Les pipelines de cristallographie automatisés de l’EMBL HTX à Grenoble

Nous décrivons ici comment utiliser les pipelines automatisés de cristallographie macromoléculaire pour l’analyse rapide du complexe ligand-protéine et le criblage de fragments à grande échelle basés sur la technologie CrystalDirect du laboratoire HTX à EMBL Grenoble.

Le laboratoire HTX offre un accès en ligne à des protéines entièrement automatisées à des pipelines structurés qui peuvent être appliqués pour résoudre de nouvelles structures et pour effectuer un criblage de fragments et de legan à plus grande échelle. Grâce à la combinaison de la technologie CrystalDirect pour la collecte automatisée des cristaux et le refroidissement CRI sur le logiciel CRIM, où les scientifiques peuvent contrôler l’ensemble du processus de cristallographie sur Internet. Commencez par ouvrir et vous connecter au système de gestion des informations Crystal Graphic dans un navigateur Web, puis cliquez sur le menu Exemples pour ouvrir une interface avec le projet dans Outils de gestion des échantillons.

Cliquez sur Nouvel exemple et dans la fenêtre d’exemple, entrez les informations demandées, puis cliquez sur Enregistrer et faire une demande. Dans le panneau de demande, sélectionnez le protocole de cristallisation, la température d’incubation, les écrans de cristallisation à utiliser et la date souhaitée pour les expériences qui doivent être compatibles avec le temps requis pour l’expédition de l’échantillon. Utilisez les champs de commentaire pour fournir des indications sur les échantillons qu’il est important que les opérateurs de laboratoire HDX connaissent.

Après soumission, la demande de cristallisation sera validée par l’équipe du laboratoire de cristallisation à haut débit. Une confirmation de la planification de l’expérience sera envoyée par e-mail. À l’arrivée de l’échantillon à l’installation.

Le personnel du laboratoire mettra en place l’expérience, enverra une confirmation de la configuration par e-mail et transférera les plateaux de cristallisation aux imageurs automatisés. Le CRIMS donnera accès à tous les paramètres expérimentaux et suivra les nouvelles séances d’imagerie en temps réel. Lorsque de nouvelles images sont disponibles, des notifications par e-mail sont envoyées automatiquement.

Pour afficher les images des plaques de cristallisation, ouvrez le menu Plaques et accédez à l’exemple. Cliquez sur Afficher pour afficher la dernière session d’imagerie ou cliquez sur le symbole de développer pour sélectionner une autre session d’imagerie et vérifier l’historique des dépôts. Pour filtrer les exemples d’un projet sélectionné.

Cliquez sur la case du projet spécifique. Des fonctions de recherche sont également disponibles pour la plupart des colonnes du tableau. Pour évaluer et noter les résultats des expériences de cristallisation, sélectionnez l’interface de vue de plaque et naviguez à travers les différentes parois des plaques de cristallisation.

Sélectionnez le type d’image et sélectionnez la qualité de l’image ou enregistrez les scores. L’interface de vue fournit également tous les paramètres expérimentaux utilisés pour les expériences de cristallisation, y compris la composition de la solution de cristallisation. Pour concevoir des écrans d’optimisation Crystal en fonction des conditions d’amélioration principales identifiées lors de la sélection initiale, ouvrez le menu Affiner et sélectionnez le sous-menu Écrans.

Sélectionnez le type de plaque, les solutions de stock ou les configurations de gradient qui correspondent le mieux à la conception expérimentale. Il est possible de demander au CRIMS de sortir un fichier directement compatible avec le robot formulateur formulatrix pour pipeter automatiquement les écrans dans la plaque ou de sortir un document imprimable mais les volumes pour une opération manuelle. Une fois que le cristal convient aux expériences de diffraction des rayons X, accédez à l’interface Plate View et utilisez les scores pré-stockés pour sélectionner l’image correspondant à la goutte de cristallisation correcte.

Cliquez sur la récolte de cristaux pour enregistrer un plan de récolte de cristaux automatisé à partir du robot de récolte directe de cristaux. CRIMS enregistrera et stockera automatiquement l’emplacement des cristaux récoltés dans la colonne vertébrale ou les rondelles unitaires. Ensuite, les opérateurs que notre installation retirera les plaques avec les plans de récolte des imageurs et les transférera au robot CrystalDirect.

Une fois la récolte des cristaux terminée, les rondelles contenant les échantillons sont placées dans un CX 100 Dewar ou transférées dans le synchrotron de votre choix. Pour inspecter les échantillons refroidis par cryo, ouvrez le menu Crystal Manager et sélectionnez Cristaux récoltés. Les images du processus de récolte, y compris les images des épingles avec les cristaux récoltés y seront disponibles.

Pour créer des échantillons d’envois pour l’analyse par diffraction des rayons X, ouvrez le menu Expéditions et cliquez sur Créer un envoi pour sélectionner le synchrotron d’intérêt et le numéro de sac. Des commentaires à l’appui de la collecte de données ainsi que des paramètres prédéfinis pour la collecte de données sur des lignes de faisceau entièrement automatisées peuvent également être saisis. Le laboratoire HDX donne également accès à un criblage de fragments à grande échelle entièrement automatisé.

Les ressources CRIMS pour le traitement automatisé des données et l’identification des résultats basées sur le logiciel de phasage mondial, Pipeline Pipe Dream, permettent d’évaluer et de hiérarchiser rapidement les résultats sur des centaines à des milliers d’ensembles de données dans un seul projet. CRIMS communique avec les systèmes de gestion de l’information Synchrotron et récupère des informations sur les expériences de diffraction réelles. Ouvrez le menu Crystal Manager et sélectionnez les données de diffraction des cristaux pour afficher des informations récapitulatives et les résultats du traitement initial des données au synchrotron.

Dans cette analyse représentative, les pipelines de cristallographie automatisés ont été utilisés comme démontré, pour l’identification structurelle de différentes protéines. Comme observé, trois états de confirmation différents d’une protéase d’une bactérie pathogène ont été identifiés en très peu de temps, grâce à la succession rapide de l’optimisation du criblage cristallin et des mesures de diffraction. Ce pipeline a également été récemment appliqué à l’identification de fragments, se liant à la fois à l’actif dans plusieurs sites alacstériques de Trypanosoma brucei.

Farnesyl pyrophosphate synthase une enzyme clé du parasite causant la trypanosomiase humaine africaine. Ce processus minimise le délai entre la croissance et la mesure des cristaux, accélérant ainsi les progrès. Il libère également les scientifiques des opérations complexes telles que la manipulation des cristaux et l’opération de ligne de faisceau rendant la cristallographie, plus accessible aux non-experts.

Cette approche peut contribuer à favoriser la recherche translationnelle et ensuite accélérer le processus de découverte de médicaments. Contribuer au développement de médicaments meilleurs et plus sûrs contre un plus grand nombre de cibles.