Name: Les pipelines de cristallographie automatisés de l’EMBL HTX à Grenoble (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Découvrez les pipelines automatisés de cristallographie macromoléculaire du laboratoire HTX à l'EMBL Grenoble. Cette méthode permet de déterminer des structures protéiques et d'accélérer la recherche médicale par criblage de fragments à distance.

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Nous tenons à remercier le groupe conjoint EMBL-ESRF structural biology Group (JSBG) pour son soutien dans l’utilisation et l’exploitation des lignes de faisceau macromoléculaires ESRF. Nous remercions Matthew Bowler pour son soutien à la collecte de données sur la ligne de faisceau MASSIF-1 de l’ESRF et Thomas Schneider et l’équipe EMBL Hamburg pour leur excellent soutien à la collecte de données au P14 du synchrotron PetraIII (DESY, Hambourg, Allemagne). La moissonneuse-batteuse CrystalDirect est développée en collaboration avec l’équipe Instrumentation de l’EMBL Grenoble. Ce projet a été soutenu par un financement du programme European CommunityH2020 dans le cadre des projets iNEXT (Grant No 653706) et iNEXT Discovery (Grant No 871037) ainsi que de la Région Auvergne-Rhône-Alpes à travers le programme Booster.

REMARQUE: L’accès financé à ces pipelines pour les scientifiques du monde entier est soutenu par une série de programmes de financement. Au moment de la rédaction de ce manuscrit, les demandes d’accès sont acceptées soit par le biais du programme iNEXT Discovery (https://inext-discovery.eu), un réseau européen d’installations visant à stimuler la biologie structurale translationnelle20 financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne, soit par INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Contactez l’auteur correspondant pour les modalités et les itinéraires actuels pour l’accès financé à un moment donné. Ce protocole décrit le fonctionnement du pipeline protéine-structure et comprend des étapes communes à tous nos pipelines, tandis que les spécificités des deux autres pipelines sont discutées dans la section suivante. Les instructions ici se réfèrent à CRIMS V4.0.
1. Laboratoire de cristallisation à haut débit
<ol><li>Avant de commencer, demandez à vous inscrire au laboratoire HTX via le système CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. Les informations d’identification de l’utilisateur fournissent un accès à distance à toutes les interfaces de conception et d’évaluation expérimentales.<ol>
<li>Connectez-vous à CRIMS via un navigateur Web (Firefox, Chrome et Safari sont pris en charge). Le serveur Web CRIMs est crypté pour empêcher des tiers d’accéder aux données pendant qu’il se déplace sur le Web. Une fois dans CRIMS, une série de menus à gauche du criblage aident à gérer et à créer des échantillons, à demander des expériences de cristallisation, à gérer et à visualiser des plaques, etc. Une série de tutoriels vidéo sont disponibles sur https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d. REMARQUE: Les utilisateurs qui envoient des échantillons par courrier doivent enregistrer les échantillons et les expériences de cristallisation demandées via CRIMS avant d’envoyer l’échantillon pour s’assurer qu’ils peuvent être traités sans délai à l’arrivée. Veuillez envoyer les détails de l’envoi à htx@embl.fr.</li>
	</ol></li>
	<li>Connectez-vous à CRIMS (https://htxlab.embl.fr ) avec un navigateur Web et cliquez sur le menu Exemples. Cela ouvrira une interface avec les outils de gestion de projet et d’échantillons.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Nouvel échantillon et fournissez les informations demandées. CRIMS permet d’organiser des échantillons sous différents projets, cibles et constructions. Affectez l’échantillon à des échantillons existants ou créez-en de nouveaux à ce stade.</li>
	<li>Une fois les informations demandées saisies, cliquez sur Enregistrer et faire une demande. Sélectionnez le protocole de cristallisation, les écrans de cristallisation à utiliser, la température d’incubation et la date souhaitée pour les expériences.<ol>
<li>Utilisez les champs de commentaire pour fournir des indications sur les échantillons qu’il est important que les opérateurs de laboratoire HTX connaissent. Des écrans personnalisés peuvent également être sélectionnés (voir ci-dessous). Après avoir soumis la demande de cristallisation, elle sera validée par l’équipe du laboratoire HTX et la confirmation de la planification des expériences sera envoyée par e-mail. Assurez-vous de sélectionner des dates d’expérience compatibles avec les heures requises pour l’expédition des échantillons.</li>
	</ol></li>
	<li>Une fois les échantillons arrivés dans l’installation, les opérateurs du laboratoire HTX effectueront les expériences comme demandé. Une fois les expériences de cristallisation mises en place, la confirmation sera envoyée par e-mail et les plateaux de cristallisation seront transférés aux imageurs automatisés. CRIMS donne accès à tous les paramètres expérimentaux et suivra automatiquement les nouvelles sessions d’imagerie. Des notifications par e-mail seront automatiquement envoyées lorsque de nouvelles images seront disponibles. Une expérience d’évaluation de la qualité de30 échantillons à base de thermofluor basée sur un protocole élaboré à l’installation25,26 est réalisée avec chaque échantillon à ce stade et sera disponible via CRIMS.</li>
	<li>Des images des expériences de cristallisation ainsi que les résultats de l’évaluation de la qualité des échantillons seront disponibles dans le CRIMS peu de temps après la mise en place des plateaux de cristallisation. Cliquez sur le menu Thermofluor et accédez à l’échantillon pour voir les résultats de l’expérience d’évaluation de la qualité de l’échantillon.<ol>
<li>Cliquez sur le menu Plaques pour voir les images des plaques de cristallisation. Accédez à l’exemple et cliquez sur Afficher pour voir la dernière session d’imagerie ou sur le symbole + (développer) pour sélectionner une autre session d’imagerie. Une série d’outils aident à trouver et à naviguer facilement dans les échantillons. Par exemple, cliquer dans une zone de projet en haut des écrans filtre les exemples pour ce projet et les fonctions de recherche sont disponibles pour la plupart des colonnes du tableau.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilisez l’interface plate View pour évaluer et noter les résultats des expériences de cristallisation. Il permet de naviguer à travers les différents puits des plaques de cristallisation, de sélectionner des types d’images (Vis, UV), de sélectionner la résolution de l’image ou d’enregistrer des scores, par exemple. Cette interface fournit également tous les paramètres expérimentaux utilisés pour les expériences de cristallisation, y compris la composition des solutions de cristallisation.</li>
	<li>Cliquez sur le menu Raffinement pour concevoir des écrans d’optimisation des cristaux en fonction des conditions de succès primaires identifiées lors du dépistage initial. Les sous-menu Produits chimiques et Solutions de stock permettent d’enregistrer et de gérer les solutions de cristallisation. Le sous-menu Écrans donne accès à une interface pour concevoir vos propres écrans d’optimisation ou personnalisés.<ol>
<li>Sélectionnez le type de plaque, les solutions de stock ou les configurations de gradient qui correspondent le mieux à la conception expérimentale. Il est possible de demander au CRIMS de sortir un fichier directement compatible avec le Formulator Robot (Formulatrix) pour pipeter automatiquement les écrans dans la plaque ou pour sortir un document imprimable avec les volumes pour une opération manuelle.</li>
	</ol></li>
	<li>Parcourez les étapes 1.2 à 1.8 pour effectuer des expériences d’optimisation des cristaux.</li>
	<li>Une fois que les cristaux adaptés aux expériences de diffraction des rayons X sont identifiés, accédez à l’interface plate View et sélectionnez l’image correspondant à la goutte de cristallisation droite. Les partitions pré-stockées vous aideront à le faire facilement.<ol>
<li>Cliquez sur Crystal Harvesting pour enregistrer un plan de récolte de cristaux automatisé pour le robot de récolte CrystalDirect ou sur Manual Harvesting pour le montage manuel traditionnel de cristaux, si vous utilisez CRIMS dans une installation qui n’est pas équipée de CrystalDirect. Les deux interfaces guideront l’utilisateur tout au long du processus de récolte des cristaux. CRIMS enregistrera et stockera automatiquement l’emplacement des cristaux récoltés dans SPINE ou Unipucks21.</li>
	</ol></li>
	<li>Sélectionnez le menu Crystal Manager dans CRIMS. Cliquez sur le sous-menu Cristaux récoltés pour inspecter les échantillons congelés. Lors de l’utilisation de la moissonneuse CrystalDirect, des images du processus de récolte sont présentées, y compris des images des broches avec les cristaux récoltés.</li>
	<li>Sélectionnez le menu Expéditions pour vous connecter aux synchrotrons ESRF ou Petra III et créer des envois d’échantillons pour l’analyse par diffraction des rayons X. Cliquez sur le bouton Créer un envoi et sélectionnez le synchrotron que vous souhaitez utiliser et le numéro de sac (le mot de passe du sac au synchrotron est nécessaire ici). La prochaine série d’interfaces est utilisée pour sélectionner les pukcs à inclure dans l’envoi. Le système permet de fournir des commentaires pour soutenir la collecte de données et déterminer les paramètres de collecte de données pour les lignes de faisceau automatisées comme MASSIF-1.</li>
	<li>Si la collecte de données est effectuée au laboratoire ESRF ou Petra III HTX, les opérateurs transféreront les échantillons sur la ligne de faisceau, la collecte de données dans d’autres synchrotrons se fera aux frais de l’utilisateur. Il est possible de collecter des données en se rendant au synchrotron, en fonctionnant à distance sur la ligne de faisceau ou à MASSIF-1. Dans ce dernier cas, le processus de collecte des données est entièrement automatisé. Au synchrotron, des interfaces spécifiques dans ISPyB29 permettent aux utilisateurs de récupérer les informations envoyées par le CRIMS et d’y associer des rondelles d’échantillon afin que les résultats de la collecte de données soient automatiquement suivis. Pour les expériences décrites ici, la collecte de données aux synchrotrons était généralement effectuée avec le logiciel MXcube31, tandis que le traitement des données et le raffinement de la structure étaient effectués avec atuoPROC32, Staraninso33,BUSTER 33, Pipedream32,33 et Coot35.</li>
	<li>Une fois que les expériences de collecte de données ont été effectuées, CRIMS récupère des informations récapitulatives ainsi que les résultats du traitement initial des données au synchrotron à partir du système ISPyB29. Allez dans le menu CRIMS Crystal Manager et cliquez sur le sous-menu Crystal Diffraction Data. Toutes les informations et métadonnées concernant la collecte des données de diffraction sont disponibles. Il est également possible de télécharger des données traitées à partir du synchrotron ainsi que des images de diffraction brutes. Affichez plusieurs collections de données ou sélectionnez des jeux de données spécifiques. Les outils de gestion des échantillons permettent de naviguer et de sélectionner des échantillons pour des constructions de projets spécifiques. REMARQUE: Ce pipeline fournit un fonctionnement entièrement automatisé sur Internet, des protéines pures aux résultats de diffraction des rayons X, et peut être exploité avec un ou plusieurs échantillons en même temps. Il peut être appliqué à différents contextes et types de projets en biologie structurale.</li>
</ol>

<ol><li>Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automation of X-ray crystallography.</a> Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).</li>
<li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+towards+effective+methods+in+exploiting+high-throughput+technologies+for+the+determination+of+human+protein+structures+of+high+biomedical+value%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).</li>
<li>Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+structural+biology+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Large-scale structural biology of the human proteome.</a> Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).</li>
<li>Rupp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TB+structural+genomics+consortium+crystallization+facility%3A+towards+automation+from+protein+to+electron+density%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).</li>
<li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li>
<li>Cusack, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+is+beautiful%3A+protein+micro-crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small is beautiful: protein micro-crystallography.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).</li>
<li>McCarthy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ID30B+%E2%80%93+a+versatile+beamline+for+macromolecular+crystallography+experiments+at+the+ESRF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASSIF-1%3A+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li>
<li>von Stetten, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ID30A-3+%28MASSIF-3%29+%E2%80%93+a+beamline+for+macromolecular+crystallography+at+the+ESRF+with+a+small+intense+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).</li>
<li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+experiences+with+semi-autonomous+robotic+harvesting+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).</li>
<li>Khajepour, M. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REACH%3A+Robotic+Equipment+for+Automated+Crystal+Harvesting+using+a+six-axis+robot+arm+and+a+micro-gripper%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWagner%2C+A+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22">Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography</a>. 69, 1297-1302 (2006).</li>
<li>Collins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentle%2C+fast+and+effective+crystal+soaking+by+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica%22%5BJournal%5D)">Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing.</a> Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).</li>
<li>Deller, M. C., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+automated+protein+crystal+harvesting%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica%22%5BJournal%5D)">Approaches to automated protein crystal harvesting.</a> Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).</li>
<li>Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirect%3A+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).</li>
<li>Márquez, J. A., Cipriani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirectTM%3A+A+Novel+Approach+for+Automated+Crystal+Harvesting+Based+on+Photoablation+of+Thin+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Genomics%22%5BJournal%5D)">CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films.</a> Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li>
<li>Cianci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P13%2C+the+EMBL+macromolecular+crystallography+beamline+at+the+low-emittance+PETRA+III+ring+for+high-+and+low-energy+phasing+with+variable+beam+focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li>
<li>iNEXT Consortium . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNEXT%3A+a+European+facility+network+to+stimulate+translational+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology.</a> FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).</li>
<li>Papp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+compact+and+precise+sample+holder+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).</li>
<li>Whittle, P. J., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Structure-Based+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Protein Structure-Based drug design.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).</li>
<li>Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallography+for+lead+discovery+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallography for lead discovery in drug design.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).</li>
<li>Krojer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+XChemExplorer+graphical+workflow+tool+for+routine+or+large-scale+protein%E2%80%93ligand+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica%22%5BJournal%5D)">The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination.</a> Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).</li>
<li>Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Crystallization+Likelihood+Through+a+Fluorimetric+Thermal+Stability+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Genomics%22%5BJournal%5D)">Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay.</a> Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).</li>
<li>Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermal+stability+assay+can+help+to+estimate+the+crystallization+likelihood+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).</li>
<li>Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDimasi%2C+N+%22Acta+Crystallographica%22">Acta Crystallographica</a>. F63, 204-208 (2007).</li>
<li>Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiraki%2C+M+%22RFID+tag+system+for+sample+tracking+at+structural+biology+beamlines%22">RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines</a>. , 060074(2019).</li>
<li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB%3A+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>Ericsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MxCuBE%3A+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).</li>
<li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li>
<li>Smart, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+structure+similarity+in+refinement%3A+automated+NCS+and+target-structure+restraints+in+BUSTER%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).</li>
<li>Bezerra, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+protease+uses+distinct+thermodynamic+signatures+for+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2848(2017).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).</li>
<li>Bezerra, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+protease+uses+distinct+thermodynamic+signatures+for+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2848(2017).</li>
<li>Martin-Malpartida, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+genome+wide+recognition+of+5-bp+GC+motifs+by+SMAD+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors.</a> Nature Communications. 8 (1), 2070(2017).</li>
<li>Aragón, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+distinct+roles+of+SMAD2+and+SMAD3+in+FOXH1+pioneer-directed+TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling.</a> Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).</li>
<li>Münzker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment%E2%80%90Based+Discovery+of+Non%E2%80%90bisphosphonate+Binders+of+Trypanosoma+brucei+Farnesyl+Pyrophosphate+Synthase%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase.</a> ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).</li>
</ol>

JAM est co-auteur d’un brevet sur le système CrystalDirect

Les pipelines de cristallographie automatisés décrits ici sont disponibles pour les chercheurs du monde entier par le biais de différents programmes de financement. Actuellement, l’accès financé pour les expériences de cristallisation et la technologie CrystalDirect peut être obtenu en postulant au programme iNEXT Discovery et à INSTRUCT-ERIC, tandis que l’accès aux lignes de faisceau de cristallographie macromoléculaire à l’ESRF est pris en charge par le programme d’accès utilisateur ESRF. Cette approche minimise le délai entre la croissance et la mesure des cristaux, accélérant la progression de projets très difficiles qui nécessitent une optimisation basée sur la diffraction de la production de protéines et des conditions de cristallisation et libère les scientifiques des opérations complexes associées à la cristallisation, à la manipulation des cristaux et au fonctionnement de la ligne de faisceau, rendant la cristallographie plus accessible aux groupes non experts. Il peut également être utilisé pour l’exploration rapide d’additifs de cristallisation, d’agents de phasage ou pour le criblage de composés par le biais d’expériences de co-cristallisation. Bien que la plupart des projets de cristallographie puissent bénéficier de cette approche, certains échantillons peuvent nécessiter des protocoles spéciaux qui ne se prêtent pas à l’automatisation ou aux pipelines présentés ici, par exemple ceux qui nécessitent des systèmes microfluidiques ou des dispositifs de cristallisation hautement spécialisés ou des échantillons extrêmement labiles et qui ne toléreraient pas l’expédition.
La technologie CrystalDirect permet également le trempage automatisé des cristaux17 pour la caractérisation de complexes petites molécules-cibles. Pour cela, une petite ouverture est créée avec le laser avant le processus de récolte et une goutte d’une solution contenant les produits chimiques souhaités (c’est-à-dire des agents de phasage ou des ligands potentiels) est ajoutée sur le dessus, de sorte qu’elle entre en contact avec et diffuse dans la solution de cristallisation pour finalement atteindre le cristal. Les solutions chimiques peuvent être formulées dans de l’eau, du DMSO ou d’autres solvants organiques. Après un certain temps d’incubation, les cristaux peuvent être récoltés et analysés par diffraction comme décrit ci-dessus. Cette approche a été appliquée à la caractérisation rapide des complexes ligand-protéine dans le contexte de la conception de médicaments basés sur la structure ainsi qu’au criblage à grande échelle de composés et de fragments. Dans ce dernier cas, les bibliothèques de fragments avec des centaines à plus d’un millier de fragments peuvent être analysées rapidement. Les interfaces CRIMS spécifiques non présentées ici facilitent la conception et le suivi automatisé des expériences de trempage de cristaux, tandis que l’intégration entre le logiciel CRIMS et la suite logicielle Pipedream, développée par Global Phasing Ltd (Royaume-Uni), permet le traitement automatisé des données, le phasage, l’identification des ligands et le raffinement de la structure sur des centaines d’ensembles de données en parallèle, rationalisant l’analyse et l’interprétation des données32,33 . Par exemple, ce pipeline a récemment été appliqué à l’identification de fragments se liant à la fois au site actif et à plusieurs sites allostériques de Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphate synthase, une enzyme clé du parasite causant la trypanosomiase humaine africaine.
Les pipelines présentés ici peuvent contribuer à accélérer le rythme des découvertes en biologie structurale et à rendre la cristallographie macromoléculaire plus accessible à un plus grand nombre de groupes de recherche. De plus, en facilitant le criblage à grande échelle des composés et des fragments, ils peuvent contribuer à favoriser la recherche translationnelle et à accélérer le processus de découverte de médicaments, contribuant ainsi à faciliter le développement de médicaments meilleurs et plus sûrs contre un plus grand nombre de cibles.

L’automatisation a été introduite à toutes les étapes du processus expérimental de cristallographie macromoléculaire, de la cristallisation à la collecte et au traitement des données de diffraction1,2,3,4,5,6,7,8,9, y compris un certain nombre de technologies pour le montage d’échantillons10,11,12 ,13,14,15,16,17. Cela a non seulement accéléré le rythme auquel les structures cristallographiques sont obtenues, mais a également contribué à rationaliser des applications telles que la conception de médicaments guidés par la structure18,19,20, 21,22,23,24. Dans ce manuscrit, nous décrivons certains aspects des pipelines de cristallographie automatisés disponibles au laboratoire HTX de Grenoble ainsi que les technologies sous-jacentes.
Le laboratoire HTX de l’EMBL Grenoble est l’un des plus grands établissements académiques de dépistage de la cristallisation en Europe. Il est co-localisé sur le campus européen de photons et de neutrons (EPN) avec l’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), qui produit certains des faisceaux de rayons X les plus brillants au monde et l’Institut Laue Langevin (ILL), qui fournit des faisceaux de neutrons à haut flux. Depuis le début des opérations en 2003, le laboratoire HTX a fourni des services à plus de 800 scientifiques et traite plus de 1000 échantillons par an. Le laboratoire HTX se concentre fortement sur le développement de nouvelles méthodes de cristallographie macromoléculaire, y compris les méthodes d’évaluation des échantillons et de contrôle de la qualité25,26 et la technologie CrystalDirect, permettant un montage et un traitement entièrement automatisés des cristaux15,16,17. Le laboratoire HTX a également développé le système de gestion de l’information cristallographique (CRIMS), un système d’information de laboratoire basé sur le Web qui fournit une communication automatisée entre les installations de cristallisation et de collecte de données synchrotron, permettant un flux d’informations ininterrompu sur l’ensemble du cycle de l’échantillon, des protéines pures aux données de diffraction. Grâce à la combinaison des capacités de l’installation HTX, de la technologie CrystalDirect et du logiciel CRIMS, nous avons développé des pipelines protéine-structure entièrement automatisés intégrant le criblage par cristallisation, l’optimisation des cristaux, le traitement automatisé de la récolte des cristaux et la cryofusion et la collecte de données radiographiques dans plusieurs synchrotrons dans un flux de travail unique et continu qui peut être exploité à distance via un navigateur Web. Ces pipelines peuvent être appliqués pour soutenir la détermination rapide de nouvelles structures, la caractérisation de complexes protéine-ligand et le criblage de composés et de fragments à grande échelle par cristallographie aux rayons X.
Le laboratoire HTX est équipé d’un robot de cristallisation sans volume (y compris un module LCP qui permet la cristallisation des protéines solubles et membranaires), de fermes de cristaux (à 5 °C et 20 °C), de deux stations robotisées de manipulation des liquides pour préparer des écrans de cristallisation et de deux moissonneuses-batteuses de cristaux CrystalDirect automatisées capables de produire et de stocker jusqu’à 400 broches d’échantillon congelées par cycle d’opération. Les scientifiques envoient leurs échantillons à l’installation par courrier express, qui sont ensuite traités par des techniciens dédiés au laboratoire HTX. Les scientifiques peuvent concevoir à distance des expériences de criblage et d’optimisation de la cristallisation via une interface Web fournie par le système CRIMS. Grâce à cette interface, ils peuvent choisir parmi un large éventail de paramètres et de protocoles expérimentaux disponibles dans l’installation pour répondre à leurs besoins spécifiques en matière d’échantillons. Les résultats ainsi que tous les paramètres expérimentaux sont mis à la disposition des utilisateurs en temps réel via CRIMS. Tous les échantillons reçus sont analysés par une méthode spécifiquement développée qui permet d’estimer la probabilité de cristallisation de l’échantillon25,26,27. Sur la base des résultats de ce test, des recommandations spécifiques sont faites aux utilisateurs concernant la température d’incubation optimale et les expériences d’optimisation d’échantillon possibles. Une fois les expériences de cristallisation mises en place, les scientifiques peuvent évaluer les résultats en regardant les images de cristallisation collectées à différents points temporels sur le Web. Lorsque des cristaux adaptés aux expériences de diffraction des rayons X sont identifiés, les scientifiques peuvent utiliser une interface dédiée pour établir un plan de montage des cristaux qui sera ensuite exécuté par le robot CrystalDirect.
La technologie CrystalDirect est basée sur l’utilisation d’une microplaque de cristallisation par diffusion de vapeur modifiée et d’un faisceau laser pour monter et cryo-refroidir des échantillons de cristaux dans des supports compatibles avec la diffraction, comblant l’écart d’automatisation existant entre la cristallisation et la collecte de données15,16,17. En bref, les cristaux sont cultivés dans une plaque de diffusion de vapeur modifiée, la microplaque CrystalDirect. Une fois que les cristaux apparaissent, le robot de récolte CrystalDirect applique automatiquement un faisceau laser pour exciser une pièce de film contenant le cristal, l’attacher à une broche de collecte de données de diffraction standard et le cryo-refroidir dans un flux d’azote gazeux (voir Zander et al. 2016 et https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Cette technologie présente un certain nombre d’avantages supplémentaires par rapport aux protocoles de montage de cristaux manuels ou semi-automatisés. Par exemple, la taille et la forme des cristaux ne sont pas un problème, ce qui rend tout aussi facile la récolte de gros cristaux ou de microcristaux, il est souvent possible d’éviter l’utilisation de cryo-protégeants, en raison de la façon particulière dont la technologie fonctionne (voir référence 17, Zander et al.), ce qui rend l’analyse par diffraction des rayons X beaucoup plus simple. Le faisceau laser peut également être utilisé comme outil chirurgical pour sélectionner les meilleures parties d’un échantillon lorsque les cristaux se développent sur des grappes ou montrent une croissance épitaxiale par exemple. La technologie CrystalDirect peut également être utilisée pour des expériences de trempage automatisées17. Livraison de solutions avec de petites molécules ou d’autres produits chimiques aux cristaux. Il permet ainsi de prendre en charge le criblage entièrement automatisé et à grande échelle des composés et des fragments. Une fois que les cristaux sont récoltés et cryorefroidis par le robot CrystalDirect, ils sont transférés vers des rondelles SPINE ou Unipuck qui sont compatibles avec la plupart des lignes de faisceau de cristallographie macromoléculaire synchronisée dans le monde. Le système peut récolter jusqu’à 400 broches (la capacité du stockage cryogénique Dewar) de manière totalement autonome. CRIMS communique avec le robot de récolte pendant le processus et fournit un suivi automatisé des échantillons de cristaux (rondelles et épingles). Les rondelles sont marquées avec des codes-barres et des étiquettes RFID pour faciliter la gestion deséchantillons21,28.
CRIMS fournit une interface de programme d’application (API) prenant en charge la communication automatisée avec le système ISPyB prenant en charge la gestion et le traitement de la collecte et du traitement des données radiographiques dans de nombreux synchrotrons en Europe et dans le monde29. Une fois la récolte automatisée des cristaux terminée, les scientifiques peuvent sélectionner des échantillons de cristaux (rondelles) et créer des envois d’échantillons pour les lignes de faisceau de cristallographie macromoléculaire aux synchrotrons ESRF (Grenoble, France)7,8,9 ou Petra III (Hambourg, Allemagne)18,19. CRIMS transfère les données correspondant aux échantillons de ligne de faisceau sélectionnés vers le système d’information synchrotron avec des paramètres de collecte de données présélectionnés. Une fois que les échantillons arrivent à la ligne de faisceau synchrotron sélectionnée, la collecte de données de rayons X est effectuée manuellement, par le biais d’un fonctionnement à distance de la ligne de faisceau ou de manière entièrement automatisée (c’est-à-dire à la ligne de faisceau MASSIF-1 del’ESRF 8 exploitée par le groupe conjoint embL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Après la collecte des données, le CRIMS récupère automatiquement les informations sur les résultats de la collecte des données ainsi que les résultats initiaux du traitement des données effectué par les systèmes de traitement des données synchrotron et les présente au scientifique via une interface utilisateur pratique.
Le laboratoire HTX applique ces pipelines automatisés pour prendre en charge trois applications différentes, la détermination rapide de nouvelles structures, la caractérisation rapide des complexes protéine-ligand et le criblage à grande échelle de composés et de fragments. Ci-dessous, nous décrivons comment les utiliser et les utiliser.

<table><tbody><tr><td>Récolteuse CrystalDirect</td><td>Arinax</td><td></td><td>Montage automatisé des cristaux et cryorefroidissement</td></tr><tr><td>CrystalDirect Plaque de cristallisation</td><td>Mitegen</td><td>UGS : M-XDIR-96-2</td><td>Microplaque de cristallisation à 96 puits</td></tr><tr><td>Formulator 16</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Pour la préparation automatique des tamis de cristallisation</td></tr><tr><td>Robot de cristallisation Mosquito SPT</td><td>Labtech</td><td></td><td>Pour la préparation d’expériences de cristallisation</td></tr><tr><td>Tecan Evo Station de manipulation de liquides</td><td>Tecan</td><td></td><td>Pour la préparation de solutions de cristallisation</td></tr><tr><td>Rondelles épineuses</td><td>Mitegen</td><td>UGS : M-SP-SC3-1</td><td>Rondelles cryogéniques compatibles SPINE pour échangeurs d’échantillons synchrotron automatisés</td></tr><tr><td>UniPucks</td><td>Mitegen</td><td>UGS : M-CP-111-021</td><td>Rondelles cryogéniques universelles pour échangeurs d’échantillons synchrotron automatisés</td></tr></tbody></table>

les pipelines de cristallographie automatisés de l’embl htx à grenoble

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

EMBL Grenoble exploite le Laboratoire de cristallisation à haut débit (HTX Lab), une installation utilisateur à grande échelle offrant des services de cristallographie à haut débit aux utilisateurs du monde entier. Le laboratoire HTX se concentre fortement sur le développement de nouvelles méthodes de cristallographie macromoléculaire. Grâce à la combinaison d’une plate-forme de cristallisation à haut débit, de la technologie CrystalDirect pour le montage et le cryorefroidissement entièrement automatisés des cristaux et du logiciel CRIMS, nous avons développé des pipelines entièrement automatisés pour la cristallographie macromoléculaire qui peuvent être commandés à distance sur Internet. Il s’agit notamment d’un pipeline protéine-structure pour la détermination de nouvelles structures, d’un pipeline pour la caractérisation rapide des complexes protéine-ligand à l’appui de la chimie médicinale et d’un pipeline de criblage de fragments automatisé à grande échelle permettant l’évaluation de bibliothèques de plus de 1000 fragments. Nous décrivons ici comment accéder à ces ressources et les utiliser.

Le pipeline de cristallographie automatisé décrit ci-dessus a été appliqué pour soutenir un grand nombre de projets internes et externes avec un succès remarquable. Parmi les points forts, citons le projet de Djinović-Carugo et de ses collègues des laboratoires Max Perutz (Vienne) axé sur l’analyse structurelle et fonctionnelle d’une dipeptidyl peptidase essentielle à la croissance d’un pathogène bactérien. La succession rapide des cycles de criblage de cristallisation, d’évaluation par diffraction, d’optimisation des cristaux et de collecte de données de rayons X (jusqu’à 8 itérations pour ce projet) a permis d’obtenir des modèles structurels pour trois états conformationnels différents de la protéine en quelques semaines seulement, ce qui a fourni une compréhension mécaniste clé sur la fonction de cette classe de protéines36 (voir Figure 1).
Un autre exemple est celui de Macias et de ses collègues de l’Institut de recherche biomédicale (IRB, Barcelone) qui ont combiné des outils bioinformatiques et des approches structurelles pour identifier de nouveaux motifs de liaison à l’ADN pour les facteurs de transcription SMAD3 et SMAD4 impliqués dans la régulation du devenir cellulaire. Ce travail a produit 6 structures à haute résolution de SMAD3 &amp; 4 en complexe avec différents motifs de liaison à l’ADN37,38 révélant une capacité jusqu’à présent insoupçonnée de ces facteurs de transcription à reconnaître et à se lier à un large éventail de séquences d’ADN, ce qui est essentiel pour l’interprétation de leur fonction dans différents contextes biologiques. Ces technologies ont également été appliquées pour soutenir la recherche exclusive dans le contexte de projets de conception de médicaments de groupes de recherche dans des sociétés pharmaceutiques et biotechnologiques. Par exemple, grâce à la rapidité apportée par ces pipelines, l’analyse structurelle de plusieurs complexes ligand-cibles peut être réalisée en quelques jours, ce qui est d’une grande valeur pour soutenir l’optimisation de la chimie médicinale successive dans le contexte du développement de médicaments. Enfin, nous avons également appliqué cette infrastructure pour le criblage de fragments à grande échelle basé sur les rayons X39.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62491/62491fig01.jpg"> Figure 1: Pipeline de cristallographie automatisé. Le fonctionnement intégré du laboratoire EMBL HTX, y compris la technologie CrystalDirect et le logiciel CRIMS avec la ligne de faisceau MASSIF-1 à l’ESRF et la communication automatisée entre le logiciel CRIMS et ISPyB, permettent de prendre en charge un pipeline protéine-structure entièrement automatisé et télécommandé intégrant le criblage et l’optimisation de la cristallisation, la récolte et le cryo-refroidissement automatisés et la collecte et le traitement automatisés des données. Les modèles structuraux correspondent à trois états conformationnels différents d’une protéase à partir d’une bactérie pathogène identifiée en un temps record en appliquant cespipelines 36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62491/62491fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous décrivons ici comment utiliser les pipelines automatisés de cristallographie macromoléculaire pour l’analyse rapide du complexe ligand-protéine et le criblage de fragments à grande échelle basés sur la technologie CrystalDirect du laboratoire HTX à EMBL Grenoble.

Les pipelines de cristallographie automatisés de l’EMBL HTX à Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

Le laboratoire HTX offre un accès en ligne à des protéines entièrement automatisées à des pipelines structurés qui peuvent être appliqués pour résoudre de nouvelles structures et pour effectuer un criblage de fragments et de legan à plus grande échelle. Grâce à la combinaison de la technologie CrystalDirect pour la collecte automatisée des cristaux et le refroidissement CRI sur le logiciel CRIM, où les scientifiques peuvent contrôler l’ensemble du processus de cristallographie sur Internet. Commencez par ouvrir et vous connecter au système de gestion des informations Crystal Graphic dans un navigateur Web, puis cliquez sur le menu Exemples pour ouvrir une interface avec le projet dans Outils de gestion des échantillons.Cliquez sur Nouvel exemple et dans la fenêtre d’exemple, entrez les informations demandées, puis cliquez sur Enregistrer et faire une demande. Dans le panneau de demande, sélectionnez le protocole de cristallisation, la température d’incubation, les écrans de cristallisation à utiliser et la date souhaitée pour les expériences qui doivent être compatibles avec le temps requis pour l’expédition de l’échantillon. Utilisez les champs de commentaire pour fournir des indications sur les échantillons qu’il est important que les opérateurs de laboratoire HDX connaissent.Après soumission, la demande de cristallisation sera validée par l’équipe du laboratoire de cristallisation à haut débit. Une confirmation de la planification de l’expérience sera envoyée par e-mail. À l’arrivée de l’échantillon à l’installation.Le personnel du laboratoire mettra en place l’expérience, enverra une confirmation de la configuration par e-mail et transférera les plateaux de cristallisation aux imageurs automatisés. Le CRIMS donnera accès à tous les paramètres expérimentaux et suivra les nouvelles séances d’imagerie en temps réel. Lorsque de nouvelles images sont disponibles, des notifications par e-mail sont envoyées automatiquement.Pour afficher les images des plaques de cristallisation, ouvrez le menu Plaques et accédez à l’exemple. Cliquez sur Afficher pour afficher la dernière session d’imagerie ou cliquez sur le symbole de développer pour sélectionner une autre session d’imagerie et vérifier l’historique des dépôts. Pour filtrer les exemples d’un projet sélectionné.Cliquez sur la case du projet spécifique. Des fonctions de recherche sont également disponibles pour la plupart des colonnes du tableau. Pour évaluer et noter les résultats des expériences de cristallisation, sélectionnez l’interface de vue de plaque et naviguez à travers les différentes parois des plaques de cristallisation.Sélectionnez le type d’image et sélectionnez la qualité de l’image ou enregistrez les scores. L’interface de vue fournit également tous les paramètres expérimentaux utilisés pour les expériences de cristallisation, y compris la composition de la solution de cristallisation. Pour concevoir des écrans d’optimisation Crystal en fonction des conditions d’amélioration principales identifiées lors de la sélection initiale, ouvrez le menu Affiner et sélectionnez le sous-menu Écrans.Sélectionnez le type de plaque, les solutions de stock ou les configurations de gradient qui correspondent le mieux à la conception expérimentale. Il est possible de demander au CRIMS de sortir un fichier directement compatible avec le robot formulateur formulatrix pour pipeter automatiquement les écrans dans la plaque ou de sortir un document imprimable mais les volumes pour une opération manuelle. Une fois que le cristal convient aux expériences de diffraction des rayons X, accédez à l’interface Plate View et utilisez les scores pré-stockés pour sélectionner l’image correspondant à la goutte de cristallisation correcte.Cliquez sur la récolte de cristaux pour enregistrer un plan de récolte de cristaux automatisé à partir du robot de récolte directe de cristaux. CRIMS enregistrera et stockera automatiquement l’emplacement des cristaux récoltés dans la colonne vertébrale ou les rondelles unitaires. Ensuite, les opérateurs que notre installation retirera les plaques avec les plans de récolte des imageurs et les transférera au robot CrystalDirect.Une fois la récolte des cristaux terminée, les rondelles contenant les échantillons sont placées dans un CX 100 Dewar ou transférées dans le synchrotron de votre choix. Pour inspecter les échantillons refroidis par cryo, ouvrez le menu Crystal Manager et sélectionnez Cristaux récoltés. Les images du processus de récolte, y compris les images des épingles avec les cristaux récoltés y seront disponibles.Pour créer des échantillons d’envois pour l’analyse par diffraction des rayons X, ouvrez le menu Expéditions et cliquez sur Créer un envoi pour sélectionner le synchrotron d’intérêt et le numéro de sac. Des commentaires à l’appui de la collecte de données ainsi que des paramètres prédéfinis pour la collecte de données sur des lignes de faisceau entièrement automatisées peuvent également être saisis. Le laboratoire HDX donne également accès à un criblage de fragments à grande échelle entièrement automatisé.Les ressources CRIMS pour le traitement automatisé des données et l’identification des résultats basées sur le logiciel de phasage mondial, Pipeline Pipe Dream, permettent d’évaluer et de hiérarchiser rapidement les résultats sur des centaines à des milliers d’ensembles de données dans un seul projet. CRIMS communique avec les systèmes de gestion de l’information Synchrotron et récupère des informations sur les expériences de diffraction réelles. Ouvrez le menu Crystal Manager et sélectionnez les données de diffraction des cristaux pour afficher des informations récapitulatives et les résultats du traitement initial des données au synchrotron.Dans cette analyse représentative, les pipelines de cristallographie automatisés ont été utilisés comme démontré, pour l’identification structurelle de différentes protéines. Comme observé, trois états de confirmation différents d’une protéase d’une bactérie pathogène ont été identifiés en très peu de temps, grâce à la succession rapide de l’optimisation du criblage cristallin et des mesures de diffraction. Ce pipeline a également été récemment appliqué à l’identification de fragments, se liant à la fois à l’actif dans plusieurs sites alacstériques de Trypanosoma brucei.Farnesyl pyrophosphate synthase une enzyme clé du parasite causant la trypanosomiase humaine africaine. Ce processus minimise le délai entre la croissance et la mesure des cristaux, accélérant ainsi les progrès. Il libère également les scientifiques des opérations complexes telles que la manipulation des cristaux et l’opération de ligne de faisceau rendant la cristallographie, plus accessible aux non-experts.Cette approche peut contribuer à favoriser la recherche translationnelle et ensuite accélérer le processus de découverte de médicaments. Contribuer au développement de médicaments meilleurs et plus sûrs contre un plus grand nombre de cibles.

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Recherche

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Biochemistry

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