de l’échantillon dans une cuvette permet de capturer un échantillon statistiquement aléatoire dans chaque vidéo. Il en résulte des données plus reproductibles et la visualisation de particules sur une large gamme de tailles. Comme il peut être difficile d’obtenir un échantillon dans la plage de concentration de particules recommandée, assurez-vous d’effectuer une dilution en série pour identifier le facteur de dilution idéal.

Kungheng Cai, un doctorant du laboratoire d’Anthony Ferrante, fera la démonstration de la procédure. Pour préparer la cuvette pour l’analyse de suivi des nanoparticules, couvrez l’espace de travail avec un matériau non pelucheux pour empêcher les fibres de pénétrer dans les cuvettes. En portant des gants, placez une cuvette contenant une barre de remuage sur le gabarit de cuvette magnétique.

Utilisez un outil à crochet pour placer l’insert dans la cuvette avec l’encoche de l’insert visible à l’avant de la cuvette. Utilisez une pipette pour ajouter lentement 400 à 500 microlitres de vésicules extracellulaires purifiées sur la cuvette à travers le trou dans l’insert et mélangez l’échantillon en pipetant doucement sans introduire de bulles d’air, puis coiffez la cuvette, en tapotant des bulles si nécessaire et utilisez un chiffon non pelucheux pour essuyer la surface extérieure de la cuvette. Pour analyser la concentration de particules du diluant ou d’un échantillon, allumez le poste de travail et l’instrument informatiques et démarrez le programme d’analyse de suivi des particules.

Lorsque vous y êtes invité, cliquez sur NTA et ouvrez l’onglet d’enregistrement. Suivez les instructions à l’écran pour remplir tous les exemples d’informations nécessaires. Pour l’analyse du suivi ev, réglez le diluant sur PBS.

La salinité se remplira automatiquement à 9% Pour obtenir la concentration de diluant ou de particules de l’échantillon, ouvrez le couvercle de l’instrument et retirez le couvercle du capuchon de protection à l’endroit où la cuvette sera placée. Chargez la cuvette dans l’instrument dans la bonne orientation avec l’encoche de l’insert face à la caméra et remplacez le capuchon et le couvercle de l’instrument. Cliquez sur la flèche de diffusion en continu pour allumer l’appareil photo, puis cliquez sur la flèche en chevron pour développer les paramètres d’enregistrement.

Ajustez la mise au point jusqu’à ce que les particules relativement petites soient clairement visibles. Pour définir l’analyse pour une petite quantification EV, réglez la fréquence d’images à 30 images par seconde, l’exposition à 15 millisecondes, le temps d’agitation à cinq secondes, le temps d’attente à trois secondes, les puissances laser bleues, vertes et rouges à 210, 12 et 8 milliwatts respectivement, les images par vidéo à 300 et le gain à 30 décibels. Ajustez la mise au point jusqu’à ce que les particules relativement petites soient clairement visibles.

L’augmentation du zoom et/ou du gain peut aider à la mise au point des particules. Mais si vous augmentez le gain, n’oubliez pas de le régler à 30 décibels avant l’enregistrement. Une fois que les particules sont au point, réglez le paramètre de zoom sur 0,5X pour économiser de la bande passante et éviter la perte d’images et cliquez sur Enregistrer pour commencer à enregistrer la vidéo.

Lorsqu’une invite s’affiche indiquant que les vidéos ont été enregistrées, cliquez sur OK pour terminer l’enregistrement et sélectionnez l’onglet processus. Si de très grosses particules étaient visibles dans une vidéo pendant l’enregistrement, accédez au répertoire des vidéos enregistrées et supprimez toute vidéo problématique avant le traitement. Cochez la case Désactiver le remplacement de la détection audio et définissez le diamètre de la fonction sur 30.

Cliquez sur Processus pour lancer le traitement vidéo et afficher un graphique de distribution en direct. Une fois le traitement terminé, cliquez sur OK et sélectionnez l’onglet Tracé. Pour les véhicules électriques, affichez le tableau principal sous forme de silice de bac à journaux.

D’autres fonctionnalités du graphique, telles que la modification de l’axe des x pour définir la zone d’intégration de la figure produite, peuvent être personnalisées. Pour créer un rapport PDF des résultats, cliquez sur le bouton Rapport. La moyenne, la médiane, la taille du mode et la concentration ajustées en fonction du facteur de dilution et de la largeur de distribution seront affichées.

La NTA du diluant doit être effectuée avant tout échantillon afin que la concentration de ce blanc puisse être soustraite de la concentration de particules de l’échantillon EV. Pour nettoyer les cuvettes après analyse, videz la cuvette et remplissez complètement les cuvettes 10 à 15 fois avec de l’eau désionisée et les trois fois avec 70 à 100% d’éthanol pour éliminer tout échantillon résiduel. Séchez l’extérieur des cuvettes avec un chiffon en microfibre non pelucheux et séchez l’intérieur avec un duster à air comprimé.

Pour nettoyer les inserts et les barres d’agitation, placez les matériaux dans un flacon de scintillation en verre contenant de 70 à 100% d’éthanol et secouez vigoureusement le flacon. Rincez ensuite les inserts et remuez les barres dans de l’eau désionisée en les agitant comme démontré et séchez-les à l’aide de chiffons non pelucheux. Après séchage, placez immédiatement tous les composants propres dans le stockage jusqu’à la prochaine analyse.

Avant d’effectuer une analyse, l’étalonnage de l’instrument a été testé à l’aide de billes de polystyrène pour s’assurer de la validité des données acquises. Comme observé, l’instrument de suivi des particules a rapporté avec précision la taille des perles de manodisperse de 100 nanomètres, mais n’a rapporté que de près la taille des perles de 400 nanomètres. Par conséquent, les réglages de l’instrument pour ce protocole étaient plus précis pour les particules plus petites, de taille plus proche de 100 nanomètres.

À l’aide de ces paramètres, la concentration de particules rapportée s’échelonnes en conséquence, le facteur de dilution démontrant que l’instrument peut détecter avec précision la concentration de particules à diverses dilutions avec peu de variabilité entre les réplicants techniques. La dilution optimale pour un échantillon de TISSU DE SOURIS de 4,41 fois 10 à 10e par millilitre de tissu de souris a été déterminée entre 1 000 et 3 000. Dans cette analyse, l’augmentation du gain a augmenté la sensibilité de la caméra, permettant une augmentation de la visualisation d’un plus grand nombre de particules plus petites.

L’augmentation de la puissance du laser bleu de 70 à 210 milliwatts tout en maintenant les puissances laser vertes et rouges constantes a déplacé la taille moyenne des particules signalée de 122 à 105 nanomètres et a augmenté la concentration totale de particules signalée de 1,1 fois 10 à la huitième à 1,7 fois 10 à la huitième. L’augmentation de la puissance du laser rouge a augmenté la taille moyenne des particules signalée de 175 à 246 nanomètres et a diminué la concentration totale de particules signalée. L’augmentation de la puissance du laser vert a entraîné une diminution de la taille moyenne des particules signalée et une augmentation de la concentration totale de particules signalée.

Trouver la bonne dilution pour placer un échantillon dans la plage de détection optimale peut prendre quelques essais pour chaque échantillon. Le nettoyage de la cuvette nécessite également une manipulation très prudente. Nous recommandons d’appliquer plus d’une méthode orthogonale pour les mesures de la taille et de la concentration des particules EV.

La diffusion dynamique de la lumière, la détection d’impulsions résistives, la microscopie électronique à transmission et la détection par imagerie par réflectance interférométrique à particule unique peuvent également être effectuées pour caractériser les VE.