Name: Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Découvrez la culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour étudier l'impact de la rigidité et du confinement mécanique sur leur maturation et la formation de proplaquettes in vitro.

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Les auteurs tiennent à remercier Fabien Pertuy et Alicia Aguilar qui ont initialement développé cette technique en laboratoire, ainsi que Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg) qui a caractérisé les propriétés viscoélastiques de l’hydrogel de méthylcellulose. Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) et par une subvention ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher est récipiendaire de la Fondation pour la Recherche Médicale (frM numéro FDT202012010422).

<ol><li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li>
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<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li>
<li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin+from+beginning+to+end%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li>
<li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li>
<li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Au cours de la décennie précédente, la mécanobiologie a suscité de plus en plus d’intérêt dans de nombreux domaines de la biologie. Il est maintenant communément admis que l’environnement mécanique entourant les cellules joue un rôle dans leur comportement, soulignant l’importance d’étudier comment les mégacaryocytes détectent et réagissent aux signaux mécaniques extracellulaires. Il est difficile de mesurer avec précision la rigidité du tissu de la moelle osseuse in situ11, surtout si l’...

Les cellules du corps subissent un microenvironnement 3D complexe et sont soumises à l’interaction entre les signaux chimiques et mécanophysiques, y compris la rigidité du tissu et le confinement dû aux cellules voisines et à la matrice environnante 1,2,3. L’importance de la rigidité et du confinement pour le comportement cellulaire n’a été reconnue qu’au cours des dernières décennies. En 2006, les travaux fondateurs d’Engler et al. 4 ont mis en évidence l’importance de l’environnement mécanique pour la différenciation cellulaire. Les auteurs ont démontré que la variation de la rigidité du substrat cellulaire entraînait l’orientation des cellules souches vers diverses lignées de différenciation. Depuis lors, l’impact des signaux mécaniques sur le devenir et le comportement des cellules est devenu de plus en plus reconnu etétudié. Bien qu’elle soit l’un des tissus les plus mous de l’organisme, la moelle osseuse a une organisation structurelle 3D qui est confinée à l’intérieur de l’os. La rigidité de la moelle, bien que techniquement difficile à mesurer avec précision, est estimée entre 15 et 300 Pa 5,6. Dans le stroma, les cellules sont étroitement confinées les unes aux autres. De plus, la plupart d’entre eux migrent vers les vaisseaux sinusoïdaux pour entrer dans la circulation sanguine. Ces conditions créent des contraintes mécaniques supplémentaires sur les cellules adjacentes, qui doivent s’adapter à ces forces. Les indices mécaniques représentent un paramètre important dont les conséquences sur la différenciation des mégacaryocytes et la formation de proplaquettaires ont récemment été explorées. Bien que les mégacaryocytes puissent se différencier in vitro en culture liquide traditionnelle, ils n’atteignent pas le degré de maturation observé in vivo,en partie à cause de l’absence des indices mécaniques de l’environnement 3D 7. La croissance des progéniteurs intégrés dans l’hydrogel apporte des indices mécaniques 3D qui manquent dans le milieu liquide.
Les hydrogels sont largement utilisés depuis plusieurs décennies dans le domaine hématologique, notamment pour faire pousser des cellules dans des essais de formation de colonies afin de quantifier les progéniteurs hématopoïétiques. Cependant, de tels hydrogels ont rarement été utilisés pour explorer l’impact biologique de l’environnement mécanique 3D sur la maturation et la différenciation des cellules hématopoïétiques. Au cours des dernières années, notre laboratoire a développé un modèle de culture 3D utilisant un hydrogel 8à base de méthylcellulose. Ce gel physique non réactif est un outil utile pour imiter les contraintes physiques de l’environnement mégacarytaire natif. Il est dérivé de la cellulose par remplacement des résidus hydroxyles (-OH) par des groupes méthoxyde (-OCH3). Le degré de substitution méthylique et la concentration en méthylcellulose déterminent la rigidité de l’hydrogel une fois qu’il s’est jellifié. Au cours de la phase de développement de cette technique, il a été démontré que le module de Young dans la gamme de 30 à 60 Pa est la rigidité optimale du gel pour la croissance des mégacaryocytes 9.
Le protocole suivant décrit une méthode pour cultiver des progéniteurs mégacaryocytaires de souris dans un hydrogel de méthylcellulose 3D. Il a déjà été démontré que par rapport à la culture liquide standard, cette culture d’hydrogel augmente le degré de polyploïdisation des mégacaryocytes, améliore la maturation et l’organisation intracellulaire, et augmente la capacité des mégacaryocytes à étendre les proplaquettaires une fois ressuspendées dans un milieu liquide 9. Ce manuscrit décrit en détail le protocole d’isolement des cellules Lin− de la moelle osseuse de souris et leur incorporation dans un hydrogel de méthylcellulose pour la culture 3D ainsi que la quantification de leur capacité à produire des proplaquettaires et la récupération des cellules pour des analyses ultérieures.

<table><tbody><tr><td>Aiguilles de calibre 18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de calibre 21</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de calibre 23</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>Neeldes de calibre 25</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture à 4 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Cytoclips</td><td>Microm Microtech</td><td>F/CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels équipés de cartes filtrantes</td><td>Microm Microtech</td><td>F/JC304</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>centrifugeuse Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Dulbecco stérile s aimants salins EasySep tamponnés au phosphate</td></tr><tr><td></td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement de cellules progénitrices hématopoïétiques de souris</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19856A</td><td>anticorps biotinylés (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&ndash ; 4) et des billes magnétiques enrobées de streptavidine</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Healthcare Life Science</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Seringues Luer lock 1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>ou seringues 309628 de BD MEDICAL</td></tr><tr><td>Connecteurs de seringues Luer lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3 %</td><td>R& ampère; D systems</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>Lames revêtues de polylysine</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10 000 unités/mL de pénicilline, 10 000 &mu ; g/mL de streptomycine et 29,2 mg/mL de glutamine</td></tr><tr><td>sérum de rat</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin recombinante</td><td>Transg&egrave ; </td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>Tromboïétine humaine recombinante (rhTPO)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>2822</td><td>10 000 unités/mL</td></tr><tr><td>Tubes en plastique à fond rond de 10 mL Falcon</td><td></td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td></td><td></td><td></td> en polystyrène à fond rond de 5 mL</tr></tbody></table>

culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3d à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

L’environnement 3D conduisant à la fois au confinement et aux contraintes mécaniques est de plus en plus reconnu comme un déterminant important du comportement cellulaire. La culture 3D a ainsi été développée pour mieux aborder la situation in vivo. Les mégacaryocytes se différencient des cellules souches hématopoïétiques et progénitaires (HSPC) dans la moelle osseuse (BM). Le BM est l’un des tissus les plus mous du corps, confiné à l’intérieur de l’os. L’os étant peu extensible à l’échelle cellulaire, les mégacaryocytes sont concomitamment soumis à une faible rigidité et à un confinement élevé. Ce protocole présente une méthode de récupération des HSPC de lignée de souris négative (Lin-) par tri immuno-magnétique et leur différenciation en mégacaryocytes matures dans un milieu 3D composé de méthylcellulose. La méthylcellulose n’est pas réactive envers les mégacaryocytes et sa rigidité peut être ajustée à celle de la moelle osseuse normale ou augmentée pour imiter une moelle fibrotique pathologique. Le processus de récupération des mégacaryocytes pour d’autres analyses cellulaires est également détaillé dans le protocole. Bien que l’extension des proplaquettaires soit empêchée dans le milieu 3D, il est décrit ci-dessous comment remettre en service les mégacaryocytes en milieu liquide et quantifier leur capacité à étendre les proplaquettaires. Les mégacaryocytes cultivés en hydrogel 3D ont une plus grande capacité à former des proplaquettaires que ceux cultivés en milieu liquide. Cette culture 3D permet i) de différencier les progéniteurs vers les mégacaryocytes atteignant un état de maturation plus élevé, ii) de récapituler des phénotypes qui peuvent être observés in vivo mais passent inaperçus dans les cultures liquides classiques, et iii) d’étudier les voies de transduction induites par les signaux mécaniques fournis par un environnement 3D.

Les données obtenues à l’aide de ce protocole ont été publiées à l’origine dans Blood en 20169.
Selon le protocole, les cellules ont été ensemencées dans un milieu liquide ou en hydrogel de méthylcellulose. Les cellules en milieu liquide ont toutes sédimenté au fond du puits, en contact avec la surface plastique rigide et parfois avec d’autres cellules. En revanche, les cellules incorporées dans l’hydrogel de méthylcellulose sont réparties de manière homogène dans le ge...

Il est maintenant reconnu que l’environnement tridimensionnel des cellules peut jouer un rôle important dans leur comportement, leur maturation et/ou leur différenciation. Ce protocole décrit un modèle de culture cellulaire tridimensionnel conçu pour étudier l’impact du confinement physique et des contraintes mécaniques sur les mégacaryocytes.

Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Ce protocole permet une évaluation in vitro de l’impact du confinement et de la rigidité moyenne auxquels les mégacaryocytes natifs sont exposés dans la moelle osseuse sur leur comportement et leur maturation. Le principal avantage de cette technique est un modèle simplifié qui élimine les interactions cellule-cellule et matrice cellulaire et se concentre sur les aspects mécaniques. Les bonnes pratiques de laboratoire et les conditions de travail stériles doivent être strictement respectées.En effet, même une légère contamination de l’hydrogel peut avoir un impact dramatique sur la différenciation des mégacaryocytes. Pour obtenir un seul puits de culture cellulaire d’hydrogel, commencez par décongeler deux aliquotes d’un millilitre de méthylcellulose à 3% à température ambiante, puis enduire une seringue Luer lock d’un millilitre avec la méthylcellulose en dessinant d’abord un millilitre, puis en l’expulsant la totalité. Ensuite, à l’aide de la même seringue et de la même aiguille, prélez 333 microlitres de méthylcellulose à partir d’une aliquote fraîche.Après avoir soigneusement retiré l’aiguille, utilisez une pince stérilisée pour visser un connecteur de verrouillage Luer à l’extrémité de la seringue, puis fixez une deuxième seringue de verrouillage Luer non revêtue d’un millilitre au connecteur. Répartissez également la méthylcellulose entre les deux seringues et mettez-les de côté. Ensuite, ressuspendez les cellules souches hématopoïétiques et progénitres négatives de la lignée de souris précédemment isolées dans le milieu de culture concentré à une densité d’une fois 10 à six cellules pour 167 microlitres.Déconnectez l’une des seringues du connecteur et pipettez 167 microlitres de la suspension cellulaire directement dans le connecteur tout en tirant simultanément le piston de la seringue lentement pour faire de la place pour la suspension cellulaire. Après avoir ajouté toute la suspension de la cellule dans le connecteur, tirez davantage le piston pour retirer la suspension du connecteur et reconnectez soigneusement la deuxième seringue, en prenant soin de ne perdre aucune suspension dans le filetage de la vis. Pour homogénéiser le milieu méthylcellulose avec la suspension cellulaire, déplacez lentement les pistons d’avant en arrière entre les deux seringues 10 fois, puis aspirez le volume total dans une seringue et déconnectez les deux seringues, en laissant le connecteur vide.Videz le contenu de la seringue dans un puits d’une plaque à quatre puits et incubez la plaque à 37 degrés sous 5% de dioxyde de carbone. Pour analyser les proplaquettaires, le troisième jour de la culture, transférez soigneusement toutes les cellules d’un puits dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de DMEM avec 1% de PSG. Resuspendez les cellules en pipetant doucement pour diluer complètement la méthylcellulose, puis centrifugez le tube pendant cinq minutes à 300 fois G à température ambiante.Après avoir éliminé le surnageant, ressuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de culture complet et réemencer les cellules à 500 microlitres par puits d’une plaque à quatre puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, à l’aide d’un microscope Brightfield avec un objectif 20X, acquérez au hasard 10 images par puits, en vous assurant de ne pas avoir trop de cellules dans le champ de vision et en capturant au moins cinq mégacaryocytes par champ.À l’aide d’ImageJ, comptez le nombre total de mégacaryocytes et ceux qui étendent les proplaquettaires dans chaque image pour calculer la proportion de mégacaryocytes étendant les proplaquettaires. Pour fixer les cellules pour de futures analyses, ajoutez la solution fixatrice sur la méthylcellulose sans perturber le gel. Après avoir attendu un temps approprié en fonction du fixateur utilisé, utilisez une pipette P1000 pour pipeter doucement le fixateur et geler jusqu’à ce que la méthylcellulose ait été diluée de manière homogène.Et en utilisant la même pointe de pipette, transférez tout le contenu du puits dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de DPBS et homogénéisez par mélange. Centrifuger le mélange. Jeter le surnageant et ressuspend la pastille de mégacaryocytes dans un milieu approprié pour l’analyse souhaitée.Au troisième jour de la culture, les mégacaryocytes dans le milieu liquide ont sédimenté au fond du puits et sont en contact avec la surface plastique rigide, ainsi qu’avec d’autres cellules. En revanche, les cellules incorporées dans l’hydrogel de méthylcellulose sont réparties de manière homogène et isolées des cellules voisines. Une analyse du diamètre moyen des mégacaryocytes dans différentes conditions de culture montre que 2% de méthylcellulose augmente légèrement le diamètre moyen des mégacaryocytes par rapport à la culture liquide.Cependant, l’augmentation de la concentration de méthylcellulose de 0,5% altère la différenciation des mégacaryocytes, comme l’indique un diamètre moyen plus petit. Dans les images de microscopie électronique à transmission représentative, les membranes intracytoplasmiques dans les mégacaryocytes différenciés in vivo dans la moelle osseuse semblent être étroitement opposées aux territoires cytoplasmiques délimités. En culture liquide, les membranes ont principalement un petit aspect ovale rond ou des vésicules allongées sans délimitation des territoires cytoplasmiques.En revanche, la culture de méthylcellulose à 2% a étroitement opposé des membranes avec des territoires cytoplasmiques délimitant ressemblant à la structure in situ. Au quatrième jour de la culture, les mégacaryocytes précédemment cultivés dans l’hydrogel montrent une formation accrue de proplaquettaires par rapport à ceux cultivés en milieu liquide. La proportion moyenne de proplaquettaires prolongeant les mégacaryocytes est généralement d’environ 15 à 20% avec une pré-culture liquide contre 35 à 40% avec une pré-culture d’hydrogel de méthylcellulose.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de pipeter les volumes appropriés très précisément, car un changement mineur de la concentration finale de méthylcellulose peut modifier de manière significative la rigidité du milieu. Après maturation cellulaire dans l’hydrogel, les mégacaryocytes peuvent être récupérés pour l’analyse de la ploïdie et des marqueurs cellulaires par cytométrie en flux ou fixés pour la microscopie électronique ou l’immunocoloration de la protéine d’intérêt.

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Découvrez la culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour étudier l'impact de la rigidité et du confinement mécanique sur leur maturation et la formation de proplaquettes in vitro.

Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement (Vidéo) | JoVE Journal

Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement

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