Name: Génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Apprenez à générer des organoïdes pulmonaires 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour modéliser le développement et les maladies pulmonaires humaines. Cette méthode permet d'étudier les interactions cellulaires et les mutations génétiques in vitro.

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Cette recherche a été soutenue par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Ce protocole d’étude a été approuvé par l’Institutional Review Board du Human Research Protections Program de l’UCSD (181180).
1. Induction définitive de l’endoderme à partir de cellules souches pluripotentes induites (Jour 1 - 3)
<ol><li>Décongeler lentement le facteur de croissance réduit (DFG)-milieu de la matrice de membrane basale (BM) sur la glace 30 minutes avant l’utilisation. Dans le mélange DMEM/F12 froid, diluer le milieu de matrice GFR BM 1:1 de telle sorte qu’il constitue 50% de ce milieu. Placez les embouts de pipette P1000 au congélateur pour les refroidir avant utilisation.</li>
	<li>Recouvrir chaque puits d’une plaque de 12 puits avec 500 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR à 50 % préparé dans du DMEM/F12 glacé. Une fois que le nombre souhaité de puits est revêtu, retirez tout excès de mélange de milieu et/ou de bulles des puits et placez la plaque sur de la glace ou un réfrigérateur à 4 °C pendant 20 min pour fixer. Ensuite, déplacez la plaque vers l’incubateur à 37 °C pendant la nuit pour geler et sécher.</li>
	<li>Une fois que les hiPSC atteignent 70 à 90 % de confluence, ajoutez 10 μM d’inhibiteur de la kinase rho-associée (ROCK) Y-27632 une heure avant la dissociation. Aspirer le milieu et laver une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Dissocier les cSH en ajoutant un milieu de détachement cellulaire (0,5 mL/puits d’une plaque de 12 puits) et incuber pendant 20 min à 37 °C dans un incubateur à CO2 à 5 %.</li>
	<li>Retirer les plaques de l’incubateur et ajouter 0,5 mL/12 puits de milieu de passage des cellules souches (tableau 1) aux puits; triturez doucement les cellules à l’aide d’une pointe P1000 pour obtenir une suspension unicellulaire. Transférer des cellules dissociées dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL; centrifuger pendant 5 min à 300 x g.</li>
	<li>Aspirer le milieu et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu mTeSR Plus complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM (Y-27632). Effectuez un comptage de cellules. Ajouter 2,0 x 105 hiPSC dans 1 mL de mTeSR complété par un inhibiteur de ROCK Y-27632 par puits d’une plaque enduite de milieu de membrane basale GFR de 12 puits. Incuber à 37 °C pendant la nuit. REMARQUE: Le nombre de semis de cellules doit être optimisé par lignée cellulaire. 24 h après le placage, les puits doivent être confluents à 50% à 70%.</li>
	<li>Le jour 1, aspirez le mTeSR Plus et ajoutez le milieu d’induction de l’endoderme définitif (DE) (tableau 1) complété par 100 ng/mL d’activine A humaine et 5 μM d’inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021. REMARQUE: Les milieux DE avec inhibiteur de GSK3β / activateur Wnt CHIR99021 doivent être retirés dans les 20 à 24 heures suivant le jour 1 de l’induction DE pour une différenciation réussie.</li>
	<li>Le jour 2 et le jour 3, passez au milieu d’induction DE complété par 100 ng / mL d’activine A uniquement. REMARQUE: La différenciation DE ne doit pas dépasser un total de 72 h, sinon l’efficacité diminuera. Le jour 4, si l’on observe une mort cellulaire importante, diminuer le temps total d’exposition au milieu DE de 6 à 12 h.</li>
	<li>Pour analyser l’efficacité du DE, confirmer une expression supérieure à 90 % de CXCR4 et/ou de cKit par cytométrie en flux ou immunofluorescence de FOXA2 et/ou SOX17 (Figure 2a).</li>
</ol>2. Induction de l’endoderme de l’intestin antérieur (AFE) (Jour 4 - 6)
<ol><li>Le jour 4, changer le milieu en milieu basal libre sérique (SFBM) (tableau 1) complété par 10 μM SB431542 et 2 μM dorsomorphine pour l’induction de l’AFE. Changez de média AFE tous les jours pendant 3 jours (jour 4, jour 5 et jour 6).</li>
	<li>Pour analyser l’efficacité de l’AFE, confirmez l’expression robuste de SOX2, TBX1 et FOXA2 par coloration par immunofluorescence (Figure 2b).</li>
</ol>3. Différenciation des cellules progénitrices pulmonaires (LPC) (Jour 7 - 16)
<ol><li>Le jour 7, décongeler le milieu de la matrice de membrane basale GFR sur la glace. Aspirer le support AFE et bien laver avec 1x PBS. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire et incuber pendant 10 min à 37 °C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu de trempe (2 % de FBS dans le DMEM/F12) aux puits contenant une solution de détachement cellulaire. Gardez les cellules sous forme d’agrégats en pipetant doucement de haut en bas. Assurez-vous que toutes les cellules sont délogées et transférées dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Centrifuger pendant 5 min à 300 x g.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de trempe complété par 10 ng/mL de protéine morphogénique osseuse recombinante humaine 4 (BMP4), 0,1 μM d’acide rétinoïque tout trans (PR), 3 μM d’inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021 et 10 μM d’inhibiteur de roche Y-27632.</li>
	<li>Effectuez un comptage de cellules. Ajouter 2,5 x 105 cellules à 100 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR froid, bien mélanger et placer la gouttelette dans un puits d’une plaque de 12 puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 à 60 min pour permettre au milieu de polymériser. Ajouter 1 mL de milieu LPC complété par 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632 par puits en veillant à ce que la goutte moyenne soit complètement immergée et incuber à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Le jour 8, 24 h après l’induction du LPC, changez le milieu du LPC pour éliminer l’inhibiteur de ROCK Y-27632. Changez le support LPC tous les deux jours pour un total de 9 à 11 jours. REMARQUE: Si le milieu devient jaune dans les 24 heures, changez de milieu tous les jours.</li>
	<li>Pour analyser l’efficacité du LPC, confirmer l’expression robuste du facteur de transcription intracellulaire NKX2-1 ou effectuer une cytométrie en flux pour les marqueurs de surface CD47hi/CD26low15 ou CPM18 (Figure 2c). En gros, les sphéroïdes LPC doivent être ronds et transparents (Figure 2c). REMARQUE: Ne procédez pas à la différenciation organoïde pulmonaire si l’efficacité de NKX2-1 est inférieure à 30%.</li>
</ol>4.3D induction organoïde pulmonaire (Jour 16 - 22)
<ol><li>Le jour 17, décongeler le milieu de la matrice de la membrane basale GFR sur la glace. Aspirer le milieu d’induction LPC. Ajouter ensuite 2 μg/mL de dispase (1 mL) au puits et remettre en suspension le mélange milieu/dispase avec une pipette P1000. Incuber à 37 °C pendant 15 min. Triturer à nouveau le mélange et incuber à 37 °C pendant encore 15 min.</li>
	<li>Transférer la dispase et les cellules dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Utilisez du PBS réfrigéré (2-3 ml) pour laver le puits et remettre en suspension le mélange dispase/cellule. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Retirez manuellement le surnageant, en prenant soin de ne pas désenduire la couche de granulés de milieu / cellule. Répétez le lavage PBS réfrigéré et centrifugez le tube de centrifugeuse conique pendant encore 5 minutes à 400 x g.</li>
	<li>Retirez manuellement le surnageant, puis ajoutez 2 mL de solution de dissociation à base de trypsine au tube de centrifugeuse conique. Incuber à 37 °C pendant 12 min.</li>
	<li>Après l’incubation, remettez en suspension les cellules avec une pointe de pipette P1000. Ajoutez ensuite un volume égal de milieu de trempe au tube de centrifugeuse conique et faites tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min. Aspirer les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans un milieu de trempe + 10 μM de l’inhibiteur de ROCK Y-27632. REMARQUE: L’induction réussie des organoïdes pulmonaires se produit lorsque les cellules sont incorporées sous forme d’agrégats, et non de cellules individuelles, ajustant le pipetage en conséquence.</li>
	<li>Effectuez un comptage de cellules. Calculer le volume nécessaire pour obtenir 5,0-8,0 x 104 cellules par puits. Aliquoter les agrégats de la cellule LPC en tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Enlevez l’excès de surnageant, en prenant soin de ne pas agiter la pastille cellulaire. Ne laisser que 10 μL de milieu résiduel.</li>
	<li>Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR froid et ajoutez-la aux inserts de membrane de culture cellulaire (6,5 mm de diamètre, pore de 0,4 μm, membrane de polyester). Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 à 60 min pour permettre au milieu de la matrice de la membrane basale GFR de polymériser.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu d’induction organoïde 3D (tableau 1) complété par le facteur de croissance des fibroblastes-7 (FGF7) (10 ng/mL), le FGF10 (10 ng/mL), l’inhibiteur GSK3β/activateur Wnt CHIR (3 μM), le facteur de croissance épidermique (EGF) (10 ng/mL) et 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632 à la chambre basolatérale de l’insert membranaire. Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours.</li>
</ol>5.3D Ramification organoïde pulmonaire (Jour 23 - 28)
<ol><li>Le jour 23, le passage au milieu ramifié 3D (tableau 1) est complété par FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021 (3 μM), PR (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) et facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) / facteur de croissance placentaire (PlGF) (10 ng/mL). Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours. REMARQUE: Au jour 6 de la différenciation des ramifications 3D, il devrait y avoir plusieurs organoïdes ramifiés (Figure 2).</li>
</ol>6.3D maturation organoïde pulmonaire (Jour 29 - 34)
<ol><li>Le jour 29, passer au milieu de maturation 3D (tableau 1), qui est le même que le milieu ramifié 3D, mais avec l’ajout de dexaméthasone (50 nM), d’AMPc (100 μM) et de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), un inhibiteur de la phosphodiestérase également appelé isobutylxanthine (100 μM). Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours. REMARQUE: Dans les 24 heures suivant la maturation 3D, les organoïdes ramifiés devraient se dilater et se transformer en sphères transparentes.</li>
</ol>7.3D Immunocytochimie organoïde pulmonaire
<ol><li>Pour l’analyse 3D des organoïdes pulmonaires entiers, fixez le milieu de la matrice de la membrane basale GFR dans les inserts membranaires avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 1 h à 4 °C. Intégrer dans de la cire de paraffine et monter sur des diapositives selon les protocoles standard publiés.</li>
	<li>Effectuer la récupération de l’antigène avant la coloration. Les marqueurs des voies respiratoires comprennent KRT5, MUC5AC et SCGB3A2. Les marqueurs alvéolaires comprennent SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 et HOPX (Figure 3).</li>
</ol>8. Retrait d’organoïdes pulmonaires entiers du milieu de la matrice de la membrane basale DU DFG pour le passage, le FACS ou la cryoconservation
<ol><li>Pour dissocier les organoïdes du milieu de la matrice de la membrane basale GFR, retirez le milieu de la chambre basale et ajoutez 2 μg/mL de dispase (1 mL) dans la chambre apicale.</li>
	<li>Triturez délicatement le mélange milieu/dispase avec une pipette P1000 et placez-le dans l’incubateur pendant 15 min. Triturez doucement le mélange à nouveau et incubez pendant encore 15 min.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS réfrigéré (4 °C) et transférer les organoïdes avec le milieu matriciel dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Tourner à 400 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant pour ne pas déranger la pastille cellulaire.</li>
	<li>Laver une fois de plus avec 1 mL de PBS réfrigéré et tourner à 400 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant pour ne pas perturber le mélange milieu/cellule.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire au tube de centrifugeuse conique, rallumer doucement le mélange de matrice de membrane GFR-Basal/ cellule. Placer dans l’incubateur pendant 12 min pour les cellules de passage sous forme d’agrégats ou pour la cryoconservation), ou 20 min pour la suspension monocellulaire.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de support de trempe et tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min. Remise en suspension dans un milieu de trempe + 10 μM de l’inhibiteur de ROCK Y-27632. REMARQUE: À cette étape, aucun milieu résiduel de la membrane basale ne doit être vu dans le tube. S’il reste du milieu résiduel, répétez les étapes 8.5 et 8.6.</li>
	<li>Effectuez un comptage de cellules. Calculez le volume nécessaire pour les applications en aval.</li>
</ol>

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<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2%2B+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li>
<li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).</li>
<li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells%3A+universal+donor+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La différenciation réussie des organoïdes pulmonaires entiers (WLO) 3D repose sur un protocole en plusieurs étapes de 6 semaines avec une attention aux détails, y compris le temps d’exposition aux facteurs de croissance et aux petites molécules, la densité cellulaire après le passage et la qualité des hiPSC. Pour le dépannage, reportez-vous au Tableau 2. Les csahah doivent être confluents à environ 70 % à 80 %, avec moins de 5 % de différenciation spontanée avant la dissociation. Ce protocole fait appel ...

Le poumon est un organe compliqué, hétérogène et dynamique qui se développe en six stades distincts - maturation embryonnaire, pseudoglandulaire, canaliculaire, sacculaire, alvéolaire et microvasculaire1,2. Les deux dernières phases se produisent avant et après la naissance dans le développement humain, tandis que les quatre premières étapes se produisent exclusivement pendant le développement du fœtus, à moins qu’une naissance prématurée ne se produise3. La phase embryonnaire commence dans la couche germinale endodermique et se termine par le bourgeonnement de la trachée et des bourgeons pulmonaires. Le développement pulmonaire se produit en partie par signalisation entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses4. Ces interactions entraînent la ramification pulmonaire, la prolifération, la détermination du devenir cellulaire et la différenciation cellulaire du poumon en développement. Le poumon est divisé en zones conductrices (trachée aux bronchioles terminales) et zones respiratoires (bronchioles respiratoires aux alvéoles). Chaque zone contient des types uniques de cellules épithéliales; y compris les cellules basales, sécrétoires, ciliées, de brosse, neuroendocrines et ionocytaires dans les voies respiratoires conductrices5, suivies des cellules alvéolaires de type I et II dans l’épithélium respiratoire6. On ignore encore beaucoup de choses sur le développement et la réponse aux blessures des différents types de cellules. Les modèles d’organoïdes pulmonaires dérivés de la CSPi permettent d’étudier les mécanismes qui stimulent le développement pulmonaire humain, les effets des mutations génétiques sur la fonction pulmonaire et la réponse de l’épithélium et du mésenchyme aux agents infectieux sans avoir besoin de tissu pulmonaire humain primaire.
Les marqueurs correspondant aux différents stades de la différenciation embryonnaire comprennent CXCR4, cKit, FOXA2 et SOX17 pour l’endoderme définitif (DE)7, FOXA2, TBX1 et SOX2 pour l’endoderme antérieur de l’intestin antérieur (AFE)8, et NKX2-1 pour les cellules progénitrices pulmonaires précoces9. Dans le développement pulmonaire embryonnaire, l’intestin antérieur se divise en œsophage dorsal et trachée ventrale. Les bourgeons des poumons droit et gauche apparaissent comme deux outpouchings indépendants autour du bourgeon trachéal10. Au cours de la morphogenèse ramifiée, le mésenchyme entourant l’épithélium produit du tissu élastique, du muscle lisse, du cartilage et du système vasculaire11. L’interaction entre l’épithélium et le mésenchyme est essentielle au développement normal des poumons. Cela inclut la sécrétion de FGF1012 par le mésenchyme et de SHH13 produit par l’épithélium.
Ici, nous décrivons un protocole pour la différenciation dirigée des hiPSC en organoïdes pulmonaires entiers (WLO) tridimensionnels (3D). Bien qu’il existe des approches similaires qui intègrent l’isolement des cellules progénitrices pulmonaires par tri au stade LPC pour fabriquer des organoïdes alvéolaires14,15 (distaux) ou des organoïdes des voies respiratoires16 (proximaux), ou génèrent des sphéroïdes ventraux-antérieurs de l’intestin antérieur pour fabriquer des organoïdes pulmonaires humains exprimant des marqueurs alvéolaires et mésenchymateux et des organoïdes progénitrices de la pointe des bourgeons17 , la force de cette méthode est l’inclusion des deux types de cellules épithéliales et mésenchymateuses pulmonaires pour modéliser et orchestrer la morphogenèse, la maturation et l’expansion des ramifications pulmonaires in vitro.
Ce protocole utilise de petites molécules et des facteurs de croissance pour diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes à travers l’endoderme définitif, l’endoderme de l’intestin antérieur et les cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite induites en organoïdes pulmonaires entiers 3D à travers des étapes de développement importantes, y compris la ramification et la maturation. Le résumé du protocole de différenciation est illustré à la figure 1a avec des images représentatives en champ clair de la différenciation endodermique et organoïde illustrées à la figure 1b. La figure 1c,d montre les détails de l’expression génique de la différenciation endodermique ainsi que l’expression génique des populations proximales et distales des cellules épithéliales pulmonaires après avoir terminé la différenciation.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 plaques à 12 puits</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>inserts 12 puits, 0,4 um, translucide</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 sans acide rétinoïque</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) Fraction V, solution à 7,5 %</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ham s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco modifié' s Medium (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycérol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/caisse)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen/streptocoque</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Inhibiteur de roche)</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>Facteurs de croissance/Petites molécules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque tout-trans (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphine</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtyl-1-méthylxanthine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF/PIGF</td><td>R& D Systems</td><td>297-VP/CF</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Anticorps primaires</td><td></td><td></td><td>Taux de dilution</td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R& D Systems</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (mature)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1:1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (mature)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F) ; 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3d à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Le développement et la maladie pulmonaires humaines ont été difficiles à étudier en raison de l’absence de systèmes modèles in vitro biologiquement pertinents. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) peuvent être différenciées progressivement en organoïdes pulmonaires multicellulaires 3D, constitués à la fois de populations de cellules épithéliales et mésenchymateuses. Nous récapitulons les signaux de développement embryonnaire en introduisant temporellement une variété de facteurs de croissance et de petites molécules pour générer efficacement un endoderme définitif, un endoderme de l’intestin antérieur et, par conséquent, des cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite intégrées dans un milieu de matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (DFG), ce qui leur permet de se développer spontanément en organoïdes pulmonaires 3D en réponse à des facteurs de croissance externes. Ces organoïdes pulmonaires entiers (WLO) subissent des stades précoces de développement pulmonaire, y compris une morphogenèse ramifiée et une maturation après exposition à la dexaméthasone, à l’AMP cyclique et à l’isobutylxanthine. Les WHO possèdent des cellules épithéliales des voies respiratoires exprimant les marqueurs KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) et MUC5AC (gobelet) ainsi que des cellules épithéliales alvéolaires exprimant HOPX (type alvéolaire I) et SP-C (type alvéolaire II). Des cellules mésenchymateuses sont également présentes, notamment de l’actine musculaire lisse (SMA) et du récepteur A du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα). Les WFO dérivés de l’iPSC peuvent être maintenus dans des conditions de culture 3D pendant de nombreux mois et peuvent être triés pour les marqueurs de surface afin de purifier une population cellulaire spécifique. Les WFO dérivés de l’iPSC peuvent également être utilisés pour étudier le développement pulmonaire humain, y compris la signalisation entre l’épithélium pulmonaire et le mésenchyme, pour modéliser les mutations génétiques sur la fonction et le développement des cellules pulmonaires humaines et pour déterminer la cytotoxicité des agents infectieux.

24 heures après le placage, jour 1, les CSPi doivent être confluents à 50% à 90%. Le jour 2, DE devrait être confluent à 90% à 95%. Au cours de l’induction de DE, il est courant d’observer une mort cellulaire importante au jour 4, mais les cellules attachées conserveront une morphologie pavée compacte (Figure 2b). Arrêter la différenciation si la majorité des cellules adhérentes se détachent et envisager de raccourcir l’exposition aux milieux DE avec l’activine A de 6 à 12 h. Pendant l’induc...

L’article décrit la différenciation dirigée par étapes des cellules souches pluripotentes induites en organoïdes pulmonaires entiers tridimensionnels contenant à la fois des cellules pulmonaires épithéliales proximales et distales ainsi que du mésenchyme.

Génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Ce protocole utilise des cellules souches pluripotentes induites pour les différencier en cellules pulmonaires afin de modéliser la maladie pulmonaire humaine et son développement dans une boîte. Ce protocole est important car il est difficile d’obtenir et de cultiver du tissu pulmonaire humain primaire. Les principaux avantages de différencier les cellules pulmonaires des cellules souches pluripotentes sont d’avoir un approvisionnement constant en cellules pulmonaires spécifiques pour étudier le développement et la maladie pulmonaires humaines.Ces cellules peuvent être maintenues en culture cellulaire pendant de longues périodes, peuvent être cryoconservées pour de futures applications et peuvent être génétiquement manipulées pour étudier les mutations génétiques. Rachel McVicar, une candidate au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Avant de commencer l’expérience, décongelez lentement un milieu de matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit, ou DFG, sur de la glace et diluez-le dans un volume égal de DMEM F12 froid.Placez les embouts P1000 au congélateur pour les refroidir avant utilisation. Ensuite, recouvrez chaque puits d’une plaque de 12 puits avec 500 microlitres du milieu de matrice de membrane basale à 50% GFR et éliminez tout mélange de milieu et les bulles en excès des puits. Placez les plaques de puits sur de la glace humide ou un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pour les régler pendant 20 minutes, puis déplacez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Lorsque les EPS atteignent 70 % de confluence, ajoutez 10 micromolaires inhibiteur de ROCK Y27632 aux cellules souches pluripotentes induites par l’homme et attendez une heure avant la dissociation. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec PVS. Dissocier les IPSC en ajoutant 500 microlitres de milieu de détachement cellulaire par puits, et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone.Après l’incubation, ajouter 500 microlitres de milieu de passage de cellules souches par puits. Pipettez doucement les cellules à l’aide d’une pointe P1000 pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférez ensuite les cellules dissociées dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-les pendant cinq minutes à 300 fois G.Après centrifugation, aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de milieu mTeSR Plus complété par un inhibiteur de ROCK 10 micromolaires.Après avoir compté les cellules, ajoutez deux fois 10 aux cinquièmes IPSC à chaque puits d’une plaque recouverte de GFR de 12 puits et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez le mTeSR Plus avant d’ajouter un milieu d’induction endodermique définitif, ou DE. Les deuxième et troisième jours, changez le support d’induction DE.Le quatrième jour, commencez l’induction de l’AFE en remplaçant le milieu d’induction DE par un milieu basal sans sérum. Changez quotidiennement le support AFE pendant trois jours avant d’analyser l’efficacité AFE à la fin du sixième jour. Le septième jour, décongelez le milieu de la matrice de membrane basale GFR sur la glace pour une utilisation ultérieure.Simultanément, procéder à la différenciation des cellules progénitrices pulmonaires en aspirant le milieu AFE et en lavant les puits avec PVS. Ajouter un millilitre de solution de détachement cellulaire au puits et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajouter un millilitre de milieu de trempe aux puits contenant une solution de détachement cellulaire.Gardez les cellules sous forme d’agrégats en pipetant doucement de haut en bas. Assurez-vous que toutes les cellules sont délogées, mais pour les transférer dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation à 300 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans un milieu d’induction LPC.Comptez les cellules, ajoutez 2,5 fois 10 aux cinquièmes cellules à 100 microlitres de milieu de matrice de membrane basale GFR froid, et mélangez bien. Placer une gouttelette dans un puits d’une plaque de 12 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de média LPC par puits, en veillant à ce que la goutte moyenne soit complètement submergée et incubée pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le huitième jour, changez le milieu LPC pour éliminer l’inhibiteur de ROCK Y27632. Continuez à changer les médias tous les deux jours et analysez l’efficacité du LPC à la fin du jour 16. Le jour 17, lavez les puits et ajoutez 500 microlitres de deux microgrammes par millilitre de dispase.Pipette le mélange de dispase avec une pipette P1000 et incuber pendant 15 minutes, puis pipette le mélange et incuber pendant encore 15 minutes. Après l’incubation, ajoutez un millilitre du milieu de trempe aux puits contenant de la dispase et transférez les cellules dans des tubes coniques. Centrifugez et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de PVS réfrigéré, puis répétez la centrifugation.Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de détachement cellulaire. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 12 minutes, puis ajouter un volume égal de milieu de trempe et centrifuger à nouveau. Remettre en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de trempe et 10 micromolaires inhibiteur de ROCK Y27632.Effectuez un comptage de cellules pour calculer le volume nécessaire pour obtenir huit fois 10 à la quatrième cellule par puits. Ensuite, aliquote a nécessité le volume d’agrégats de cellules LPC dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, et centrifugez pendant cinq minutes à 300 fois G.Éliminez l’excès de surnageant sans agiter la pastille de cellule, laissant 10 microlitres de milieu résiduel. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de milieu de matrice de membrane basale GFR froid et transférer les cellules dans des inserts de membrane de culture cellulaire.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Après l’incubation, ajoutez un millilitre de milieu d’induction organoïde 3D à la chambre basolatérale de l’insert et remplacez-le par un milieu frais tous les deux jours pendant six jours. Le jour 23, passez le support au milieu de ramification 3D, puis changez le support tous les deux jours pendant six jours.Le jour 29, passez au milieu de maturation 3D et continuez à remplacer le milieu tous les deux jours pendant les six jours suivants. Le quatrième jour de l’induction DE, les cellules attachées présentent une morphologie pavée compacte. Les marqueurs endodermiques définitifs CXCR4 et SOX17 superposés à des noyaux ont été exprimés, confirmant la différenciation endodermique.L’induction de l’intestin antérieur a été confirmée le septième jour avec la morphologie montrant des cellules plus étroitement compactées, et les marqueurs FOXA2 et SOX2 superposés avec des noyaux. La génération de cellules progénitrices pulmonaires 3D a été confirmée avec des sphéroïdes 3D et l’expression endogène de NKX2-1 GFP dans une lignée cellulaire rapporteure. Après une différenciation de trois semaines en organoïdes pulmonaires entiers, les marqueurs pulmonaires ont été analysés par immunocytochimie.Des marqueurs de morphogenèse ramifiée SOX2 et SOX9 superposés par des noyaux ont été observés dans les organoïdes. Les marqueurs pulmonaires proximaux P63 et KRT5, tous deux marqueurs des cellules basales, ont été détectés avec succès avec SCGB3A2, qui est un marqueur pour les cellules de club. Les marqueurs pulmonaires distaux ont induit des marqueurs Pro SPC et SPB pour les cellules alvéolaires de type II.Et les marqueurs HOPX des cellules alvéolaires de type I. De plus, NKX2-1 et ZO1 ont été exprimés superposés avec des noyaux. Les marqueurs de cellules pulmonaires de mésenchyme PGFR Alpha, un marqueur pour les fibroblastes, co-exprimé avec SOX9, représentaient le mésenchyme distal.Vimentin a également été exprimé et a été dispersé dans tout le poumon. Suite à cette procédure, les organoïdes pulmonaires peuvent être investis avec des cellules endothéliales et immunitaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites. Le développement pulmonaire et la maladie se produisent par une signalisation entre les populations de cellules épithéliales et mésenchymateuses, mais aussi à partir de cellules endothéliales et de macrophages.Un système de modèle de tissu pulmonaire 3D est cliniquement pertinent pour étudier les maladies humaines et les thérapies.

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