Name: Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Découvrez une méthode optimisée pour isoler des cellules CD34+ à partir de filtres de leucodeplétion et les différencier en mégacaryocytes matures capables de libérer des plaquettes fonctionnelles.

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Ce travail a été soutenu par la subvention ANR (Agence Nationale de la Recherche) ANR- 17-CE14-0001-1.

Des échantillons humains témoins ont été obtenus auprès de donneurs de sang volontaires qui ont donné leur consentement éclairé écrit recruté par le centre de transfusion sanguine où la recherche a été effectuée (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Toutes les procédures ont été enregistrées et approuvées par le ministère Français de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et enregistrées sous le numéro AC_2015_2371.Les donneurs ont donné leur approbation dans le formulaire de consentement CODHECO numéro AC- 2008 - 562, afin que les échantillons soient utilisés à des fins de recherche. Des études humaines ont été réalisées conformément à la déclaration d’Helsinki.
1. Extraction et sélection des cellules CD34+ (HP) de LRF
<ol><li>
Préparation du réactif (pour un LRF)<ol>
<li>Préparer 25 mL de tampon d’élution filtré : 21,25 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 2,5 mL d’acide-citrate-dextrose (ACD) et 1,25 mL de sérum fœtal bovin (FBS) décomplémenté. Filtrer à 0,22 μm et placer à 37 °C.</li>
		<li>Préparer 500 mL de PBS avec 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).</li>
		<li>Disposer de 25 mL de milieu de gradient de densité (DGM) (1,077 g/mL) dans deux tubes de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Modalités de rinçage à contre-courant LRF (Figure 1) REMARQUE: Cette étape nécessite une machine de soudage de tubes stériles, permettant la connexion stérile de tubes thermoplastiques.<ol>
<li>Tout d’abord, connectez le LRF à un sac de transfert vide de 600 mL et le LRF à un jeu de tubes (Figure 1A). Sous l’armoire de biosécurité, injecter le volume total de tampon d’élution filtré et préparé correspondant au nombre de LRF manipulés (xLRF x 25 mL) dans le sac vide. Ensuite, à l’aide d’une seringue de 30 mL pour aspirer doucement tout le contenu du sac à travers le LRF, rinçez à nouveau et transférez les cellules dans un nouveau tube de 50 mL(Figure 1B).</li>
		<li>Pour la sédimentation des globules rouges, diluer la suspension cellulaire de moitié avec Duxtran 2% et bien mélanger pour agréger les globules rouges. Attendez 30 min à température ambiante (RT).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62499/62499fig01.jpg"> Figure 1: Modalités de rinçage arrière du LRF. (A) Schéma représentatif de (i) la connexion stérile du sac de transfert au LRF et (ii) le jeu de tubes au LRF. (B) Schéma représentatif de la connexion des seringues pour la collecte des cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62499/62499fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="3"><li>
Collection PBMC
	<ol>
<li>Après la sédimentation des globules rouges, retirez et transférez le surnageant dans un tube de 50 mL et remplissez-le de PBS-EDTA 2 mM. Superposez doucement le surnageant sur le DGM préparé ci-dessus. Laissez le surnageant s’écouler doucement sans casser le plan de surface du gradient de densité. Centrifuger à 400 x g à RT pendant 30 min en mode arrêt des freins.</li>
		<li>Collectez la couche PBMC à l’éventrante à l’éventreuse. Transférez les cellules de chaque tube DGM dans un nouveau tube stérile de 50 mL. Remplissez chaque tube avec PBS-EDTA 2 mM et lavez deux fois en 50 mL de PBS-EDTA 2 mM à 200 x g pendant 10 min à RT en mode freinage.</li>
		<li>Pipette et mise en commun de la pastille de cellule avec 50 mL PBS-EDTA 2 mM. REMARQUE: Il est possible d’arrêter la procédure en maintenant les cellules collectées sous agitation à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, filtrez la suspension avec une passoire cellulaire de 40 μm pour éliminer les agrégats formés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sélection des cellules CD34+
	<ol>
<li>Déterminez le nombre de cellules et centrifugez à 400 x g à température ambiante pendant 10 minutes avec la pause activée.</li>
		<li>Aspirer complètement le surnageant et le remise en caisse dans le volume approprié de PBS-EDTA 2 mM détaillé par le fabricant du kit de sélection CD34 (300 μL de PBS-EDTA pour 108 cellules). Ajouter le réactif bloquant fcR et les microbilles CD34 à la concentration appropriée (50 μL pour 108 cellules).</li>
		<li>Après 30 min à 4 °C, laver la suspension de la cellule et la remise en suspension dans le volume approprié de PBS-EDTA 2 mM détaillé par le fabricant du kit de sélection CD34 (500 μL pour 108 cellules). REMARQUE: La sélection est faite sur les colonnes de tri pour le passage de maximum 2 x 109 cellules par colonne.</li>
		<li>Passez l’échantillon sur la colonne humide de l’aimant. Laver deux fois avec 3 mL de PBS-EDTA 2 mM et éluer les cellules avec 5 mL de PBS-EDTA 2 mM. Une deuxième exécution sur une nouvelle colonne suivant la même procédure est nécessaire pour améliorer la pureté de l’échantillon. REMARQUE : Nombre prévu de 6,1 x 105 cellules/LRF (Figure 2A). Pour des nombres de LRF plus élevés, augmentez les réactifs et les méthodes en conséquence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Évaluation de la pureté des cellules CD34+
	<ol>
<li>Ajouter à une aliquote de 100 μL de suspension obtenue après la sélectionCD34+, 2 μL d’anticorps CD34-PE humain ou 2 μL d’IgG-PE (témoin). Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 °C.</li>
		<li>Lavez les cellules en ajoutant 2 mL de PBS et centrifugez à 400 x g pendant 5 min. Aspirer complètement le surnageant et le rétablir dans 200 μL de PBS.</li>
		<li>Analyser la pureté par cytométrie en flux comme le montre la figure 2A et la discussion. REMARQUE: Une pureté des cellules CD34+ supérieure à 90% est attendue (Figure 2Bii).</li>
		<li>Utilisez les cellules CD34+ directement ou congelez-les pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Congélation de cellules CD34+ REMARQUE: La congélation des cellules CD34+ se fait à une densité de 106 cellules par mL.<ol>
<li>Après la détermination du nombre de cellules CD34+, préparer les milieux de cryoconservation suivants : (1) 60 % Stemspan + 40 % FBS, (2) 40 % Stemspan + 40 % FBS + 20 % Dimethyl Sulfoxide (DMSO) et permettre le refroidissement à 4 °C.</li>
		<li>Centrifuger les cellules CD34+ à 400 x g à température ambiante pendant 5 min et resuspender la pastille dans une solution froide 1 puis l’ajouter immédiatement à la solution froide 2 (v/v).</li>
		<li>Placez immédiatement les cryotubes dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h, puis transférez les cryotubes dans le réservoir d’azote liquide.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Culture et différenciation de cellules CD34+ pour produire des mégacaryocytes matures porteurs de proplaquettaires
REMARQUE: Le protocole de culture cellulaire(Figure 3A),schéma représentatif de la procédure de culture cellulaire sont détaillés dans cette section.
<ol><li>
Décongélation des cellules CD34+ (si nécessaire)
	<ol>
<li>Préparer la solution de décongélation : 13 mL de PBS-20 % FBS et placer à 37 °C pendant 15 min. Transférez rapidement les cryotubes dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à un seul petit cristal de glace. Sous l’armoire de culture biologique, pipetter tout le contenu et transférer lentement dans 13 mL de solution de décongélation pré-avertie.</li>
		<li>Déterminez le nombre de cellules et la viabilité des cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocole culturel, étape 1 : du jour 0 au jour 7 NOTE: Habituellement, les cultures sont faites dans des plaques de 24 puits avec 1 mL de milieu par puits à une densité de 40 000 cellules viables / mL, correspondant à 20 000 cellules viables / cm2. Il est crucial de respecter cette densité si une mise à l’échelle est prévue.<ol>
<li>Préparation du milieu de croissance : Dans les milieux d’expansion des cellules hématopoïétiques sans sérum (préalablement chauffés à 37 °C), ajouter la pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG) 1x, la lipoprotéine de basse densité humaine (hLDL) à 20 μg/mL, le cocktail de cytokines d’expansion mégacarytaire 1x et la stemrégénine 1 (SR1) à 1 μM.</li>
		<li>Ensemencement cellulaire : Centrifuger les cellules CD34+ décongelées à 400 x g à température ambiante pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant et ressuspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture et effectuez une numération cellulaire et une viabilité pour déterminer le volume approprié pour ensemencer les cellules.</li>
		<li>Centrifuger les cellules 400 x g à température ambiante pendant 5 min et ressuspender la pastille dans le volume approprié du milieu de croissance chaud. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 7 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocole de culture, étape 2 : du jour 7 au jour 13(Figure 3B,images représentatives au jour 13) NOTE: Habituellement, les cultures sont faites dans des plaques de 24 puits avec 1 mL de milieu par puits à une densité de 50 000 cellules viables / mL, correspondant à 25 000 cellules viables / cm². Il est crucial de respecter cette densité si une mise à l’échelle est prévue.<ol>
<li>Préparation du milieu de maturation : Dans les milieux d’expansion des cellules hématopoïétiques sans sérum (préalablement chauffés à 37 °C), ajouter PSG 1x, hLDL à 20 μg/mL, TPO à 50 ng/mL et SR1 à 1 μM.</li>
		<li>Examinez les cellules au microscope. Au jour 7, les cellules présentent un aspect rond et homogène en remplissant les puits ou les flacons sans être trop confluentes.</li>
		<li>Sous une armoire de biosécurité, transférez doucement les cellules dans un tube de 15 mL. Lavez les puits avec PBS. Ensuite, déterminez le nombre de cellules et leur viabilité pour calculer le volume approprié pour ensemencer les cellules.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 400 x g à température ambiante pendant 5 min. Retirez le surnageant et ressuspendez les cellules dans le volume approprié de milieu chaud calculé à l’étape précédente. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 pendant 6 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Libération plaquettaire cultivée au jour 13
	<ol>
<li>Ajouter 0,5 μM de prostaglandineI2 (IGP2) et 0,02 U/mL d’apyrase à la culture et effectuer cinq fois le pipetage successif avec une pipette de 1 mL. REMARQUE: Les plaquettes sont maintenant libérées dans le milieu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse par cytométrie en flux (phénotypage MK et numération plaquettaire cultivée)
REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué au phénotypage des cellules les jours de culture sélectionnés. Il permet également de déterminer le nombre de la libération plaquettaire cultivée (Figure 4A,B).
<ol><li>
Préparation à l’analyse MK
	<ol>
<li>Étiquetez quatre ensembles de tubes de microcentrifugation comme suit : Cellules non étiquetées comme témoin, cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellules + 5 μL CD34 - PECy7, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Utilisez un minimum de 1,105 cellules par tube, ne dépassez pas 1,106 cellules par tube. Ajouter à 100 μL de suspension cellulaire par tube de cytométrie et les différents anticorps. Incuber dans l’obscurité pendant 30 min à 4 °C.</li>
		<li>Ensuite, ajoutez 2 mL de PBS-EDTA 2 mM par tube et centrifugez à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Pendant la centrifugation, préparer une solution de PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycine-D (7AAD) (1/100), prévoir une solution de 300 μL par tube.</li>
		<li>Retirez le surnageant et prenez la pastille dans 300 μL de PBS-EDTA 2 mM avec 7AAD. Faire passer les échantillons dans le cytomètre en flux dans les 30 minutes. REMARQUE : La stratégie d’analyse de la cytométrie en flux est illustrée à la figure 3C et dans la discussion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de tubes pour l’analyse plaquettaire en culture
	<ol>
<li>Étiquetez quatre ensembles de tubes de microcentrifugation comme suit : Cellules non étiquetées comme témoin, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellules + 20 μL CD42a - PE, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Après cinq pipetages successifs dans un puits de culture, transférer 300 μL de la suspension dans un tube pour cytométrie contenant un nombre étalonné de billes fluorescentes.</li>
		<li>Ajouter les anticorps et incuber dans l’obscurité à TA pendant 30 min.</li>
		<li>Passez les échantillons à travers le cytomètre en flux dans les 30 minutes et réglez l’acquisition pour le passage de 5 000 perles. REMARQUE : La stratégie d’analyse de la cytométrie en flux est illustrée à la figure 4B et dans la discussion.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>de Sauvage, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+megakaryocytopoiesis+and+thrombopoiesis+by+the+c-Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.</a> Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).</li>
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<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulence+activates+platelet+biogenesis+to+enable+clinical+scale+ex+vivo+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production.</a> Cell. 174 (3), 636-648 (2018).</li>
<li>Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode de production de MK capable d’émettre des proplaquettaires à partir de HP d’origine sanguine et de libérer des plaquettes du milieu de culture. Les HP sont obtenus à partir de LRF, un sous-produit des banques de sang, utilisé pour éliminer les leucocytes contaminants des produits sanguins cellulaires et éviter les effets indésirables. Bien que cette méthode soit relativement simple, quelques points méritent une attention particulière.
Le dépôt de la suspension c...

Les plaquettes sanguines proviennent de grandes cellules polyploïdes spécialisées, les mégacaryocytes (MK), qui proviennent d’un processus de production constant et affiné connu sous le nom de mégacarylopoïèse (MKP). Au sommet de ce processus se trouvent les cellules souches hématopoïétiques qui, au contact de l’environnement de la moelle osseuse (cytokines, facteurs de transcription, niche hématopoïétique), seront capables de proliférer et de se différencier en progéniteurs hématopoïétiques (HP) capables de s’engager vers la voie mégacaryocytaire, donnant naissance à des MK immatures1. Sous l’influence de diverses cytokines, et en particulier de la thrombopoïétine (TPO), qui est la cytokine majeure de MKP; le MK subira alors deux grandes étapes de maturation : l’endomitose et le développement de membranes de démarcation (DMS). Ce MK complètement mature apparaît alors à proximité d’un vaisseau sinusoïdal dans lequel il peut émettre des extensions cytoplasmiques, les proplaquettaires, qui seront libérées sous le flux sanguin puis remodelées en plaquettes fonctionnelles2. Le clonage du TPO en 19943 a donné un coup de pouce à l’étude du MKP en accélérant le développement de techniques de culture in vitro permettant la différenciation HP et la maturation du MK.
Il existe de nombreuses pathologies affectant les plaquettes sanguines, à la fois en termes de nombre de plaquettes (augmentation ou diminution) et de fonction4,5. Être capable de récapituler la MKP in vitro à partir de HP humaine pourrait améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ce processus et, en fin de compte, la prise en charge thérapeutique des patients.
Diverses sources de HP humaine conviennent: sang de cordon, moelle osseuse et sang périphérique6,7,8. La récolte de HP dans le sang périphérique soulève moins de problèmes logistiques et éthiques que leur récupération du sang de cordon ombilical ou de la moelle osseuse. HP peut être récupéré de la leucaphérèse ou du pelage bouffant, mais ces sources sont coûteuses et pas toujours disponibles dans les centres de transfusion sanguine. D’autres protocoles, moins coûteux et plus faciles à réaliser, permettent la récupération directe des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) sans qu’il soit nécessaire de s’isoler préalablement par CD344,8. Cependant, la pureté des mégacaryocytes n’est pas satisfaisante avec cette méthode et une sélection de cellules CD34+ de PBMC est recommandée pour une différenciation optimale en MK. Cela nous a amenés à mettre en œuvre une purification HP à partir de filtres de leucoréduction (LRF), couramment utilisés dans les banques de sang pour éliminer les globules blancs et ainsi éviter les réactions immunologiques indésirables9. En effet, depuis 1998, les concentrés de plaquettes sont automatiquement leucodés en France. À la fin de ce processus, les LRF sont jetés et toutes les cellules retenues dans le LRF sont détruites. Les cellules des LRF sont donc facilement disponibles sans frais supplémentaires. Les LRF ont un contenu cellulaire proche de celui obtenu par leucaphérèse ou dans des couches bouffantes, notamment dans leur composition en CD34+ HP ce qui en fait une source remarquablement attrayante10. Il a déjà été démontré que le LRF en tant que source HP humaine fournit aux cellules des capacités fonctionnelles intactes11. Cette source a l’avantage d’être abondante et abordable pour la recherche en laboratoire. Dans ce contexte, cet article décrit successivement : i) l’extraction et la sélection de CD34+ HP à partir de LRF ; ii) une culture optimisée en deux phases, qui récapitule l’engagement de HP dans la voie mégacaryocytaire et la maturation de MK capable d’émettre des proplaquettaires; iii) une méthode pour libérer efficacement les plaquettes de ces MK; et iv) une procédure de phénotypage de MK et de plaquettes cultivées.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>558819</td><td></td></tr><tr><td>ACD</td><td>EFS-Alsace</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-PE&nbsp ;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-081-002</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD41-Alexa Fluor 488</td><td>Biolegend</td><td>303724</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD42a-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>559919</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>EFS-Alsace</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Tubes</td><td>BD Bioscience</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit UltraPure, humain&nbsp ;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-100-453</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.OR</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>Compteur ADAM&nbsp ;</td><td>DiagitalBio</td><td>NA</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Dutscher</td><td>55002</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>Dextran de leuconostoc spp&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>31392-50g</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>DMSO Hybri-max&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15575-039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL&nbsp ;</td><td>Dutscher</td><td>616201</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>Unité de filtration Steriflip PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD Bioscience</td><td>Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Human LDL</td><td>Stemcell technologies</td><td>#02698</td><td></td></tr><tr><td>ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL</td><td>Bayer</td><td>MA038EX</td><td></td></tr><tr><td>Inserts</td><td>Fenwal</td><td>R4R1401</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire&nbsp ;</td><td>Holten</td><td>NA</td><td>Produit archivé</td></tr><tr><td>LS Columms&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell</td><td>7861</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp ;</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>PGi2</td><td>Sigma</td><td>P6188</td><td></td></tr><tr><td>Poches de transferts 600ml&nbsp ;</td><td>Macopharma</td><td>VSE4001XA</td><td></td></tr><tr><td>filtres de pré-séparation (30&micro ; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemRegenin 1 (SR1)</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>#72344</td><td></td></tr><tr><td>Supplément d’expansion StemSpan (100x)</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>#02696</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan-SFEM&nbsp ;</td><td>Stemcell technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Durapore 0,22&micro ; m PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>SVF Hyclone&nbsp ;</td><td>Thermos scientifique</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Syringues 30 mL&nbsp ;</td><td>Terumo</td><td>SS*30ESE1</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>Filtres à seringue Millex 0,22&micro ; M PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Stemcell technologies</td><td>#02822</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004 PP</td><td>Ou matériau équivalent</td></tr><tr><td>Tubes 15 mL&nbsp ;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td>PP Ou matière équivalente</td></tr><tr><td>Tubulures</td><td>B Braun</td><td>4055137</td><td>Ou matière équivalente</td></tr></tbody></table>

filtres de leucodeplétion des cellules cd34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

L’expansion et la différenciation in vitro des progéniteurs hématopoïétiques humains en mégacaryocytes capables d’allonger les proplaquettaires et de libérer des plaquettes permettent une étude approfondie des mécanismes sous-jacents à la biogenèse plaquettaire. Les protocoles de culture disponibles sont principalement basés sur des progéniteurs hématopoïétiques dérivés de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical soulevant un certain nombre de préoccupations éthiques, techniques et économiques. S’il existe déjà des protocoles disponibles pour obtenir des cellules CD34 à partir du sang périphérique, ce manuscrit propose un protocole simple et optimisé pour obtenir des cellules CD34+ à partir de filtres leucodéplétion facilement disponibles dans les centres sanguins. Ces cellules sont isolées à partir de filtres de leucodeplétion utilisés dans la préparation de produits de transfusion sanguine, correspondant à huit dons de sang. Ces filtres sont destinés à être jetés. Une procédure détaillée pour recueillir les progéniteurs hématopoïétiques identifiés comme des cellules CD34+ à partir de ces filtres est décrite. La méthode pour obtenir des mégacaryocytes matures prolongeant les proplaquettaires tout en discutant de leur évolution phénotypique est également détaillée. Enfin, le protocole présente une méthode de pipetage calibrée, pour libérer efficacement des plaquettes morphologiquement et fonctionnellement similaires aux plaquettes natives. Ce protocole peut servir de base à l’évaluation des composés pharmacologiques agissant à différentes étapes du processus pour disséquer les mécanismes sous-jacents et approcher les rendements plaquettaires in vivo.

Extraction et sélection de cellules CD34+ à partir de LRF Ici, la méthode, dérivée de Peytour et al.9, décrit l’extraction et la sélection de cellules CD34+ à partir de LRF rejetées disponibles dans les banques de sang après l’élimination des leucocytes. À la suite de la procédure de rinçage arrière, habituellement 1,03 x10 9 ± 2,45 x10 8 cellules/LRF (Moyenne±SEM; n = 155) sont récupérés avec une viabilité de 94,88 ± 0,10 %...

Ce protocole décrit en détail toutes les étapes impliquées dans l’obtention de progéniteurs hématopoïétiques CD34+ dérivés de leucofiltres et leur différenciation et maturation in vitro en mégacaryocytes proplaquettaires capables de libérer des plaquettes dans le milieu de culture. Cette procédure est utile pour l’analyse approfondie des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la mégacaryopoïèse.

Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

Ce protocole propose une méthode simple pour obtenir des progéniteurs hématopoïétiques humains, et pour induire leur différenciation en mégacaryocytes. Elle peut servir de base à une meilleure compréhension de la mégacarylopoïèse Cette technique utilise une source, mais offre l’avantage d’être abordable et abondante pour la recherche en laboratoire sur l’hématopoïèse. Cette méthode est utilisée pour mieux comprendre la mégacaryopoïèse pour la cellule à utiliser dans la thérapie, ils devront être préparés dans les conditions GMP, ce qui n’est pas le cas actuellement.Comprendre les étapes, y compris la collection PBMC, ne peut être complet qu’avec une démonstration visuelle. Avant de commencer une expérience, connectez un filtre de leucoréduction à un sac de transfert vide de 600 millilitres et à un ensemble de tubes. Dans une armoire de biosécurité, injectez 25 millilitres de tampon d’élution filtré par filtre de leucoréduction dans le sac vide et utilisez une seringue de 30 millilitres pour aspirer doucement le contenu du sac à travers le filtre.Transférer les globules rouges prélevés dans un nouveau tube de 50 millilitres et diluer la suspension cellulaire de moitié avec 2% de dextran. Bien mélanger pour agréger les cellules sanguines et laisser les cellules sédimenter pendant 30 minutes à température ambiante. Lorsque les globules rouges se sont déposés, transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres et remplissez le tube avec une solution d’EDTA PBS de deux millimolaires.Superposer doucement la moitié du surnageant sur 25 millilitres de milieu de gradient de densité dans chacun des deux tubes de 50 millilitres sans perturber la surface du gradient et séparer les cellules par centrifugation de gradient de densité. Utilisez une pipette jetable pour transférer les cellules de chaque interface vers un nouveau tube de 50 millilitres. Lavez les cellules deux fois dans 50 millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par lavage.Après le deuxième lavage, ressuspendez les granulés dans un seul volume de 50 millilitres de PBS EDTA frais pour le comptage. Ici, il est possible d’arrêter la procédure en maintenant les cellules collectées sous agitation à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour la sélection des cellules CD34+, déterminez le nombre de cellules et collectez les cellules par centrifugation et ressuspendez la pastille cellulaire dans 300 microlitres de deux millimolaires PBS EDTA par 10 à la huitième cellule.Ajouter le volume approprié de réactif bloquant les récepteurs FC et 50 microlitres de microbilles CD34 par 10 aux huitièmes cellules. Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules avec deux millimolaires PBS EDTA, et resuspendez la pastille dans 500 microlitres de PBS EDTA frais de deux millimolaires, pour 10 aux huit cellules. Humidifiez et dimensionnez correctement la colonne magnétique avec PBS EDTA, puis ajoutez l’échantillon à la colonne.Lavez la colonne deux fois avec trois millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par lavage. Avant d’échapper aux cellules CD34+, avec deux volumes de cinq millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par élution. Pour évaluer la pureté des cellules sélectionnées par la perle magnétique, ajouter deux microlitres d’un anticorps anti CD34 humain approprié à une aliquote de 100 microlitres des cellules isolées et bien mélanger avant l’incubation pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Après l’incubation, laver les cellules dans du PBS et ressuspend la pastille dans 200 microlitres de PBS pour l’analyse de la pureté de l’échantillon cellulaire par cytométrie en flux. Après le comptage, prélever les cellules CD34+ par centrifugation et ressuspender immédiatement la pastille dans une solution froide une à une densité de 10 à six cellules par millilitre avant d’ajouter rapidement la suspension cellulaire à la solution froide deux. Ensuite, placez immédiatement le tube cryogénique dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures avant de transférer le tube cryogénique dans un stockage d’azote liquide.Dans cette étude représentative, les cellules ont été récupérées par filtration de leucoréduction, comme démontré avec une viabilité d’environ 95%. Après sélection des billes magnétiques, une population de cellules CD34+ pure supérieure à 90 % a été obtenue. La prolifération cellulaire diminue généralement après une semaine de culture, mais sans changements significatifs dans la viabilité cellulaire.Au septième jour, les cellules CD34+ devraient commencer à exprimer CD41, un marqueur spécifique et précoce ou pour le développement des mégacaryocytes et des plaquettes. Au jour 10, la majorité des cellules de la culture se développent généralement en mégacaryocytes matures exprimant CD41. Au jour 13, l’extension et la libération plaquettaires pro mégacaryocytaires peuvent être observées par microscopie optique.Le nombre total de plaquettes CD41, CD42, 8 positives libérées dans la culture peut ensuite être quantifié à l’aide d’un nombre étalonné de billes fluorescentes. Cette méthode ouvre la voie à l’amélioration des mécanismes sous-jacents de la mégacaryopoïèse et à l’augmentation des rendements en plaquettes visuelles. Même si cette méthode semble fastidieuse, il est très simple qu’il vous suffit d’être patient et de préparer toutes les régions à l’avance.Bien que nos préoccupations critiques mégacaryopoïèse, nous obtenons des cellules CD42 peuvent être utilisées dans les voies surmatopoïétiques.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Nous décrivons ici l'isolement des cellules souches CD133 exprimer foie et les cellules souches du cancer du foie murin ensemble, un processus qui nécessite la digestion des tissus, l'enrichissement des cellules, et l'isolement de cytométrie en flux. Nous incluent des méthodes pour l'isolement cellulaire de pointe unique et l'expansion clonale.

Isolement des cellules CD133 + Foie souches pour l&#39;expansion clonale

Cette vidéo démontre une technique de différenciation des mégacaryocytes et de formation des plaquettes. Les cellules souches progénitrices hématopoïétiques – isolées du sang de cordon ombilical humain – se différencient en mégacaryocytes matures en présence de thrombopoïétine. Les mégacaryocytes matures produisent des extensions cytoplasmiques appelées proplaquettes, qui donnent naissance à des plaquettes individuelles.

Méthode in vitro pour la différenciation des mégacaryocytes et la formation plaquettaire

Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés par séparation par billes magnétiques des cellules mononucléées du sang périphérique après centrifugation par gradient de densité du sang anticoagulé humain. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains sont différenciés en cellules dendritiques immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

Une population très pure de mégacaryocytes peut provenir de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Une méthode pour CD34+ la différenciation des cellules d’isolement et mégacaryocyte est décrite ici.

Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules+

Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l'effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.

Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

Cette méthode décrit la purification par cytométrie en flux de MEP et de MKp à partir de fémurs, de tibias et d’os pelviens de souris.

Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Ici, nous présentons une stratégie d’immunophenotyping pour la caractérisation de la différenciation de megakaryocyte, et montrons comment cette stratégie permet le tri des megakaryocytes à différentes étapes avec un trieur de cellules fluorescence-activé. La méthodologie peut être appliquée aux tissus primaires humains, mais aussi aux mégacaryocytes générés en culture in vitro.

Immunophénotypage et tri cellulaire des MKs humains provenant de sources primaires humaines ou différenciés in vitro à partir de progéniteurs hématopoïétiques

Un protocole unique et complet pour générer des cellules dendritiques dérivées de monocytes humains désialylés (mo-DCs) à partir de cellules mononucléées isolées du sang périphérique (PBMC) à l’aide d’un traitement à la sialidase est présenté. De plus, des méthodes permettant d’évaluer la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des mo-DC et d’évaluer comment le traitement à la sialidase améliore le niveau de maturation des mo-DC sont décrites.

Génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes avec différents phénotypes sialylés

Découvrez une méthode optimisée pour isoler des cellules CD34+ à partir de filtres de leucodeplétion et les différencier en mégacaryocytes matures capables de libérer des plaquettes fonctionnelles.

Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes (Vidéo) | JoVE Journal

Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes

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