Name: In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Découvrez l'analyse ultrastructurale des mégacaryocytes dans la moelle osseuse de souris C57BL/6 par microscopie électronique à transmission. Cette méthode in situ permet de quantifier les stades de maturation avec une résolution élevée.

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Les auteurs tiennent à remercier Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), l’Union Européenne à travers le Fonds Européen de Développement Régional (FEDER) et par la Subvention ANR-17-CE14-0001-01 à H.d.S.

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux normes européennes 2010/63/UE et au Comité CREMEAS d’Éthique de l’Expérimentation Animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg). Le protocole est schématiquement illustré à la figure 1.
1. Collecte et fixation de la moelle osseuse ( Figure 1A)
ATTENTION: Cette procédure comprend des substances cancérigènes, mutagènes et / ou toxiques et est effectuée sous une hotte d’extraction chimique. Portez un équipement de protection approprié comme des gants et des lunettes de protection.
<ol><li>Préparer la solution fixative composée de 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate (voir Dossier supplémentaire).</li>
	<li>Collecte de moelle osseuse<ol>
<li>Utilisez des souris adultes C57BL/6 de l’un ou l’autre sexe âgées de 12 à 18 semaines. Euthanasier les souris par asphyxie au CO2 et luxation cervicale.</li>
		<li>Avec une paire de ciseaux fins, coupez la peau autour de la cuisse et utilisez une pince à épiler pour décoller la peau. Retirez l’extrémité de la patte, puis coupez entre la hanche et la cuisse. Détacher le tibia du fémur en coupant l’articulation du genou et enlever le tissu adhérent sur le tibia et le fémur à l’aide d’un scalpel.</li>
		<li>Retirez les épiphyses avec une lame de rasoir tranchante. Tout en tenant le fémur avec une pince à épiler, utilisez une seringue de 5 mL remplie de tampon cacodylate avec une aiguille de 21 G pour rincer la moelle osseuse dans un tube de 15 mL rempli de tampon cacodylate de 2 mL. Pour ce faire, insérez le biseau de l’aiguille dans l’ouverture de la moelle osseuse et appuyez lentement sur le piston jusqu’à ce que la moelle soit expulsée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixation de la moelle osseuse par immersion rapide dans le fixateur.<ol>
<li>Immédiatement après le rinçage, utilisez une pipette en plastique pour transférer le cylindre de moelle osseuse dans 1 mL de solution fixatrice de glutaraldéhyde frais (préalablement préparé au point 1.1) pendant 60 min à température ambiante. REMARQUE: Pour préserver le tissu, assurez-vous que l’ensemble du processus, de la dissection osseuse à l’étape de fixation, est terminé en moins de 10 minutes. Pour la fixation, assurez-vous que la solution fixatrice est à température ambiante pour éviter les chocs thermiques.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Incorporer la moelle osseuse dans l’agarose
REMARQUE: Le tissu de la moelle osseuse n’est pas suffisamment cohésif pour maintenir son intégrité pendant les différentes étapes de lavage et le matériau peut être facilement perdu. Pour surmonter ce problème, la moelle est recouverte d’un gel de gélose avant la déshydratation.
<ol><li>Préparez la solution d’agarose comme décrit dans le dossier supplémentaire.</li>
	<li>Laver la moelle fixe de la section 1.3 dans un tampon cacodylate et la transférer soigneusement sur une lame de verre à l’aide d’une pipette en plastique. À l’aide d’une pipette chaude, appliquez rapidement une goutte de gélose liquide à 2 % sur le cylindre de moelle osseuse. REMARQUE: La gélose se solidifie rapidement pendant le refroidissement. Pour assurer un revêtement homogène de la moelle osseuse, la solution d’agar doit être maintenue au chaud jusqu’à ce qu’elle soit déposée sur la lame.</li>
	<li>Placez rapidement la lame sur la glace jusqu’à ce que la gélose se solidifie (1-2 min).</li>
	<li>Au microscope, utilisez une lame de rasoir tranchante pour couper et jeter les extrémités du cylindre de moelle osseuse en raison de la compression tissulaire possible dans ces zones. Transférer les blocs de moelle dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1 mL de tampon cacodylate.</li>
</ol>3. Incorporer la moelle osseuse dans la résine
ATTENTION : Les composants de résine sont toxiques; certains sont cancérigènes et doivent être manipulés avec soin sous une hotte d’extraction chimique. Utilisez un équipement de protection approprié comme des gants et des lunettes de protection. Le tétroxyde d’osmium est très volatil à température ambiante et ses vapeurs sont très nocives pour les yeux, le nez et la gorge. Avant d’être jeté, 2% de tétroxyde d’osmium doit être neutralisé en ajoutant deux fois son volume d’huile végétale.
<ol><li>Préparez la résine époxy comme décrit dans le dossier supplémentaire.</li>
	<li>Intégration de résine REMARQUE: Conserver les échantillons dans les mêmes tubes de microcentrifugation pendant les incubations dans des bains successifs d’osmium, d’acétate d’uranyle et d’éthanol. Aspirer les surnageants avec une pipette Pasteur. Le volume de solution utilisé pour chaque bain doit être égal à au moins 10 fois le volume de l’échantillon.<ol>
<li>Post-fixer les blocs avec 1% d’osmium dans un tampon cacodylate pendant 1 h à 4 °C, laver une fois dans un tampon cacodylate puis une fois dans de l’eau distillée.</li>
		<li>Tacher avec 4% d’acétate d’uranyle dans de l’eau distillée pendant 1 h, laver deux fois dans de l’eau distillée.</li>
		<li>Déshydrater à travers une série graduée d’éthanol dans de l’eau distillée : 4 fois dans de l’éthanol à 75 % pendant 5 min, suivi de 3 fois dans de l’éthanol à 95 % pendant 20 min, puis 3 fois dans de l’éthanol à 100 % pendant 20 min. À cette étape, sortez une seringue de résine époxy du congélateur. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause dans de l’éthanol à 100% pendant 1 h.</li>
		<li>Pour obtenir une infiltration et une polymérisation uniformes de la résine époxy à l’intérieur de la moelle, incuber d’abord les blocs dans 2 bains successifs d’oxyde de propylène pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter un mélange 1:1 d’oxyde de propylène à 100% et de résine époxy et incuber pendant 1 h. Placez les échantillons sur un agitateur rotatif lent à température ambiante.</li>
		<li>Ajouter 100% de résine époxy laisser l’échantillon pour une incubation de nuit sous agitation.</li>
		<li>Ajouter 100% résine époxy pendant 2 h d’incubation, toujours sous agitation.</li>
		<li>Sous un microscope, placez les blocs de moelle dans des moules plats en silicone. Orienter les échantillons pour permettre une coupe transversale ultérieure de l’ensemble de la moelle osseuse. Remplissez les moules avec de la résine époxy et placez-les à 60 °C pendant 48 h. REMARQUE: Toutes les solutions (à l’exception de l’éthanol et de l’oxyde de propylène) sont filtrées à travers un filtre de 0,22 μm pour éviter la contamination des échantillons. Pour assurer une polymérisation adéquate de la résine, évitez les bulles lors du remplissage des moules.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Sectionnement ultramince (Figure 1B)
REMARQUE: La transmission EM nécessite de fines sections tissulaires à travers lesquelles les électrons peuvent passer générant une image de projection de l’intérieur des cellules, de la structure et de l’organisation des organites internes (granules, réticulum endoplasmique, Golgi) et de la disposition des membranes cellulaires intracellulaires.
<ol><li>Montez le bloc d’échantillon dans un support ultra-microtome. Mettez-le sur le porte-échantillon. Coupez les échantillons à 45° afin d’éliminer l’excès de résine autour du tissu avec une fraise rotative en diamant ou en tungstène.</li>
	<li>Montez les échantillons sur l’ultramicrotome avec une lame de couteau en diamant équipée d’un réservoir d’eau. Couper des sections transversales de 500 nm et 100 nm d’épaisseur pour les analyses histologiques et TEM, respectivement. Collectez les sections flottantes à la surface de l’eau avec une boucle.</li>
	<li>Déposez la section de 500 nm d’épaisseur sur une lame de verre et les sections de 100 nm d’épaisseur sur des grilles de cuivre à barres minces de 200 mailles avec un filtre en papier en dessous. Préparez cinq grilles pour une condition : colorez d’abord deux grilles et conservez les trois grilles restantes comme sauvegarde si nécessaire.</li>
</ol>5. Coloration au bleu de toluidine pour l’histologie
REMARQUE: Les sections de coloration pour l’histologie sont importantes pour trois raisons: 1) pour s’assurer que le tissu est réellement coupé et non la résine, 2) pour vérifier la qualité de l’inclusion et 3) pour évaluer rapidement l’échantillon de moelle. Si ce n’est pas correct, coupez plus profondément dans le bloc.
<ol><li>Sécher les sections semi-minces sur une plaque chauffante (60 °C).</li>
	<li>Ajouter 1 % de bleu de toluidine filtré/1 % de borate de sodium dans l’eau distillée sur les lames et chauffer sur une plaque chauffante (60 °C) pendant 1-2 min. Lavez les lames avec de l’eau distillée et laissez-les sécher sur la plaque chauffante.</li>
	<li>Montez des sections sur des couvercles avec une goutte de milieu de montage en poly(méthacrylate de butyle-co-méthacrylate de méthyle) et examinez au microscope optique.</li>
</ol>6. Coloration des métaux lourds pour l’observation tem (Figure 1C)
REMARQUE: Pour le contraste, la face supérieure des grilles est inversée sur des gouttes de 100 μL de chaque bain successif avec une boucle. Avant utilisation, chaque solution est filtrée à 0,22 μm. Retirez l’excès de liquide entre chaque bain en contactant doucement le côté de la grille sur un papier filtre.
<ol><li>Tacher avec 4% d’acétate d’uranyle dans de l’eau distillée pendant 5 min.</li>
	<li>Laver 3 fois à l’eau distillée pendant 5 min.</li>
	<li>Tacher avec du citrate de plomb pendant 3 min.</li>
	<li>Laver 3 fois à l’eau distillée pendant 5 min.</li>
	<li>Déposez les grilles par le côté inférieur au contact du papier filtre pour les laisser sécher. REMARQUE: Les métaux lourds réagissent en présence de dioxyde de carbone. Pour minimiser les précipités, évitez le déplacement de l’air pendant le contraste, ne parlez pas, gardez l’environnement calme et éteignez la climatisation.</li>
</ol>7. TEM (Figure 1E)
REMARQUE: Les sections sont introduites dans un microscope TEM et examinées à 120 kV.
<ol><li>Examinez d’abord les sections à faible grossissement (< 500x) pour apprécier l’aspect général de la préparation (absence de trou dans la résine, plis / compression dans les sections, précipités dus à la coloration).</li>
	<li>Examinez ensuite les sections à grossissement plus élevé (~ 2000x permettant de distinguer le stade de maturation). Comptez manuellement les mégacaryocytes de chaque étape de maturation sur des sections transversales entières (voir Résultats représentatifs sur la façon d’identifier visuellement chaque étape). REMARQUE: Chaque carré des grilles est défini comme une zone à examiner (ce qui équivaut à 16000 μm2 pour les grilles de cuivre à 200 mailles).</li>
	<li>Pour évaluer le nombre de mégacaryocytes, quantifiez uniquement les carrés qui sont entièrement recouverts d’une section. Pour ce faire, utilisez un modèle basé sur le criblage des gammes. Observez une première gamme de carrés d’une extrémité de la section à une autre, puis une autre plage de la même manière, etc. En utilisant cette procédure, cribillez complètement et systématiquement toute la section transversale de la moelle carré par carré.</li>
	<li>Pour chaque carré, notez le nombre de mégacaryocytes de stade I, II ou III. REMARQUE: Des grossissements plus élevés sont nécessaires pour analyser les granules, l’organisation du DMS, la taille des territoires cytoplasmiques et le noyau polylobulé.</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9(1989).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+%28DMS%29+in+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li>
<li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+megakaryocytes+to+platelets%3A+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets+and+Megakaryocytes%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061(2018).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

L’examen direct des mégacaryocytes dans leur environnement natif est essentiel pour comprendre la mégacaryopoïèse et la formation de plaquettes. Dans ce manuscrit, nous fournissons une méthode de microscopie électronique à transmission combinant le rinçage de la moelle osseuse et la fixation par immersion, permettant de disséquer in situ les caractéristiques morphologiques de l’ensemble du processus de morphogenèse des mégacaryocytes se déroulant dans la moelle osseuse.
Le rinçage de ...

Les mégacaryocytes sont de grandes cellules polyploïdes spécialisées, localisées dans la moelle osseuse, responsables de la production deplaquettes 1. Ils proviennent de cellules souches hématopoïétiques par un processus de maturation complexe, au cours duquel les précurseurs de mégacaryocytes augmentent progressivement en taille, tout en subissant d’importants changements morphologiques concomitants dans le cytoplasme et le noyau2. Au cours de la maturation, les mégacaryocytes développent un certain nombre d’éléments structurels distincts, notamment: un noyau polylobulé, des invaginations de la membrane de surface qui forment le système membranaire de démarcation (DMS), une zone périphérique dépourvue d’organites entourés par le réseau cytosquelette à base d’actine et de nombreux organites, notamment des granules de α, des granules denses, des lysosomes et de multiples complexes de Golgi. Au niveau ultrastructural, une modification majeure observée est la compartimentation cytoplasmique en régions discrètes délimitées par le DMS3. Cet approvisionnement important en membranes alimentera l’extension de longs processus cytoplasmiques dans la phase initiale de la production de plaquettes, qui se remodèleront ensuite en plaquettes à l’intérieur de la circulation. Tout défaut lors de la différenciation et de la maturation des mégacaryocytes peut affecter la production de plaquettes en termes de numération plaquettaire et / ou de fonction plaquettaire. 
La microscopie électronique à transmission à couche mince (TEM) est l’approche d’imagerie de choix depuis des décennies, fournissant une ultrastructure de haute qualité de mégacaryocytes qui ont façonné notre compréhension de la physiologie de la thrombopoïèse4,5. Cet article se concentre sur une méthode TEM standardisée permettant de capturer le processus de biogenèse plaquettaire se produisant in situ dans le microenvironnement natif de la moelle osseuse, qui pourrait également servir de base pour analyser tout type de cellule de moelle osseuse. Nous fournissons des exemples ultrastructuraux du développement de mégacaryocytes de immatures à complètement matures, qui étendent les processus cytoplasmiques dans la microcirculation des sinusoïdes6. Nous décrivons également une procédure facile pour quantifier les différentes étapes de maturation des mégacaryocytes, en donnant des instructions sur la régénération et la capacité de production plaquettaire de la moelle osseuse.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tri(diméthylaminométhyl)phénol (DMP-30)</td><td>Ladd Research Industries, États-Unis</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>Type d’agarose LM-3 à faible point de fusion Agar</td><td>Electron Microscopy Sciences,</td><td>États-Unis 1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Chlorure de calcium hexahydraté</td><td>Merck, Allemagne</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>Grilles de cuivre 200 mailles à barre mince</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, Angleterre</td><td>T200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium trihydraté d’acide diméthylarsinique</td><td>Merck, Allemagne</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride dodécénylsuccinique (DDSA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir en acier inoxydable à double tranchant</td><td>Microscopie électronique Sciences-EMS, USA</td><td>EM-72000</td><td></td></tr><tr><td>Absolut d’éthanol</td><td>VWR International, France</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>Filtre papier, diamètre 90 mm</td><td>Whatman, Angleterre</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>Moule en silicone à encastrement plat</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, Angleterre</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde 25 %</td><td>Microscopie électronique Sciences-EMS, USA</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, Autriche</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>Histo Diamond Knife 45&deg ;</td><td>Diatomée, Suisse</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>JEOL 2100 Plus Microscope TEM</td><td>JEOL, Japon</td><td>EM-21001BU</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de plomb - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Autriche</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>LX-112 résine</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma, France</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage - Poly(méthacrylate de butyle-méthacrylate de co-méthyle)</td><td>Microscopie électronique Sciences-EMS, États-Unis</td><td>15320</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride de méthyle nadique (NMA)</td><td>Ladd Research Industries, États-Unis</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium 2 %</td><td>Merck, Allemagne</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de propylène (1.2-époxypropane)</td><td>Sigma, France</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Solution injectable saline 0.9 % NaCl</td><td>C.D.M Lavoisier, France</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Lame en acier chirurgical</td><td>Swann-Morton,</td> <td>Angleterre.0508</td><td></td></tr><tr><td>Tétraborate de sodium - Borax</td><td>Sigma, France</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck, Allemagne</td><td>84100-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue 0.2&micro ; m</td><td>Pall Corporation, États-Unis</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>Bleu toluidine</td><td>Ladd Research Industries, États-Unis</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Autriche</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, Autriche</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Ladd Research Industries, États-Unis</td><td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

La différenciation et la maturation des mégacaryocytes se produisent en étroite association avec les composants cellulaires et extracellulaires de la moelle osseuse. Ces processus sont caractérisés par l’apparition progressive de structures essentielles dans le cytoplasme mégacaryocytaire telles qu’un noyau polyploïde et polylobulé, un réseau membranaire interne appelé système membranaire de démarcation (DMS) et les granules denses et alpha que l’on trouvera dans les plaquettes circulantes. Dans cet article, nous décrivons un protocole standardisé pour l’étude ultrastructurale in situ des mégacaryocytes murins à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM), permettant l’identification de caractéristiques clés définissant leur stade de maturation et leur densité cellulaire dans la moelle osseuse. Les moelles osseuses sont rincées, fixées, déshydratées dans de l’éthanol, incorporées dans de la résine plastique et montées pour générer des sections transversales. Des sections semi-minces et minces sont préparées pour les observations histologiques et TEM, respectivement. Cette méthode peut être utilisée pour n’importe quelle cellule de moelle osseuse, dans n’importe quelle installation EM et présente l’avantage d’utiliser de petites tailles d’échantillons permettant la combinaison de plusieurs approches d’imagerie sur la même souris.

Histologie de la moelle osseuse L’observation de l’histologie bleue de la toluidine de la moelle osseuse au microscope optique est essentielle pour analyser rapidement l’architecture tissulaire globale en termes de compacité tissulaire, de continuité des microveux, ainsi que de taille et de forme des mégacaryocytes (Figure 1D). Il est effectué avant les sections ultraminces pour déterminer la nécessité de couper plus profondément dans le bloc de moelle os...

Nous présentons ici un protocole pour analyser l’ultrastructure des mégacaryocytes in situ en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM). Les moelles osseuses murines sont collectées, fixées, incorporées dans de la résine époxy et coupées en sections ultraminces. Après coloration par contraste, la moelle osseuse est observée au microscope TEM à 120 kV.

In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

L’objectif global de cette procédure est d’observer l’ultrastructure des mégacaryocytes situés dans la moelle osseuse de la souris et de quantifier les différentes étapes de maturation à l’aide de la microscopie électronique à transmission à haute résolution. Le principal avantage est l’examen direct des mégacaryocytes dans l’environnement natif, qui diffère des mégacaryocytes cultivés in vitro qui, comme nous le savons, n’atteignent pas le niveau complet de maturation. Après avoir récolté le tibia et les fémurs de souris C57BL/6 âgées de 12 à 18 semaines selon les protocoles standard, utilisez une lame de rasoir tranchante pour enlever les épiphyses de chaque os.En tenant chaque os avec une pince à épiler, insérez une aiguille de calibre 21 attachée à une seringue de cinq millilitres remplie de tampon cacodylate dans une extrémité de l’os et rincez la moelle osseuse dans un tube de collecte de 15 millilitres contenant deux millilitres de tampon cacodylate frais. Immédiatement après le rinçage, utilisez une pipette en plastique pour transférer les cylindres de moelle osseuse dans un millilitre de solution fixatrice de glutaraldéhyde frais pour une incubation de 60 minutes à température ambiante. Pour l’incorporation de la moelle osseuse dans l’agarose, lavez les échantillons fixés dans un tampon cacodylate frais et utilisez une pipette en plastique pour transférer soigneusement la moelle osseuse sur une lame de verre.À l’aide d’une pipette chaude, appliquez rapidement une goutte de gélose liquide à 2 % sur les cylindres de moelle osseuse et placez immédiatement la lame sur de la glace pendant une à deux minutes. Lorsque la gélose s’est solidifiée, utilisez un stéréomicroscope et une lame de rasoir tranchante pour éliminer les extrémités de chaque cylindre de moelle osseuse et transférer les blocs de moelle coupés dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant un millilitre de tampon cacodylate. Pour l’incorporation de résine, fixez les blocs avec du tétroxyde d’osmium à 1% dans un tampon cacodylate dans une hotte chimique pendant une heure à quatre degrés Celsius avant de laver les blocs une fois avec un tampon cacodylate et une fois avec de l’eau distillée.Après le lavage à l’eau, tacher les blocs avec de l’acétate d’uranyle à 4% dans de l’eau distillée pendant une heure, suivi de deux lavages à l’eau distillée, comme démontré. Après le dernier lavage, déshydratez les blocs par une série ascendante d’immersions à l’éthanol et d’eau distillée comme indiqué. Pour obtenir une infiltration et une polymérisation uniformes de la résine époxy à l’intérieur de la moelle, incuber les blocs dans deux bains successifs d’oxyde de propylène pendant 15 minutes avant d’incuber les échantillons dans un mélange un-à-un d’oxyde de propylène à 100% et de résine époxy pendant une heure sur un agitateur rotatif lent à température ambiante.À la fin de l’incubation, ajoutez de la résine époxy à 100% aux blocs de moelle pour une incubation de nuit dans les mêmes conditions, puis ajoutez de la résine époxy à 100% pour une autre incubation de deux heures. À la fin de l’incubation, utilisez un microscope pour orienter les blocs de moelle dans des moules plats en silicone afin de permettre leur section transversale ultérieure et remplissez les moules de résine époxy avant de les placer à 60 degrés Celsius pendant 48 heures. Pour une section ultra fine, montez le bloc d’échantillon sur un support ultra microtome et montez le support sur le porte-échantillon.Utilisez une fraise diamantée pour couper les échantillons à un angle de 45 degrés afin d’éliminer l’excès de résine autour du tissu avant d’utiliser une lame de couteau en diamant équipée d’un réservoir d’eau pour couper des sections transversales de 500 et 100 nanomètres d’épaisseur pour l’analyse histologique et TEM respectivement, puis utilisez une boucle pour transférer les sections de 500 nanomètres d’épaisseur flottant sur la surface de l’eau sur une lame de verre et pour déposer les 100 nanomètres d’épaisseur sections sur des grilles de cuivre à barres minces de 200 mailles avec un filtre en papier en dessous. Pour la coloration au bleu de toluidine, après avoir dessiné les sections de 500 nanomètres d’épaisseur sur une plaque chauffante à 60 degrés, ajoutez du bleu de toluidine filtré à 1% dans de l’eau distillée aux sections pour une incubation d’une à deux minutes. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec de l’eau distillée.Lorsque les lames ont séché, utilisez un support de montage pour monter les échantillons avec un couvercle et visualisez les échantillons par microscopie optique. Pour la coloration de contraste, étiqueter les sections de 100 nanomètres avec de l’acétate d’uranyle à 4% pendant cinq minutes, suivies de trois lavages de cinq minutes à l’eau distillée. Après le dernier lavage, tacher les sections avec du citrate de plomb pendant trois minutes, suivies de trois lavages de cinq minutes à l’eau distillée comme démontré.Après le dernier lavage, placez d’abord le côté inférieur de chaque grille en contact avec un morceau de papier filtre pour permettre aux grilles d’être placées sur le papier filtre pour sécher. Pour examiner les sections par TEM, lorsque les grilles ont séché, sélectionnez un faible grossissement pour évaluer la qualité générale des préparations. Pour déterminer le nombre de mégacaryocytes de chaque stade de maturation dans chaque section transversale, sélectionnez un grossissement plus élevé et quantifiez le nombre de mégacaryocytes de stade I, II ou III uniquement dans des carrés entièrement recouverts de tissu.Dans cette analyse histologique représentative, la continuité des micro-vaisseaux de compacité ainsi que la taille et la forme des mégacaryocytes peuvent être clairement observées. Les mégacaryocytes murins sont divisés en quatre étapes de maturation. Les mégacaryocytes de stade I ont un gros noyau.La présence de l’étape détectable la plus précoce du système de membrane de démarcation est également un critère clé de cette étape. Au stade II, la formation de granules commence et le développement du système de membrane de démarcation est lancé. Les mégacaryocytes de stade III sont des cellules géantes avec des systèmes membranaires de démarcation bien développés, des territoires cytoplasmiques clairement définis et des zones périphériques dépourvues d’organites, et des noyaux excentriques.Le stade pyrénocytaire de la maturation des mégacaryocytes est caractérisé par un noyau nu. Comme illustré, les mégacaryocytes sont fréquemment observés au contact des cellules endothéliales. À l’occasion, les mégacaryocytes forment de courtes protubérances invasives qui pénètrent dans l’endothélium ou étendent les proplaquettaires dans la lumière sinusoïdale.La TEM permet également la visualisation de détails ultra structurels, ainsi que la présence de cellules hématopoïétiques qui ont été englouties par les mégacaryocytes. Le rinçage de la moelle osseuse doit être effectué avec soin et immédiatement après la dissection osseuse. Pour maximiser l’intégrité des tissus, la moelle est entourée d’un gel de gélose avant la déshydratation.Après cette procédure, les blocs de moelle osseuse peuvent être imagés à différents grossissements ou peuvent être utilisés pour d’autres analyses de microscopie électronique 3D, telles que la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisé.

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Le présent protocole décrit un nouveau procédé d'identification d'une population d'énucléation d'érythroblastes orthochromatiques par écoulement d'imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d'énucléation des érythroblastes.

Identification d&#39;une sous-population murine érythroblastes enrichi en énucléation événements par imagerie multispectrale cytométrie en flux

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

Les monocytes sont des régulateurs clés de l’immunité innée et jouent un rôle critique dans le renouvellement du système phagocytaire mononucléaire périphérique et en cas d’inflammation. Ce manuscrit décrit la procédure d’imagerie en temps réel de la moelle osseuse de la calvaria de souris pour étudier le mécanisme de mobilisation des monocytes.

Suivi moelle osseuse de souris monocytes<em&gt; In Vivo</em

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

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La microscopie intravitale fluorescence (IVFM) de la voûte crânienne est appliquée en combinaison avec des modèles animaux génétiques pour étudier la domiciliation et la greffe de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse (BM) niches.

Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

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Nous présentons un protocole pour étudier la distribution des mitochondries et du réticulum endoplasmique dans les cellules entières après modification génétique utilisant la lumière corrélative et la microscopie électronique de volume comprenant la peroxidase d'ascorbate 2 et la coloration de peroxidase de raifort, sectionnement en série des cellules avec et sans le gène cible dans la même section, et imagerie en série par microscopie électronique.

Imagerie des mitochondries et du réticulum endoplasmique par microscopie corrélative de lumière et d'électron de volume

Cette méthode décrit la purification par cytométrie en flux de MEP et de MKp à partir de fémurs, de tibias et d’os pelviens de souris.

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Nous décrivons ici la méthode d’imagerie des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle de l’os du crâne de souris vivantes en utilisant la microscopie à deux photons.

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Ici, nous présentons une stratégie d’immunophenotyping pour la caractérisation de la différenciation de megakaryocyte, et montrons comment cette stratégie permet le tri des megakaryocytes à différentes étapes avec un trieur de cellules fluorescence-activé. La méthodologie peut être appliquée aux tissus primaires humains, mais aussi aux mégacaryocytes générés en culture in vitro.

Immunophénotypage et tri cellulaire des MKs humains provenant de sources primaires humaines ou différenciés in vitro à partir de progéniteurs hématopoïétiques

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Hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon

Découvrez l'analyse ultrastructurale des mégacaryocytes dans la moelle osseuse de souris C57BL/6 par microscopie électronique à transmission. Cette méthode in situ permet de quantifier les stades de maturation avec une résolution élevée.

In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission

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