Méthode généralisée de détermination de la composition en acide phénolique soluble libre et de la capacité antioxydante des céréales et des légumineuses

Méthode généralisée pour déterminer la composition en acide phénolique soluble libre et la capacité antioxydante des céréales et des légumineuses. Les grains entiers, y compris les céréales et les légumineuses, constituent une partie substantielle de l’alimentation humaine. Leur pertinence nutritionnelle pour l’homme est reconnue depuis longtemps.

Cependant, plus récemment, leurs avantages antioxydants pour la santé ont été rapportés. Les acides phénoliques présents dans les couches céréalières externes des céréales et le tégument des légumineuses contribuent aux propriétés antioxydantes des grains entiers. Ils piègent les radicaux libres qui causent des dommages oxydatifs aux biomolécules.

Les deux classes d’acides phénoliques présents dans les grains entiers sont les acides hydroxybenzoïques et les acides hydroxycinnamiques. Cette étude fournit une méthode simple pour extraire les acides phénoliques à grains entiers et déterminer leur capacité antioxydante in vitro. Utilisez cinq échantillons de grains entiers pour cette étude, le blé dur, le maïs jaune, le niébé aux yeux noirs, le soja et le haricot rouge.

Pesez avec précision 100 milligrammes de l’échantillon de farine de grains entiers directement dans un tube de microcentrifugation de couleur ambre d’une capacité de deux millilitres. La couleur sombre du tube aide à prévenir l’exposition du mélange à la lumière. Ajouter un millilitre de méthanol aqueux à 80 % à chacun des tubes contenant des exemples.

Vortex brièvement pour mélanger la solution de méthanol et l’échantillon. Soniquer les échantillons pendant 60 minutes pour extraire les composés phénoliques solubles libres. Placez un couvercle sur les échantillons pendant toute la durée de la sonication pour une protection accrue contre la lumière.

Après la sonication, centrifuger les mélanges à 20 000 fois G pendant cinq minutes pour sédimenter les résidus solides, en laissant le surnageant sur le dessus. Des composés phénoliques libres seront présents dans le surnageant après centrifugation. Le surnageant doit être filtré avant d’être injecté dans l’instrument HPLC.

Pour filtrer le surnageant, retirez le piston d’une seringue de 3 mL et fixez un filtre à seringue. Le filtre doit avoir une taille de pore ne dépassant pas 0,22 micromètre. Pipettez environ 0,4 millilitre du surnageant dans le haut de la seringue.

Réinsérez le piston et poussez le liquide à travers le filtre dans un flacon HPLC contenant un insert de flacon. Une fois que l’instrument a été configuré pour exécuter la méthode décrite dans le manuscrit pour l’analyse HPLC, chargez les flacons dans le carrousel pour correspondre à la liste d’échantillons. Obtenez des chromatogrammes HPLC à 320 nanomètres et 280 nanomètres, montrant des pics distincts représentant différents composés phénoliques.

En utilisant des courbes standard appropriées, quantifiez les acides hydroxycinnamiques à 320 nanomètres car ils ont une absorbance maximale à cette longueur d’onde. Par le même principe, quantifier les acides hydroxybenzoïques à 280 nanomètres. Utilisez Trolox, un analogue hydrosoluble de la vitamine E, comme standard pour estimer la capacité antioxydante in vitro des extraits de grains entiers.

Pesez avec précision un milligramme de Trolox dans un tube Falcon. Dissoudre avec quatre millilitres de méthanol aqueux à 50% pour préparer une solution mère d’un millimole par litre, ce qui équivaut à 1000 micromoles par litre. Préparez six concentrations de Trolox de 50, 100, 200, 400, 600 et 800 micromoles par litre pour tracer des courbes standard pour l’estimation de la capacité de piégeage des radicaux DPPH et de la capacité antioxydante équivalente à Trolox, TEAC.

De même, préparez des concentrations de Trolox de 6,25, 12,5, 25 et 50 micromoles par litre pour estimer la capacité d’absorption des radicaux oxygénés, ORAC. Porter le volume total de chaque concentration à 500 microlitres, comme indiqué dans le tableau un. Diluer les extraits d’échantillon avec du méthanol avant l’analyse.

Ici, les extraits de maïs jaune et de niébé ont été dilués deux fois. Les extraits de blé et de haricots rouges ont été dilués cinq fois, tandis que l’extrait de soja a été dilué 10 fois avec du méthanol. Peser 8,23 milligrammes d’ABTS dans un tube de microcentrifugation ambré propre de deux millilitres.

Ensuite, pesez 1,62 milligramme de persulfate de potassium dans un tube de microcentrifugation ambré propre d’une capacité de deux millilitres. Dissoudre chacun des produits chimiques pesés dans un millilitre d’eau distillée par vortex. Il en résulte une solution ABTS de 16 millimolaires et une solution de persulfate de potassium de six millimolaires.

Préparer la solution mère ABTS en mélangeant les solutions ABTS et persulfate de potassium en volumes égaux. La solution passera immédiatement à une couleur sombre. Laisser ce mélange incuber dans l’obscurité pendant 12 à 16 heures.

Diluer la solution mère ABTS 30 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de 200 millimolaires pour former la solution de travail ABTS. Pour ce faire, ajoutez 58 millilitres de PBS de 200 millimolaires à deux millilitres de la solution de travail ABTS. La solution de travail contiendra 0,27 millimolaire ABTS et 0,1 millimolaire de persulfate de potassium.

Pour l’analyse, placez 10 microlitres de chaque extrait dilué dans une microplaque de 96 puits. Ajouter 190 microlitres de solution de travail ABTS à chaque puits et incuber pendant 60 minutes. Mesurer l’absorbance des mélanges réactionnels à 750 nanomètres dans un lecteur de microplaques.

Utilisez les étalons Trolox à des concentrations allant de 100 à 800 micromoles par litre pour tracer une courbe d’étalonnage. Le test antioxydant DPPH nécessite un composé générateur de radicaux, DPPH. Peser 1,2 milligramme de DPPH dans un tube de centrifugeuse vide d’une capacité de 15 millilitres.

Dissoudre le DPPH dans du méthanol pour préparer une solution de 60 micromolaires. Le test DPPH teste la capacité des extraits d’échantillons à piéger les radicaux libres produits par DPPH. Ajouter cinq microlitres d’extrait d’échantillon dans les puits de microplaques.

Ensuite, ajoutez 195 microlitres de solution méthanolique DPPH micromolaire de 60 micromolaires et incubez pendant 60 minutes. Mesurez l’absorbance à 515 nanomètres. Utilisez les étalons Trolox pour tracer une courbe d’étalonnage.

La première figure montre la structure des acides hydroxybenzoïques présents dans les grains entiers. Dans cette étude, l’acide vanillique était le seul acide hydroxybenzoïque identifié. La figure deux montre la structure des acides hydroxycinnamiques présents dans les grains entiers.

Dans la présente étude, les acides p-coumarique, caféique et férulique ont été identifiés dans les échantillons. Le tableau deux montre les acides phénoliques identifiés dans les échantillons. Comme mentionné précédemment, l’acide vanillique était le seul acide hydroxybenzoïque identifié dans les échantillons.

Il a été identifié dans l’extrait de niébé seulement. L’acide caféique de l’acide hydroxycinnamique n’a été identifié que dans le haricot rouge, tandis que l’acide p-coumérique a été identifié dans le maïs jaune, le niébé et le soja. L’acide férulique a été identifié dans tous les échantillons et était l’acide phénolique prédominant dans les échantillons.

La concentration totale des acides phénoliques dans l’ordre du plus grand au plus faible était dans l’ordre du soja, du niébé, du maïs jaune et du haricot rouge ou équivalent, suivi du blé. Le tableau trois a montré la teneur totale en phénols et la capacité antioxydante des échantillons. La capacité antioxydante comprenait la capacité de piégeage des radicaux DPPH, teac, ORAC et la capacité antioxydante totale des échantillons.

La capacité antioxydante totale est la somme des valeurs DPPH, TEAC et ORAC. Semblable au tableau deux, le soja avait la capacité antioxydante totale la plus élevée. Cependant, au lieu du niébé, c’était plutôt le haricot rouge qui avait la deuxième plus grande capacité antioxydante totale, bien que le niébé ait la deuxième teneur totale en acide phénolique la plus élevée.

Cette anomalie est liée aux structures des acides phénoliques individuels et à l’effet antagoniste possible de l’acide hydroxybenzoïque acide vanillique sur les effets antioxydants des acides hydroxycinnamiques dans le niébé. Cette étude a conclu que les grains entiers diffèrent par leur composition en acide phénolique. Parmi les grains entiers étudiés, le soja a la plus grande quantité totale d’acides phénoliques et, par conséquent, la plus grande capacité antioxydante.