Name: Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Apprenez à isoler les progéniteurs mégacarytaires MEP et MKp de la moelle osseuse de souris. Cette méthode efficace utilise la crête iliaque pour augmenter le rendement cellulaire et réduire l'utilisation animale.

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Les auteurs tiennent à remercier Monique Freund, Catherine Ziessel et Ketty pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), et par Grant ANR-17-CE14-0001-01 à Henri.de la. Salle.

Les protocoles impliquant des animaux ont été réalisés conformément au Comité CREMEAS d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg. Numéro de permis : E67-482-10).
1. Collecte d’os de souris
<ol><li>Sacrifier l’animal conformément aux directives institutionnelles. NOTE: Les données présentées dans ce manuscrit ont été obtenues à partir de souris C57Bl/6 âgées de 8 à 12 semaines. Le nombre de cellules obtenues et la fréquence des populations citées peuvent varier en fonction de l’âge et de la souche de souris.</li>
	<li>Vaporisez le corps avec 70% d’éthanol.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux, faites une incision de 0,5 à 1 cm de la peau perpendiculairement à la colonne vertébrale et déchirez la peau autour de tout le corps. Tirez la peau du bas du corps et retirez la peau.</li>
	<li>Placez l’animal sur le tampon de dissection, face vers le bas. Localisez les os pelviens en faisant glisser vos doigts le long de la colonne vertébrale exposée de haut en bas. Pour localiser la crête iliaque, identifiez la petite bosse dans la région lombaire près des membres postérieurs (la région antérosupérieur de l’os pelvien). La figure 1A,B présente une représentation schématique de l’anatomie de la souris.</li>
</ol><img alt="Radiographie et schéma de l’anatomie de l’os pelvien, du fémur et du tibia de la souris pour la recherche et l’analyse du squelette." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Anatomie de la souris. (A) Radiographie de la souris montrant les os des membres postérieurs. Notez l’espace entre l’os pelvien et la colonne vertébrale (flèche jaune), où les ciseaux doivent être insérés pour séparer correctement les membres postérieurs du corps de la souris (ligne pointillée jaune). (B) Représentation schématique des os d’intérêt riches en moelle osseuse. Les os pelviens sont représentés en rouge, les fémurs en violet et les tibias en vert. (C) Représentation schématique de l’os pelvien de la souris. L’ilium correspond à la partie riche en moelle de l’os pelvien et est surligné en rouge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="5"><li>Placez les ciseaux parallèlement à la colonne vertébrale contre les vertèbres et près de la bosse de la crête iliaque. Procédez à couper les muscles le long du côté de la colonne vertébrale au-dessus de l’os pelvien en faisant glisser les ciseaux le long des vertèbres jusqu’à la queue. REMARQUE: Cette première section de muscles peut également être effectuée à l’aide d’une lame de scalpel.</li>
	<li>Placez les ciseaux parallèlement à la colonne vertébrale et procédez à la coupe entre les vertèbres et la crête iliaque, comme l’indique la ligne pointillée jaune sur la figure 1A. Assurez-vous de rester le plus près possible des vertèbres. Coupez les muscles restants pour détacher le membre du corps. REMARQUE: Il devrait y avoir peu ou pas de résistance.</li>
	<li>Répétez de l’autre côté pour détacher le deuxième membre.</li>
	<li>Transférez les membres sur une surface propre et jetez le reste du corps conformément aux directives institutionnelles.</li>
	<li>Exposez les os pelviens, fémoraux et tibias en enlevant autant de tissu environnant que possible avec la pince et les scalpels.</li>
	<li>Procédez à la luxation soigneuse de la tête fémorale de l’os pelvien en tenant l’extrémité distale du fémur avec la pince tout en tranchant doucement les muscles autour de l’articulation avec les scalpels. Remuez les os pour faciliter la luxation.</li>
	<li>Grattez le muscle restant de l’os pelvien et coupez avec un scalpel au milieu de la cavité qui maintenait la tête du fémur. L’ilium est conservé car il est riche en progéniteurs hématopoïétiques tandis que le côté triangulaire très mince de l’os est jeté, comme le montre la figure 1C.</li>
	<li>Enlevez les tissus résiduels autour de l’ilium avec le scalpel et placez l’os nettoyé dans du PBS stérile complété par du sérum de veau nouveau-né à 2% (PBS-2% NBCS).</li>
	<li>À l’aide de ciseaux, coupez le pied de la jambe à la cheville.</li>
	<li>Tenez la partie inférieure du tibia avec la pince et grattez le muscle vers le genou. Jetez les fibules et coupez le plateau tibial avec le scalpel. Placez le tibia dans du PBS-2% NBCS stérile.</li>
	<li>Enlevez les tissus résiduels autour du fémur avec des scalpels.</li>
	<li>Tenez la face supérieure du fémur avec une pince; placez la lame du scalpel à la base de la rotule. Appliquez une force vers la rotule parallèlement au fémur jusqu’au détachement de la rotule. Placez le fémur dans du PBS-2% NBCS stérile. Le retrait de la rotule fournit un accès propre pour l’insertion de l’aiguille pour le rinçage de la moelle.</li>
</ol>2. Épuisement magnétique des cellules positives de la lignée
<ol><li>Dans une armoire à flux laminaire, transférer les os dans une boîte de Petri stérile remplie de PBS-2% NBCS stérile.</li>
	<li>Avec un scalpel coupé la tête des fémurs.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 1 mL avec du PBS-2% NBCS stérile et fixez une aiguille de 21 G à la sortie.</li>
	<li>Remplissez un tube en polypropylène de 5 mL avec 2 mL de PBS-2% NBCS stérile.</li>
	<li>Tenez le fémur avec la pince; insérez doucement l’aiguille dans la rainure laissée après le retrait de la rotule. Appliquez une rotation sur l’aiguille lors de l’insertion pour éviter le colmatage de l’aiguille. Assurez-vous que l’aiguille est complètement insérée dans l’os jusqu’au biseau.</li>
	<li>Transférer l’os avec l’aiguille dans le tube contenant 2 mL de PBS-2% NBCS. Distribuer et aspirer le PBS-2%NBCS de la seringue jusqu’à ce que l’os soit clair.</li>
	<li>Retirez l’aiguille du fémur et insérez-la dans le trou du côté opposé où se trouvait la tête du fémur. Distribuer et aspirer à nouveau le tampon et jeter l’os.</li>
	<li>Pour la crête iliaque et le tibia, tenez l’os avec la pince; insérez doucement l’aiguille dans le côté ouvert. Appliquez une rotation sur l’aiguille lors de l’insertion pour éviter le colmatage de l’aiguille. Assurez-vous que l’aiguille est complètement insérée dans l’os jusqu’au biseau. Transférer l’os avec l’aiguille dans le tube contenant 2 mL de PBS-2% NBCS. Distribuer et aspirer le PBS-2%NBCS de la seringue jusqu’à ce que l’os soit clair. Jetez les os. REMARQUE: Les os de jusqu’à trois souris peuvent être rincés dans le même tube. Regrouper les suspensions cellulaires.</li>
	<li>Passer la suspension cellulaire regroupée à travers un bouchon de crépine cellulaire de 40 μm placé sur un tube stérile en polystyrène de 5 mL.</li>
	<li>Procédez au comptage des cellules. REMARQUE: Le comptage cellulaire peut être effectué avec n’importe quel hémocytomètre, en utilisant Trypan Blue pour l’évaluation de la viabilité, ou avec n’importe quel compteur cellulaire automatisé. Une souris donne généralement 105 ± 7 x 106 cellules.</li>
	<li>Essuyez 100 μL de la suspension cellulaire sous forme de moelle osseuse totale, ajoutez 500 μL de PBS-2% NBCS et conservez-la sur de la glace pour la procédure de coloration.</li>
	<li>Pastillez la suspension filtrée par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jetez le surnageant. REMARQUE: Les globules rouges peuvent être lysés en remettant la pastille dans une solution de lyse fraîchement préparée (1/10ème en dH2O). Incuber pendant 5 min jusqu’à ce que la suspension devienne claire et rouge vif et ajouter 10 volumes de PBS stérile. Procéder au lavage des cellules en PBS-2% NBCS par centrifugation à 400 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Soyez prudent lorsque vous retirez le surnageant car la pastille de cellule est très lâche. Effectuez un deuxième lavage avec PBS-2% NBCS par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et passez à l’étape 2.13.</li>
	<li>Resuspendez la pastille cellulaire dans un cocktail d’anticorps primaires fraîchement préparé avec un rapport de 100 μL pour 1 x 107 cellules. Incuber sur de la glace pendant 30-45 min.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticorps</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gr-1-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mac-1-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD5-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>TER119-biotine</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD127-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1.
<ol start="14"><li>Prendre 10 μL de la suspension cellulaire dans un tube stérile en polystyrène de 5 mL marqué Lin-Pos Fraction. Ajouter 90 μL de PBS-2%NBCS et l’économiser sur de la glace pour la procédure de coloration.</li>
	<li>Procéder au lavage des cellules deux fois avec du PBS-2% NBCS stérile par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Assurez-vous de faire le dernier lavage dans un tube stérile en polypropylène de 5 mL.</li>
	<li>Pendant les étapes de lavage, préparez les perles pour l’épuisement magnétique.<ol>
<li>Resussaisissez les perles dans le flacon en les faisant soigneusement tourbillon pendant 30 s.</li>
		<li>Transférer un volume de billes correspondant à deux billes par cellule cible dans un tube en polypropylène de 5 mL.</li>
		<li>Lavez les billes deux fois avec PBS-2%NBCS en plaçant le tube sur l’aimant et en retirant le tampon de lavage à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile.</li>
		<li>Resuspendez les billes dans 500 μL de PBS-2NBCS stérile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remettez enseillement la pastille de cellules étiquetées dans 250 μL de billes et mélangez doucement pendant 5 min sur de la glace. Ajouter 2 mL de PBS-2% NBCS stérile et mélanger doucement. Ne secouez pas le tube.</li>
	<li>Placez le tube sur l’aimant pendant 2 min.</li>
	<li>Procéder à la collecte de la fraction non magnétique avec une pipette Pasteur en verre stérile et l’ajouter sur les 250 μL restants de billes magnétiques. Scellez le tube avec un parafilm.</li>
	<li>Placez le tube sur un rouleau à tube pendant 20 min à 4 °C.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de PBS-2% NBCS stérile et mélanger doucement. Ne secouez pas le tube.</li>
	<li>Placez le tube dans l’aimant pendant 2 min.</li>
	<li>Procéder à la collecte de la fraction non magnétique dans un tube stérile en polypropylène de 5 mL étiqueté Lin-Neg Fraction avec une pipette Pasteur en verre stérile.</li>
	<li>Abreuler les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendez les cellules non magnétiques dans 500 μL de PBS-2% NBCS stérile.</li>
	<li>Procédez au comptage des cellules. REMARQUE: Une souris donne généralement 3,9 ± 1,1 x 106 cellules. Les colorations typiques de la lignée avant et après l’épuisement sont présentées à la figure 2B.</li>
</ol>3. Tri cellulaire des progéniteurs mégacarytaires par cytométrie en flux
<ol><li>Prenez les tubes étiquetés Total Bone Marrow, Lin-Pos Fraction et Lin-Neg Fraction.</li>
	<li>Procéder à la division égale du contenu du tube Total Bone Marrow en six tubes stériles en polystyrène de 5 mL. Étiquetez les tubes avec les chiffres 1 à 6.</li>
	<li>Procédez à l’étiquetage du tube Lin-Pos Fraction avec le chiffre 7.</li>
	<li>Procédez à la division du contenu du tube Lin-Neg Fraction comme suit.<ol>
<li>Transférer 50 μL dans un tube stérile en polystyrène de 5 mL contenant 250 μL de PBS-2% NBCS stérile. Ensuite, divisez son contenu également en 3 tubes stériles en polystyrène de 5 mL. Étiquetez ces tubes avec les chiffres 8-10.</li>
		<li>Les 450 μL restants de suspension de cellules de fraction Lin-Neg correspondent au tube portant le numéro 11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter les anticorps aux tubes comme décrit dans le tableau 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tube</td>
			<td>Étiquette</td>
			<td>Cocktail d’anticorps</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Moelle osseuse totale</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Contrôle non taché</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Contrôle à simple taché</td>
			<td>CD45-FITC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Contrôle à simple taché</td>
			<td>CD45-PE (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Contrôle à simple taché</td>
			<td>TER119-APC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Contrôle à simple taché</td>
			<td>CD45-PECy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Contrôle à simple taché</td>
			<td>BIOTINE CD45-APC-Cy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Lin-Pos Fraction</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Contrôle à simple taché</td>
			<td>Contrôle à simple taché. Streptavidine-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Lin-Neg Fraction</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Contrôle FMO FITC</td>
			<td>c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Contrôle FMO PE</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Contrôle FMO PECy7</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + Streptavidine-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Tube positif pour le tri</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2.
<ol start="6"><li>Incuber sur de la glace pendant 30-45 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver les cellules avec du PBS-2% NBCS stérile par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Resuspendez les pastilles de cellules comme suit.<ol>
<li>Pour les tubes 1 à 10, resuspendez la pastille dans 300 μL de PBS-2% NBCS stérile complété par 7AAD (2,5 μg/mL final) (PBS-7AAD). ATTENTION : Le 7AAD est un intercalant ADN et doit donc être manipulé avec un EPI (gants) approprié.</li>
		<li>Pour le tube 11, resuspendez la pastille dans du PBS-7AAD stérile à une concentration maximale de 5 x 106 cellules par mL et un volume minimum de 1 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer deux tubes de collecte de polypropylène étiquetés MEP et MKp contenant 2 mL de PBS-2% NBCS. REMARQUE: Alternativement, les cellules peuvent être collectées dans un milieu de culture ou un tampon de lyse cellulaire en fonction de l’application ultérieure pour les cellules triées. L’utilisation de tubes en polystyrène n’est pas recommandée en raison d’interférences possibles avec les gouttelettes chargées contenant les cellules d’intérêt.</li>
	<li>Gardez tous les tubes sur la glace dans l’obscurité.</li>
	<li>Passez à la configuration du trieur de cellules.<ol>
<li>Utilisez les tubes 1 à 7 pour régler la tension et la compensation, les tubes 7 à 10 pour déterminer les portes de tri pour les populations cellulaires d’intérêt et le tube 11 pour le tri cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Les premières étapes de la stratégie de gating visent à exclure les doublets et les cellules mortes de l’analyse, comme décrit à la figure 3. Identifiez des cellules viables uniques et affichez le diagramme à points SSC-vs Lin-APC-Cy7 pour confirmer l’efficacité de l’épuisement de la lignée. À partir des cellulesLin- une porte est définie pour sélectionner les cellules positives pour c-kit et négatives ou dim pour Sca-1 et CD16/32. Un diagramme à points d’expression CD9 vs CD150 pour les cellules sélectionnées permet d’identifier quatre populations. REMARQUE: Les cellules MEP et MKp sont toutes deux positives pour CD150. Trois niveaux d’expression pour CD9 peuvent être définis (neg, dim et high). MKp exprime un niveau élevé de CD9 et MEP exprime CD9 à un niveau d’intensité de fluorescence intermédiaire. La population MEP correspond à Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9dim et la population MKp correspond à Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9lumineux. La discrimination entre les populations CD9 élevées et CD9 faibles pour les cellules CD150 positives est établie en fonction du niveau maximal d’expression de CD9 dans la population CD150 négative. Une souris donne généralement 5,3 ± 0,6 x 103 MKp et 27,2 ± 2,4 x 103 MEP.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La méthode décrite dans cet article permet l’extraction et la purification de MEP et MKp de souris. Un paramètre important dans l’optimisation du protocole était d’obtenir un nombre suffisant de cellules qui seraient compatibles avec la plupart des essais moléculaires et cellulaires. La pratique générale de la collecte d’os de souris pour l’extraction de cellules hématopoïétiques consiste généralement à prélever à la fois les fémurs et les tibias de chaque souris. L’os pelvien, autre source de matériel hématopoïétique, e...

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<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes. Ces grandes cellules polyploïdes sont situées dans la moelle osseuse et comme pour toutes les cellules sanguines, elles sont dérivées de cellules souches hématopoïétiques (CSH)1. La voie classique de production de mégacaryocytes dans la moelle osseuse provient du HSC et implique la génération de différents progéniteurs qui restreignent progressivement leur potentiel de différenciation2. Le premier progéniteur signant l’engagement envers la lignée mégacaryocytaire est le Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), un progéniteur bipotent capable de produire à la fois des cellules érythroïdes et des mégacaryocytes3,4,5. Le MEP produit alors un progéniteur/précurseur unipotent (MKp) qui va se différencier en un mégacaryocyte mature capable de produire des plaquettes. Les mécanismes impliqués dans la génération de ces progéniteurs, ainsi que leur différenciation et leur maturation en mégacaryocytes sont complexes et seulement partiellement compris. En outre, l’hétérogénéité de la population de MEP en termes de potentiel de différenciation et le niveau d’engagement intrinsèque de ces cellules ne sont pas encore clairs. Pour déchiffrer ces processus, il est essentiel d’obtenir (ou d’avoir accès à) des populations purifiées de MEP et de MKp pour des analyses moléculaires fines et unicellulaires.
Plusieurs études ont démontré des combinaisons particulières de marqueurs de surface cellulaire pour l’identification des progéniteurs engagés dans la lignée mégacaryocytaire chez la souris6,7,8. À partir de ceux-ci, une méthode a été conçue permettant la purification du MEP et du MKp à partir de souris. Cette méthode a été optimisée pour obtenir des cellules en nombre et en qualité adéquats pour un grand nombre d’essais. Avec des considérations éthiques à l’esprit, et afin de minimiser le nombre d’animaux impliqués dans les expériences, nous avons obtenu de prélever la moelle osseuse du fémur et du tibia, ainsi que de la crête iliaque. Cet os contient une fréquence et un nombre élevés de progéniteurs hématopoïétiques et est la plupart du temps endommagé lors de la récolte d’os longs. Présenté ici est une méthode détaillée pour la collecte fiable de cet os.
Le deuxième critère d’optimisation est de produire des populations cellulaires hautement purifiées. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une méthode de choix afin d’obtenir des populations purifiées de cellules d’intérêt. Cependant, de faibles rendements sont atteints lorsque la population cellulaire d’intérêt est très rare. Des procédures d’enrichissement sont donc nécessaires. Dans ce protocole, une procédure de sélection négative a été choisie à l’aide de billes magnétiques.

<table><tbody><tr><td>Aiguilles de calibre 21</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Gr-1-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>Désappauvrissement magnétique</td></tr><tr><td>Anticorps B220-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td>Désappauvrissement magnétique</td></tr><tr><td>Anticorps Mac-1-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>Magnétique appauvrissement</td></tr><tr><td>Anticorps CD3e-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>Épuisement magnétique</td></tr><tr><td>Anticorps CD4-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>Épuisement magnétique</td></tr><tr><td>Anticorps CD5-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>Épuisement magnétique</td></tr><tr><td>Anticorps CD8a-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>Épuisement magnétique</td></tr><tr><td>Anticorps TER119-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>Désappauvrissement magnétique</td></tr><tr><td>Anticorps CD127-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>Déplétion magnétique</td></tr><tr><td>Anticorps CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps CD45-biotine</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps&nbsp ; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps CD16/32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Anticorps CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Milieu de culture StemSpan-SFEM Stemcell</td><td>technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de dissection</td><td>Fisher Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>vWR Chemicals</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Euronexia</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre pasteur</td><td>Dutscher</td><td>42011</td><td></td></tr><tr><td>Aimant :&nbsp ; DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Perles magnétiques : Dynabeads Mouton Anti-Rat IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Megacult</td><td>Stemcell technologies</td><td>#04970</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>Stemcell technologies</td><td>#03436</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau nouveau-né</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>Lyse des globules rouges solution</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Fisher Scientific</td><td>12308009</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>Seringues stériles de 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Tubes stériles de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Tubes stériles de 5 mL en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubes stériles en polystyrène de 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Tubes stériles avec 70&micro ; Capuchon de filtre</td> cellulaire <td>m Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri stérile</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>554063</td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>Rouleau tubulaire</td><td>Benchmark Scientific</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Les mégacaryocytes de la moelle osseuse sont de grandes cellules polyploïdes qui assurent la production de plaquettes sanguines. Ils proviennent de cellules souches hématopoïétiques par le biais de la mégacaryopoïèse. Les dernières étapes de ce processus sont complexes et impliquent classiquement les progéniteurs bipotents mégacaryocytes-érythrocytaires (MEP) et les progéniteurs mégacaryocytaires unipotents (MKp). Ces populations précèdent la formation de mégacaryocytes de bonne foi et, à ce titre, leur isolement et leur caractérisation pourraient permettre une analyse robuste et impartiale de la formation de mégacaryocytes. Ce protocole présente en détail la procédure de collecte des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris, l’enrichissement des progéniteurs hématopoïétiques par épuisement magnétique et enfin une stratégie de tri cellulaire qui donne des populations de MEP et de MKp hautement purifiées. Tout d’abord, les cellules de la moelle osseuse sont prélevées sur le fémur, le tibia et la crête iliaque, un os qui contient un grand nombre de progéniteurs hématopoïétiques. L’utilisation d’os de la crête iliaque augmente considérablement le nombre total de cellules obtenues par souris et contribue ainsi à une utilisation plus éthique des animaux. Une déplétion de la lignée magnétique a été optimisée à l’aide de billes magnétiques de 450 nm permettant un tri cellulaire très efficace par cytométrie en flux. Enfin, le protocole présente la stratégie d’étiquetage et de contrôle pour le tri des deux populations de progéniteurs mégacarytaires hautement purifiés : MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) et MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Cette technique est facile à mettre en œuvre et fournit suffisamment de matériel cellulaire pour effectuer i) la caractérisation moléculaire pour une connaissance plus approfondie de leur identité et de leur biologie, ii) les tests de différenciation in vitro, qui permettront de mieux comprendre les mécanismes de maturation des mégacaryocytes, ou iii) les modèles in vitro d’interaction avec leur microenvironnement.

L’analyse phénotypique des cellules identifiées comme MEP et MKp a été réalisée par cytométrie en flux. Les cellules ont été marquées avec des anticorps conjugués par fluorescence contre CD41a et CD42c, marqueurs classiques des lignées mégacaryocytaires et plaquettaires. Les deux marqueurs ont été exprimés par les cellules de la population MKp alors que ces marqueurs ne sont pas encore détectés à la surface des cellules de la population MEP (Figure 4Ai, 4Aii). La polyploïdie...

Cette méthode décrit la purification par cytométrie en flux de MEP et de MKp à partir de fémurs, de tibias et d’os pelviens de souris.

Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

L’isolement des populations clés de progéniteurs de mégacaryocytes permet une analyse fine de la hiérarchie de la lignée en culture cellulaire sur des tests moléculaires, jusqu’au niveau de la cellule unique. Ce protocole combine une pratique plus éthique en minimisant le nombre d’animaux requis, dans un processus efficace pour le tri cellulaire des populations de MEP et de MKP. Pour l’os, la collecte pulvérise le corps d’une souris C57 noire six âgée de huit à 12 semaines, avec 70% d’éthanol.Utilisez des ciseaux pour faire une incision de cinq à un centimètre de la peau, perpendiculaire à la colonne vertébrale. Et déchirer la peau autour de tout le corps, en la tirant vers le bas. Placez la souris face vers le bas sur le coussinet de dissection, puis localisez les os pelviens en faisant glisser des doigts ou des ciseaux, le long de la colonne vertébrale exposée, de haut en bas.Pour localiser la crête iliaque, identifiez la petite bosse dans la région lombaire près des membres postérieurs. Après avoir placé les ciseaux parallèlement à la colonne vertébrale, contre les vertèbres et près de la bosse de la crête iliaque, procédez à couper les muscles le long du côté de la colonne vertébrale au-dessus de l’os pelvien, en faisant glisser les ciseaux le long des vertèbres, jusqu’à la queue. Ensuite, coupez entre les vertèbres et la crête iliaque, en restant aussi près que possible des vertèbres.Et coupez les muscles restants pour détacher le membre du corps. Transférez les membres détachés sur une surface propre. Après avoir jeté le reste du corps conformément aux directives de l’établissement, utilisez des forceps et des scalpels pour exposer les os pelviens, fémoraux et tibiaux, en enlevant les tissus environnants.Utilisez une pince pour maintenir l’extrémité distale du fémur et disloquez soigneusement la tête fémorale de l’os pelvien, en tranchant doucement les muscles autour de l’articulation avec un scalpel. Grattez le muscle restant de l’os pelvien et coupez au milieu de la cavité qui maintenait la tête fémorale. Conservez l’ilium et jetez le côté mince triangulaire de l’os.À l’aide d’un scalpel, retirez les tissus résiduels autour de l’ilium et placez l’os nettoyé dans du PBS stérile complété par du sérum de veau nouveau-né à 2%. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le pied de la jambe à la cheville. En tenant la partie inférieure du tibia avec la pince, grattez le muscle vers le genou.Jetez le péroné. Ensuite, faites une coupe à travers le plateau tibial avec le scalpel et placez le tibia dans pbS stérile 2% NBCS. Après avoir enlevé les tissus résiduels autour du fémur, tenez la face supérieure du fémur avec une pince et placez la lame du scalpel à la base de la rotule.Appliquez une force vers la rotule, parallèlement au fémur pour détacher la rotule. Placez ensuite le fémur, dans pbS stérile 2% NBCS. Dans une armoire à flux laminaire, transférer les os dans une boîte de Petri stérile remplie de PBS stérile à 2% NBCS.Utilisez un scalpel pour couper la tête des fémurs. Remplissez une seringue d’un millilitre avec du PBS stérile à 2 % NBCS et fixez une aiguille de calibre 21 à la sortie. Remplissez ensuite un tube en polypropylène de cinq millilitres avec deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS.En tenant le fémur avec une pince, insérez l’aiguille dans la rainure gauche, après le retrait de la rotule en appliquant une rotation, en veillant à ce que l’aiguille soit complètement insérée dans l’os, jusqu’au biseau. Après l’insertion de l’aiguille, transférer l’os avec l’aiguille dans le tube contenant deux millilitres de PBS 2% NBCS. Ensuite, distribuez et aspirez le PBS 2% NBCS, de la seringue jusqu’à ce que l’os soit clair.Retirez l’aiguille du fémur et insérez-la dans le trou du côté opposé, où se trouvait la tête du fémur. Après avoir distribué et aspiré le tampon, jetez l’os. Pour la crête iliaque et le tibia, utilisez une pince pour maintenir l’os et insérez doucement l’aiguille dans le côté ouvert, en appliquant une rotation.S’assurer que l’aiguille est complètement insérée dans l’os, jusqu’au biseau. Ensuite, transférez l’os avec l’aiguille dans le tube contenant deux millilitres de PBS 2% NBCS. Distribuer et aspirer le PBS 2% NBCS de la seringue jusqu’à ce que l’os soit clair.Passez toute la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine cellulaire de 40 microns, placé sur un tube stérile en polystyrène de cinq millilitres, et ajoutez 500 microlitres de PBS 2% NBCS. Réserver 100 microlitres de la suspension cellulaire sous forme de moelle osseuse totale. Ensuite, stockez-le sur de la glace pour la procédure de coloration.Pelleter la suspension filtrée par centrifugation. Après avoir jeté le surnageant, ressuspendez la pastille dans un cocktail d’anticorps primaires fraîchement préparé, avec l’incubation sur glace, pendant 30 à 45 minutes. Mettez de côté 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube stérile de cinq millilitres en polystyrène, étiqueté Lin Pores Fraction, et ajoutez 90 microlitres de PBS 2% NBCS.Pendant ce temps, préparez les perles à l’épuisement magnétique, en les remettant en désessépère dans le flacon, avec un vortex complet pendant 30 secondes. Transférer un volume de billes correspondant à deux perles par cellule cible, dans un tube en polypropylène de cinq millilitres, et laver les perles deux fois, avec PBS 2%NBCS, en plaçant le tube sur l’aimant. Après avoir retiré le tampon de lavage avec une pipette pasteur en verre stérile, resuspendez les billes dans 500 microlitres de PBS stérile 2% NBCS.Pour la première étape de l’épuisement magnétique, ajoutez 250 microlitres de perles sur la pastille de cellules lavées et incubez en mélangeant doucement pendant cinq minutes sur de la glace. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS, avec un mélange doux, et placez le tube dans l’aimant pendant deux minutes. Procéder à la collecte de la fraction non magnétique avec une pipette pasteur en verre stérile.Et pour la deuxième étape de l’épuisement magnétique, ajoutez-le aux 250 microlitres restants de perles magnétiques. Placez le tube scellé avec de la paraffine sur un rouleau à tube, pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS avec un mélange doux.Et placez le tube avec l’aimant pendant deux minutes. Recueillir la fraction non magnétique dans un tube stérile en polypropylène de cinq millilitres, étiqueté, fraction Lin Neg non magnétique, avec une pipette de pastreur en verre stérile, et procéder au tri cellulaire des progéniteurs de mégacaryocytes, comme décrit dans le manuscrit du texte. Pour la stratégie de contrôle du tri cellulaire, dans la population de Lin Neg, les cellules exprimant C-kit et une expression faible ou nulle de l’antigène Sca-1 ou CD16/32 sont sélectionnées.Dans cette population, les MEP sont identifiés comme des cellules CD150 positives et CD9 dim. Le MKP comme CD150 positif, et CD9 cellules lumineuses. Dans l’analyse représentative de cytométrie en flux, les cellules identifiées comme MEP et Mkp ont été marquées avec des anticorps conjugués par fluorescence pour CD41a et des marqueurs classiques CD42c des lignées mégacaryocytaires et plaquettaires.Les deux marqueurs ont été exprimés par les cellules de la population MKp et n’ont pas été détectés à la surface des cellules de la population MEP. La teneur en ADN des mégacaryocytes triés a démontré que les cellules sont principalement 2n pour la population MEP. Et une petite partie des cellules MKp sont étrangères.Des cellules de ploïdie plus élevées n’ont pas été détectées de manière significative dans ces populations. Dans les essais clonogènes semi-solides, l’UFC-MK a été détectée dans les populations de MEP et de MKp. Le BFU-E n’a pas été détecté dans la population de MKp, mais détecté dans le MEP et la population de cellules progéniteurs CD9 CD9 négatifs CD150.L’observation microscopique du troisième jour de différenciation, montre que MEP et MKp ont produit principalement des mégacaryocytes, identifiés comme de grandes cellules. Les mégacaryocytes obtenus après trois jours de culture ont été identifiés à l’aide de l’expression de CD41 et CD42c et représentent respectivement 54 et 82 % des cellules produites à partir de populations de cellules MEP et MKp. La ploïdie des mégacaryocytes produits était plus grande à partir du mégacaryocyte dérivé de la population MKp, par rapport à la population MEP.Seules les cellules dérivées de la population MKp étaient capables d’émission de proplaquettaires, suggérant un stade de maturation plus avancé pour la population MKp. L’utilisation de l’os pelvien augmente considérablement le nombre de cellules, tandis que l’épuisement magnétique en deux étapes améliore l’efficacité de l’épuisement de la lignée. Ce protocole permet la culture ultérieure d’une population de cellules uniques MEP et MKp, qui, avec l’analyse transcriptomique et protéomique, devra certainement déchiffrer les mécanismes impliqués, mis en œuvre la biogenèse.

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Biologie

Méthode pour la dissociation enzymatique, l'étiquetage de surface et de la purification par cytométrie en flux de fibro / adipogéniques et les progéniteurs myogéniques du muscle squelettique murin.

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

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Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

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Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

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Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

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