Name: Utilisation de la culture d’organes de type Trowell pour étudier la régulation des cellules souches dentaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Découvrez la culture d'organes de type Trowell pour étudier les cellules souches dentaires dans la souris. Cette méthode permet d'observer et de manipuler les cellules souches épithéliales de la niche cervicale in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cette étude a été soutenue par la Fondation Jane et Aatos Erkko.

Ce protocole implique l’utilisation d’animaux et toutes les procédures ont été approuvées par les comités d’éthique sur l’utilisation et le soin des animaux et l’animalerie de l’Université d’Helsinki.
1. Préparation du plat de culture d’organes
<ol><li>Effectuer toutes les procédures dans une hotte à flux laminaire. Nettoyez les surfaces de travail avec 70 % d’éthanol et utilisez des instruments et des solutions en verre autoclavé. Stérilisez les ciseaux et autres équipements métalliques dans un stérilisateur à billes de verre.</li>
	<li>Préparer les filtres normalement stockés dans de l’éthanol à 70 % en les lavant trois fois dans 1x PBS pour éliminer l’éthanol (figure 1). Couper les filtres en morceaux rectangulaires (3 x 3-5 x 5 mm). REMARQUE: Les morceaux filtrants lavés peuvent être stockés pendant plusieurs jours dans 1x PBS à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer le milieu de culture (DMEM:F12 1:1 supplémenté avec 1 % [v/v] 200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide dans 0,85 % de NaCl, 10 % [v/v] FBS, 150 μg/mL d’acide ascorbique et 0,2 % [v/v] de pénicilline [10 000 UI/mL] et de streptomycine [10 000 μg/mL]). Conserver à 4 °C.</li>
	<li>Placez les grilles métalliques de 30 mm (avec des trous de 1 à 2 mm de diamètre qui permettent l’imagerie tissulaire) dans une boîte de Petri de 35 mm. Ajoutez suffisamment de média pour atteindre la surface du réseau sans produire de bulles d’air. Préchauffer la capsule de culture préparée à 37 °C jusqu’à ce que le tissu soit isolé et prêt pour la culture (dans un incubateur standard avec 5% de CO2 et 90% - 95% d’humidité).</li>
</ol>2. Dissection incisive et isolement de l’extrémité proximale
<ol><li>Sacrifiez les animaux en suivant un protocole de soins aux animaux approuvé.</li>
	<li>Décapitaisez la souris et disséquez la mandibule. Pour ce faire, retirez d’abord la peau pour exposer la mandibule et coupez à travers les muscles masséters pour la séparer du maxillaire et du reste de la tête.</li>
	<li>Une fois la mandibule isolée, retirez la langue et autant de tissus mous que possible.</li>
	<li>Rassemblez toutes les mandibules et conservez-les dans une boîte de Petri contenant du PBS sur de la glace, car cela améliore la viabilité des tissus.</li>
	<li>Transférer une mandibule dans une boîte de Petri en verre et utiliser des aiguilles hypodermiques jetables de 20/26 G pour disséquer l’incisive au stéréomicroscope. Fendez la mandibule à la ligne médiane, coupant à travers la symphyse. Nettoyez le tissu mou et musculaire loin de la surface osseuse pour une meilleure visualisation. REMARQUE: Une boîte de Petri en verre est essentielle, car cela n’émoussera pas les aiguilles.</li>
	<li>Les mandibules obtenues à partir d’animaux de moins de 10 jours sont plus molles et plus fragiles, par conséquent, utilisez des aiguilles hypodermiques jetables de 20/26 G pour ouvrir chaque moitié de la mandibule longitudinalement afin d’exposer la dent incisive. Pour les souris de plus de 10 jours, utilisez une pince à épiler pour saisir la mandibule et casser l’os pour exposer la dent.</li>
	<li>Détachez doucement l’incisive de l’os environnant et coupez l’extrémité proximale, qui contient la boucle cervicale.</li>
	<li>Couper l’extrémité proximale et enlever l’émail minéralisé et la matrice dentine.</li>
	<li>Conservez les extrémités proximales collectées dans le PBS de Dulbecco sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la culture.</li>
</ol>3. La culture
<ol><li>Placez soigneusement un rectangle filtrant sur le dessus d’une grille dans un plat de culture préchauffé.</li>
	<li>Utilisez un stéréomicroscope pour bien orienter les morceaux de tissu.</li>
	<li>Placer dans un incubateur standard à 37 °C avec 5% de CO2 et 90%-95% d’humidité.</li>
	<li>Changez le milieu tous les deux jours et remplacez-le par un milieu frais, en évitant soigneusement la formation de bulles d’air. Surveillez la croissance des tissus et photographiez quotidiennement à l’aide d’une caméra fixée au stéréomicroscope.</li>
</ol>4. Ajout de facteurs solubles à la culture
<ol><li>Compléter le milieu de culture avec des facteurs solubles et des molécules d’intérêt pour étudier leur effet sur la régulation des SC. NOTE: Le protocole d’administration de toute molécule (facteurs de croissance, molécules de signalisation, anticorps bloquants, composés pharmacologiques tels que inhibiteurs ou activateurs, vecteurs, etc.) dépend de sa demi-vie et de sa solubilité. Ces paramètres déterminent également le contrôle approprié à utiliser.</li>
</ol>5. Analyses moléculaires et histologiques
<ol><li>Retirez le milieu de culture.</li>
	<li>Ajoutez soigneusement du méthanol glacé aux tissus pour éviter le détachement des filtres.</li>
	<li>Laisser agir le méthanol pendant 5 min.</li>
	<li>Transférer les filtres transportant les explants de tissus dans des tubes de prélèvement.</li>
	<li>Fixer les explants dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10-24 h à 4 °C.</li>
	<li>Procéder avec les protocoles établis pour le traitement histologique (paraffine, congelé, etc.) ou les immunocolorations.</li>
</ol>6. Culture de tranches de tissu
REMARQUE: Il existe plusieurs variantes de ce protocole, qui sont toutes aussi réussies et sont une question de choix personnel, en fonction de la vitesse et de la compétence de l’utilisateur. Ceux-ci se réfèrent au tampon utilisé pour recueillir et maintenir la viabilité des tissus. À cette fin, le tampon Krebs, le PBS complété par 2% de glucose et d’antibiotiques, ou PBS peuvent être utilisés. Si un tampon Krebs est utilisé, il doit être fabriqué 1 jour à l’avance et maintenu à 4 °C.
<ol><li>Avant l’expérience, préparer de l’agarose à bas point de fusion à 4 % à 5 % en dissolvant 2 à 2,5 g d’agarose à bas point de fusion dans 50 mL de glucose à 2 % bouillant/PBS, après quoi la solution doit être placée dans un bain-marie à 45 °C.</li>
	<li>Installez le vibratome, lavez avec de l’éthanol à 70 % et remplissez de glucose / PBS à 2% glacé complété par des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline, 100 mg / mL de streptomycine).</li>
	<li>Disséquez les extrémités proximales de l’incisive et recueillez-les dans le froid glacé 2% de glucose / PBS supplémenté en antibiotiques.</li>
	<li>Placer une extrémité proximale de l’incisive dans le moule contenant 4% à 5% de bas point de fusion agarose. Sous un stéréomicroscope, orienter la pièce dans la direction souhaitée et laisser sur la glace pour que l’agarose durcisse.</li>
	<li>Coupez le bloc d’agarose durci et placez-le dans le vibratome. Couper des tranches épaisses (150-300 μm).</li>
	<li>Recueillir les tranches dans une boîte de Petri contenant 2% de glucose / PBS glacé complété par des antibiotiques.</li>
	<li>Utiliser une spatule pour transférer les tranches épaisses sur un filtre rectangulaire placé sur la grille préchauffée préparée comme au point 1.3.</li>
	<li>Incuber les tranches épaisses dans l’incubateur et procéder à l’imagerie (Figure 2).</li>
</ol>

<ol><li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li>
<li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li>
<li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li>
<li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
<li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li>
<li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li>
<li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+limits+tooth+number%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li>
<li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li>
<li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues%3A+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li>
<li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li>
<li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La culture d’organes in vitro a été largement utilisée pour étudier le potentiel inductif et les interactions épithélio-mésenchymateuses qui régissent la croissance et la morphogenèse des organes. Le laboratoire de Thesleff a montré comment adapter la modification Saxén de la culture d’organes de type Trowell et l’utiliser pour étudier le développement des dents14. Les conditions reproductibles et les progrès dans les rapporteurs fluorescents en ont fait une méthode utile pour surveiller ...

Les incisives de souris se développent continuellement en raison de la préservation à vie des cellules souches (SC) qui soutiennent la production incessante de composants dentaires. Il s’agit notamment des SC épithéliales, qui génèrent des améloblastes producteurs d’émail, et des cellules souches mésenchymateuses (CSM), qui génèrent des odontoblastes producteurs de dentine, entre autres cellules1. Les SC épithéliaux dans les incisives en croissance continue ont été initialement identifiés comme des cellules retenant le marquage2,3 et il a depuis été démontré qu’ils expriment un certain nombre de gènes souches bien connus, y compris Sox24. Ces cellules partagent des caractéristiques communes avec les SC épithéliaux dans d’autres organes et résident dans la niche SC appelée la boucle cervicale située sur le côté labial de l’incisive. La niche est une entité dynamique composée de cellules et de matrice extracellulaire qui contrôlent l’activité SC5. Des études de traçage de lignée ont démontré que les SC épithéliales Sox2+ peuvent régénérer tout le compartiment épithélial de la dent et qu’ils sont cruciaux pour la formation des dents successives 6,7. Les CSM ayant un potentiel réparateur ou régénérateur de la dentine sont en grande partie recrutées à l’extérieur de l’organe par les vaisseaux sanguins et les nerfs 8,9,10,11, fournissant ainsi un modèle approprié pour étudier le recrutement, la migration et le logement de la population des CSM.
Il n’est pas toujours possible d’étudier les SC in vivo, car de nombreuses manipulations génétiques et/ou pharmacologiques peuvent affecter l’homéostasie des organes et/ou avoir des conséquences mortelles. Par conséquent, la culture d’organes fournit un excellent outil pour étudier la régulation des SC et de leurs niches in vitro. Le système de culture d’organes qui utilise une grille métallique a été initialement développé par Trowell12 pour étudier le développement des organes et a été modifié par Saxen13 pour étudier les signaux inductifs dans le développement des reins. Depuis lors, cette méthode in vitro de culture de tout ou partie de l’organe a été appliquée avec succès dans différents domaines. Dans le domaine du développement dentaire, cette méthode a été largement utilisée pour étudier les interactions épithéliales-mésenchymateuses qui régissent le développement des dents14 et la formation des dents successives15. Les travaux du laboratoire de Thesleff ont démontré l’utilité de ce système pour l’analyse temporelle de la croissance et de la morphogenèse des dents, pour l’analyse de l’effet de diverses molécules et facteurs de croissance sur la croissance des dents, et pour l’imagerie en direct du développement des dentsen accéléré 16,17. Plus récemment, cette méthode a été utilisée pour étudier la régulation des SC incisives et de leur créneau18,19, qui est décrit en détail ici.

<table><tbody><tr><td>Seringues en plastique de</td><td></td><td></td><td></td>1 mL</tr><tr><td>Aiguilles hypodermiques jetables de calibre 20/26</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de Bonn extra fins</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>F-12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS Amérique du Sud (CE)</td><td>LifeTechn.</td><td>10270106</td><td>diviser en aliquotes, stocker à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Stérilisateur à billes de verre, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td><td>Simon Keller Ltd</td><td>4AJ-6285884</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Isopore Polycarb.Filtres, 0,1 um 25 mm de diamètre</td><td>MerckMillipore</td><td>VCTP02500</td><td>Conserver dans 70 % d’éthanol à température ambiante.</td></tr><tr><td>Acide L-Ascobique</td><td>Sigma</td><td>A4544-25g</td><td>dilué 100 mg/ml en MilliQ, filtre strérilisé et divisé en 20&mu ; l aliquotes, stocker à l’obscurité, -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Agarose à faible point de fusion</td><td>TopVision</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>Grilles</td><td></td><td></td> métalliques <td>Disponible dans le commerce, ou fabriquée par vous-même à partir d’un treillis en acier inoxydable (résistant à la corrosion, taille de la maille 0,7 mm). Coupez un disque d’environ 30 mm de diamètre et pliez les bords pour donner une hauteur de 3 mm. Utilisez des clous pour faire des trous.</td></tr><tr><td>Micro pince</td><td>Medicon</td><td>07.60.03</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000U/ml) sol.</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, verre sodocalcique</td><td>DWK Life Sciences</td><td>9170442</td><td></td></tr><tr><td>Pétride 35 mm, avec évent</td><td>Duran</td><td>237554008</td><td></td></tr><tr><td>Pétride 90 mm, sans évent classique</td><td>Thermo Fisher</td><td>101RT/C</td><td></td></tr><tr><td>Petits ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la culture d’organes de type trowell pour étudier la régulation des cellules souches dentaires

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Le développement, la fonction et la régénération des organes dépendent des cellules souches, qui résident dans des espaces anatomiques discrets appelés niches de cellules souches. L’incisive de souris à croissance continue fournit un excellent modèle pour étudier les cellules souches spécifiques aux tissus. Les cellules souches spécifiques du tissu épithélial de l’incisive sont situées à l’extrémité proximale de la dent dans une niche appelée boucle cervicale. Ils fournissent un afflux continu de cellules pour contrebalancer l’abrasion constante de la pointe auto-affûtante de la dent. Un protocole détaillé pour l’isolement et la culture de l’extrémité proximale de l’incisive de souris qui abrite les cellules souches et leur niche est présenté ici. Il s’agit d’un protocole modifié de culture d’organes de type Trowell qui permet la culture in vitro de morceaux de tissus (explants), ainsi que les tranches de tissu épaisses à l’interface liquide/air sur un filtre soutenu par une grille métallique. Le protocole de culture d’organes décrit ici permet des manipulations tissulaires impossibles in vivo et, lorsqu’il est combiné à l’utilisation d’un ou de plusieurs rapporteurs fluorescents, il fournit une plate-forme pour l’identification et le suivi de populations cellulaires discrètes dans les tissus vivants au fil du temps, y compris les cellules souches. Diverses molécules régulatrices et composés pharmacologiques peuvent être testés dans ce système pour leur effet sur les cellules souches et leurs niches. Cela fournit en fin de compte un outil précieux pour étudier la régulation et le maintien des cellules souches.

Les SC épithéliaux résident dans une niche appelée anse cervicale, située à l’extrémité proximale de l’incisive (Figure 3A). Les anses cervicales sont des structures morphologiquement distinctes composées d’épithélium d’émail interne et externe qui enveloppent le réticulum étoilé, un noyau de cellules épithéliales disposées de manière lâche (Figure 3B,C). Il y a deux anses cervicales dans chaque incisive (Figure 3A)...

La méthode de culture d’organes de type Trowell a été utilisée pour démêler les réseaux de signalisation complexes qui régissent le développement des dents et, plus récemment, pour étudier la régulation impliquée dans les cellules souches de l’incisive de souris en croissance continue. Les modèles animaux fluorescents-rapporteurs et les méthodes d’imagerie en direct facilitent les analyses approfondies des cellules souches dentaires et de leur microenvironnement de niche spécifique.

Utilisation de la culture d’organes de type Trowell pour étudier la régulation des cellules souches dentaires

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

La culture d’organes de type Trowell est utilisée pour cultiver des explants de tissus. Ici, nous montrons comment utiliser cette méthode pour étudier les cellules souches dans les dents en croissance continue. Avec cette technique, nous pouvons étudier les cellules souches et leur comportement dans la niche et cribler l’effet de diverses molécules sur la survie et le maintien des cellules souches.Cette méthode peut également être appliquée pour étudier les cellules souches d’autres organes, tels que la peau ou la glande mammaire. Commencez par placer des grilles métalliques de 30 millimètres avec des trous d’un à deux millimètres de diamètre dans une boîte de Petri de 35 millimètres. Remplissez l’endroit avec des médias jusqu’à ce qu’ils atteignent la surface de la grille.Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le tissu soit isolé et prêt à être mis en culture. Après avoir décapité la souris, retirez la peau pour exposer la mandibule et coupez les muscles masséters pour séparer la mandibule du maxillaire et du reste de la tête. Une fois la mandibule isolée, retirez la langue et un maximum de tissus mous.Diviser la mandibule à la ligne médiane en coupant à tra

use-trowell-type-organ-culture-to-study-regulation-dental-stem

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant...

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

L'incisive de la souris en croissance continue fournit un modèle pour l'étude de renouvellement des tissus dentaires à partir de cellules souches épithéliales dentaires (DESCs). Un système solide de façon cohérente et fiable obtention de ces cellules de l'incisive et leur expansion in vitro est rapporté ici.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Les cocultures représentent une méthode précieuse pour étudier les interactions entre les nerfs et les tissus et organes cibles. Les systèmes microfluidiques permettent de co-cultiver des ganglions et des organes ou tissus entiers en développement dans différents milieux de culture, représentant ainsi un outil précieux pour l’étude in vitro de l’interaction entre les neurones et leurs cibles.

Analyse de développement germe dentaire innervation Utilisation de périphériques Co-culture microfluidique

Ce protocole décrit le génie génétique transitoire dentaire des cellules souches extraites du follicule dentaire humaine. La stratégie appliquée modification non viraux peut-être devenir une base pour l’amélioration des produits thérapeutiques des cellules souches.

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

Nous fournissons des protocoles d’évaluation des cellules souches mésenchymateuses isolées de la pulpe dentaire et interactions cellulaires de cancer de la prostate basées sur des méthodes directes et indirectes de co-culture. Moyenne de l’état et les membranes de trans-puits conviennent d’analyser l’activité paracrine indirecte. Ensemencement différemment colorées cellules ensemble est un modèle approprié pour l’interaction cellule-cellule direct.

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Nous décrivons l’isolement, la dispersion et le placage des cellules primaires de pulpe dentaire (DP) avec les neurones trigéminaux (TG) cultivés au-dessus des filtres transwell. Les réponses cellulaires des cellules DP peuvent être analysées avec l’immunofluorescence ou l’analyse d’ARN/protéine. L’immunofluorescence des marqueurs neuronaux avec la microscopie confocale permet l’analyse des réponses de excroissance neurite.

Une méthode de co-culture pour étudier la croissance de la neurite en réponse aux signaux dentaires de paracrine de pulpe

Ce protocole présente une méthode pour la culture et la croissance 3D de cellules de type améloblaste en microgravité afin de maintenir leur forme allongée et polarisée ainsi que l’expression protéique spécifique de l’émail. Les conditions de culture pour la culture de constructions d’ingénierie parodontale et d’organes pulmonaires en microgravité sont également décrites.

Propagation de cellules et d’organes dentaires et respiratoires en microgravité

Nous présentons un protocole pour développer des cultures organoïdes épithéliales à partir de dents humaines. Les organoïdes sont solidement extensibles et récapitulent les cellules souches épithéliales de la dent, y compris leur capacité de différenciation des améloblastes. Le modèle organoïde unique fournit un outil prometteur pour étudier la biologie dentaire humaine (cellules souches) avec des perspectives pour les approches régénératrices des dents.

Établir les organoïdes de la dent humaine comme un outil puissant pour la recherche mécaniste et la thérapie régénérative

Cet article fournit un guide par étapes pour établir une culture primaire de cellules souches de pulpes dentaires à l’aide de la méthode de culture d’explants et la caractérisation de ces cellules basée sur les directives de l’ICSCRT. Les cellules isolées par ce protocole peuvent être considérées comme des cellules souches mésenchymateuses pour d’autres applications.

Culture primaire de cellules souches de la pulpe dentaire

Ce protocole met l’accent sur l’extraction, la culture et la préservation de cellules souches multipotentes de la pulpe dentaire par digestion enzymatique. De plus, il démontre leur potentiel à se différencier en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes, soulignant l’importance de la précision et de la cohérence dans le processus.

Isolement, culture et caractérisation de cellules souches de la pulpe dentaire à partir de dents de lait et permanentes humaines

L’imagerie en direct ex vivo est une technique puissante pour étudier les processus dynamiques des mouvements et des interactions cellulaires dans les tissus vivants. Nous présentons ici un protocole qui met en œuvre la microscopie à deux photons pour suivre en direct les cellules épithéliales dentaires dans des incisives de souris adultes entières en culture.

Utilisation de l’imagerie en direct ex vivo pour étudier les divisions et les mouvements cellulaires au cours du renouvellement dentaire de la souris

Découvrez la culture d'organes de type Trowell pour étudier les cellules souches dentaires dans la souris. Cette méthode permet d'observer et de manipuler les cellules souches épithéliales de la niche cervicale in vitro.

Utilisation de la culture d’organes de type Trowell pour étudier la régulation des cellules souches dentaires

Explorer plus de vidéos