Name: In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez l'imagerie à deux photons de mégacaryocytes et proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris. Cette méthode permet de visualiser et quantifier la formation des plaquettes in vivo dans des conditions quasi physiologiques.

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Les auteurs tiennent à remercier Florian Gaertner (Institut des sciences et de la technologie d’Autriche, Klosterneuburg, Autriche) pour ses conseils d’expert sur les expériences de microscopie à deux photons au moment où nous avons établi la technique en laboratoire, et Yves Lutz du Centre d’imagerie IGBMC / CBI (Illkirch, France) pour son expertise et son aide avec le microscope à deux photons. Nous remercions également Jean-Yves Rinkel pour son aide technique et Ines Guinard pour le dessin du schéma de la figure 1. Nous remercions l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) pour son accompagnement dans l’acquisition du microscope à deux photons. AB a été soutenu par des bourses postdoctorales de l’Etablissement Français du Sang (APR2016) et de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
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<li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li>
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<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
<li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li>
<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les mécanismes de formation des plaquettes dépendent fortement de l’environnement de la moelle osseuse. Par conséquent, la microscopie intravitale est devenue un outil important sur le terrain pour visualiser le processus en temps réel. Les souris avec des mégacaryocytes fluorescents peuvent être obtenues en croisant des souris exprimant la Cre recombinase dans des mégacaryocytes avec n’importe quelle souris rapporteur floxée contenant une cassette d’expression génique fluorescente conditionnelle. Ici, des souris rapport...

Les plaquettes sont produites par des cellules spécialisées dans les mégacaryocytes situées dans la moelle osseuse. La façon précise dont les mégacaryocytes libèrent des plaquettes dans la circulation est longtemps restée incertaine en raison du défi technique lié à l’observation d’événements en temps réel à travers l’os. La microscopie à deux photons a aidé à surmonter ce défi et a conduit à des progrès majeurs dans la compréhension du processus de formation des plaquettes. Les premières observations in vivo de mégacaryocytes ont été faites par von Andrian et ses collègues en 2007, avec la visualisation de mégacaryocytes fluorescents à travers le crâne1. Cela a été possible parce que la couche osseuse dans le crâne frontopoyériétal de jeunes souris adultes a une épaisseur de quelques dizaines de microns et est suffisamment transparente pour permettre la visualisation de cellules fluorescentes dans la moelle osseuse sous-jacente2.
Les études qui ont suivi ont appliqué cette procédure pour évaluer la formation de proplaquettaires dans diverses conditions et pour déchiffrer les mécanismes sous-jacents3,4,5,6. Ces études ont fourni des preuves définitives que les mégacaryocytes étendent dynamiquement les protubérances, appelées proplaquettaires, à travers la barrière endothéliale des vaisseaux sinusoïdaux (Figure 1). Ces proplaquettaires sont ensuite libérées sous forme de longs fragments qui représentent plusieurs centaines de plaquettes en volume. Les plaquettes se formeront après le remodelage des proplaquettaires dans la microcirculation des organes en aval, notamment dans les poumons7. À ce jour, cependant, le processus précis et les mécanismes moléculaires restent sujets à débat. Par exemple, le rôle proposé des protéines du cytosquelette dans l’allongement des proplaquettaires diffère entre les conditions in vitro et in vivo 3, et des différences dans la formation de proplaquettaires ont été démontrées dans des conditions inflammatoires6. Pour compliquer encore les choses, une étude récente a contesté le concept proplaquettaire et a proposé qu’in vivo,les plaquettes sont essentiellement formées par un mécanisme de bourgeonnement membranaire au niveau des mégacaryocytes8.
Cet article présente un protocole pour l’observation des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle osseuse à partir de l’os du crâne chez des souris vivantes, en utilisant une procédure mini-invasive. Des approches similaires ont déjà été décrites pour visualiser d’autres cellules de la moelle, notamment les cellules souches hématopoïétiques et les cellules progénitaires9. L’accent est mis ici sur l’observation des mégacaryocytes et des plaquettes pour détailler certains paramètres qui peuvent être mesurés, notamment les morphologies proplaquettaires et la vitesse plaquettaire. Ce protocole présente comment insérer un cathéter dans la veine jugulaire pour injecter des traceurs fluorescents et des médicaments et observer à travers l’os du crâne. L’os calvarial est exposé par chirurgie mineure afin qu’un anneau soit collé à l’os. Cet anneau sert à immobiliser la tête et à prévenir les mouvements dus à la respiration et à former une tasse remplie de solution saline comme milieu d’immersion de la lentille. Cette technique est bien adaptée pour i) observer en temps réel la géométrie sinusoïdale et les mégacaryocytes interagissant avec la paroi des vaisseaux; ii) suivre les mégacaryocytes dans le processus de formation, d’allongement et de libération des proplaquettaires; et iii) mesurer les mouvements plaquettaires pour surveiller le flux sanguin sinusoïdal complexe. Les données obtenues à l’aide de ce protocole ont été publiées récemment3.

<table><tbody><tr><td>Logiciel GNU Octave</td><td>Projet</td><td></td> GNU <td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp ; Histoacryl 5 x 0, 5 mL</td><td></td><td>Braun 1050052</td><td>solution injectable de colle chirurgicale</td></tr><tr><td>Détecteurs hybrides HyD Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>GNU project</td><td></td> Version <td>minimale requise</td></tr><tr><td>Imalgene/Kétamine 1000 fl/10 mL</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td> protection <td>oculaire</td></tr><tr><td>Microscope Leica SP8 MP DIVE équipé d’un objectif à eau 25x, ouverture numérique de 0,95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Excitation simultanée d’AlexaFluor-488 et Qtracker-655</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>Pâte dentaire silicone bleu et jaune</td></tr><tr><td>Picodent twinsin speed</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 étiquette vasculaire</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>solution injectable</td></tr><tr><td>Scanner résonant, 8 ou 12 kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xylazine 2 % fl/25 mL</td><td>Gel</td><td></td> Bayer 04007221032311 <td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td></td><td></td><td>pour coller l’anneau à l’os</td></tr><tr><td>Cathéter Surflo IV - Bleu 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti :Saph pulsé laser (Cohérent) (femtoseconde)</td><td>Cohérent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Les plaquettes sont produites par des mégacaryocytes, des cellules spécialisées situées dans la moelle osseuse. La possibilité d’imager les mégacaryocytes en temps réel et leur environnement natif a été décrite il y a plus de 10 ans et jette un nouvel éclairage sur le processus de formation des plaquettes. Les mégacaryocytes étendent des protubérances allongées, appelées proplaquettaires, à travers la muqueuse endothéliale des vaisseaux sinusoïdaux. Cet article présente un protocole pour imager simultanément en temps réel des mégacaryocytes marqués par fluorescence dans la moelle osseuse du crâne et les vaisseaux sinusoïdaux. Cette technique repose sur une chirurgie mineure qui maintient le crâne intact pour limiter les réactions inflammatoires. La tête de la souris est immobilisée avec un anneau collé au crâne pour empêcher les mouvements de respirer.
En utilisant la microscopie à deux photons, les mégacaryocytes peuvent être visualisés jusqu’à quelques heures, ce qui permet d’observer les protubérances cellulaires et les proplaquettaires en cours d’allongement à l’intérieur des vaisseaux sinusoïdaux. Cela permet de quantifier plusieurs paramètres liés à la morphologie des saprotsions (largeur, longueur, présence de zones de constriction) et à leur comportement d’allongement (vitesse, régularité, ou présence de pauses ou de phases de rétraction). Cette technique permet également l’enregistrement simultané des plaquettes circulantes dans les vaisseaux sinusoïdaux pour déterminer la vitesse plaquettaire et la direction du flux sanguin. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier le rôle des gènes d’intérêt dans la formation des plaquettes à l’aide de souris génétiquement modifiées et se prête également à des tests pharmacologiques (étude des mécanismes, évaluation des médicaments dans le traitement des troubles de la production plaquettaire). Il est devenu un outil inestimable, en particulier pour compléter les études in vitro, car on sait maintenant que la formation de proplaquettaires in vivo et in vitro repose sur des mécanismes différents. Il a été démontré, par exemple, que les microtubules in vitro sont nécessaires pour l’allongement proplaquettaire en soi. Cependant, in vivo,ils servent plutôt d’échafaudage, l’allongement étant principalement favorisé par les forces de circulation sanguine.

À l’aide de ce protocole, le traceur fluorescent Qtracker-655 a été administré par voie intraveineuse pour imager les vaisseaux sinusoïdaux de la moelle osseuse anastomosée dans la moelle osseuse du crâne et la direction de l’écoulement représentée par les flèches(Figure 4A,à gauche). En utilisant des souris mTmG, des plaquettes fluorescentes eGFP ont été enregistrées sur 20 s dans chaque branche du vaisseau, et leur vitesse a été mesurée à l’aide d’ImageJ et du logiciel GNU Octave<strong cl...

Nous décrivons ici la méthode d’imagerie des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle de l’os du crâne de souris vivantes en utilisant la microscopie à deux photons.

In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Cette méthode permet la visualisation en temps réel de différents événements, se déroulant dans la moelle osseuse de la souris crânienne, tels que les mégacaryocytes, étendant les proplaquettaires à l’intérieur des vaisseaux sinusoïdaux. Le principal avantage de cette technique est une chirurgie mineure nécessaire minimisant la réaction inflammatoire, permettant une visualisation in vivo des événements dans des conditions presque d’usine. Pour commencer, transportez la souris dans la salle d’imagerie.Allumez le microscope et l’ordinateur et configurez les paramètres requis. Une fois que la souris a complètement anesthésique, placez la souris sur une plaque chauffante, chauffée à 37 degrés Celsius pour toutes les manipulations suivantes, rasez la tête et la gorge de la souris et appliquez le gel sur les yeux pour éviter la sécheresse. Placez la souris sur le dos et fixez les jambes antérieures avec du ruban chirurgical pour étirer la gorge.Après avoir désinfecté la gorge, faites une incision de 0,7 à 1 centimètre sur la veine jugulaire droite ou gauche à l’aide de ciseaux et étirez le tissu conjonctif adjacent pour exposer la veine du jongleur externe sur le dessus du muscle pectoral. Remplissez le cathéter avec une solution saline physiologique chaude et stérile. Pénétrez le cathéter à travers le muscle pectoral, puis insérez le cathéter dans la veine.Retirez doucement l’aiguille, connectez la seringue aux traceurs fluorescents et injectez le volume mort du cathéter. Placez une goutte de colle chirurgicale pour stabiliser le cathéter. Resservez soigneusement la souris à une position couchée.Désinfectez le cuir chevelu avec de l’éthanol à 70% avec une serviette en papier tout en enlevant les poils lâches. Utilisez des ciseaux et des pinces à épiler fins stériles pour faire une incision en forme de T à la ligne médiane jusqu’à un centimètre entre les oreilles sur le cuir chevelu pour exposer le calvarium. Exposez le crâne avec une pince à épiler, puis utilisez des ciseaux et une pince à épiler pour retirer soigneusement le périoste.Utilisez un coton-tige stérile imbibé et une solution saline physiologique pour enlever tout le périoste et tous les débris ou cheveux qui pourraient altérer l’imagerie. Rincez le crâne avec une solution saline pour éliminer toute trace de sang et séchez rapidement l’os avec un coton-tige. Appliquez le gel de colle sur l’anneau, placez l’anneau sur l’os exposé et maintenez-le pendant quelques secondes pour permettre à l’anneau de s’attacher fermement au crâne.Humidifiez légèrement le crâne avec un coton-tige salin marié. Préparez la pâte dentaire au silicium en mélangeant soigneusement les composants bleus et jaunes à un rapport de un pour un. Scellez l’anneau en appliquant la pâte dentaire pour éviter les fuites pendant l’imagerie.Retirez soigneusement toute pâte ou colle dentaire qui pourrait être entrée dans l’anneau. Remplissez ensuite l’anneau avec une solution saline pour vérifier la fuite. Placez la souris sur le support et placez une compresse pliée sous la tête de l’animal pour lever la tête et empêcher le détachement de l’anneau du crâne lorsqu’il est attaché au support.Vissez l’anneau sur le porte-bloc. Placez le support et l’assemblage de la souris dans la chambre de microscope chauffée. Réglez les longueurs d’onde laser appropriées pour les quatre quatre choisis et récupérez les lumières émises.À l’aide du cathéter inter jongleur, injectez 50 microlitres de solution 0,2 micromolaire du traceur fluorescent pour étiqueter le système vasculaire. Placez l’étage du microscope avec le support et la souris sous l’objectif du microscope. Assurez-vous que l’anneau est toujours rempli de solution saline et remplissez-le si nécessaire, et immergez l’objectif et la solution saline.Utilisez l’épifluorescence pour localiser les vaisseaux de la moelle osseuse et observer les mégacaryocytes alignés le long des vaisseaux sinusoïdaux. Pour les acquisitions longues, configurez une acquisition s’ilenseux 3D avec une image de 384 par 384 pixels à l’aide d’un scanner à résonance Hertz de huit kilotz et d’un mode bidirectionnel. Utilisez la moyenne des lignes avec une bonne résolution, puis choisissez la taille de pas Z optimisée et configurez l’intervalle de temps nécessaire avant de commencer l’acquisition.Pour des acquisitions courtes et rapides, choisissez un type d’acquisition d’espace, de temps et minimisez la taille de l’image. Si nécessaire, ajustez l’image au récipient en faisant pivoter le champ d’imagerie. Utilisez la vitesse d’analyse et l’analyse bidirectionnelle les plus élevées disponibles.Minimisez la moyenne des lignes pour trouver le compromis optimal entre la définition de l’image et la rapidité de l’acquisition. N’acquérez qu’un seul plan Z et minimisez l’intervalle de temps pour l’acquisition. Pour mesurer la vitesse plaquettaire, 10 à 20 secondes d’acquisition devraient suffire.Le traceur fluorescent a été administré par voie intraveineuse pour imager les vaisseaux sinusoïdaux de la moelle anastomosée dans la moelle osseuse du crâne, avec la direction d’écoulement représentée par la flèche. La vitesse plaquettaire fluorescente a été enregistrée dans chaque branche du vaisseau et une variation a été observée. Les vaisseaux sinusoïdaux présentent des écoulements complexes dus aux anastomoses, avec la présence d’une refusion d’écoulement et même d’une stase.Les flèches indiquaient la direction opposée de l’écoulement à la bifurcation. La vitesse plaquettaire a également été mesurée pour les branches gauche et droite des vaisseaux indiquant une irrégularité au fil du temps dans chaque branche du vaisseau avec des phases d’accélération, de stase et de décélération. Différentes morphologies de proplaquettaires ont été observées, y compris des proplaquettaires à marges irrégulières, puis des proplaquettaires longées et des proplaquettaires épaisses et courtes.Lorsque les mégacaryocytes ont étendu les proplaquettaires dans les zones d’écoulements complexes, les proplaquettaires ont été projetées d’une branche de vaisseau à l’autre, selon la direction de l’écoulement. Lors de l’arrêt du flux sanguin, les proplaquettaires se sont détendues et la souris a subi un arrêt cardiaque inattendu, ce qui a indiqué l’importance des forces hydrodynamiques dans l’allongement des proplaquettaires. La largeur et la longueur des proplaquettaires ont également été mesurées en largeur moyenne de 5,2 micromètres et une longueur maximale moyenne d’environ 185 micromètres a été observée.Tracer la longueur des proplaquettaires en fonction du temps permet de visualiser le comportement des proplaquettaires pendant les phases d’allongement, de stase, voire de rétraction. La vitesse d’allongement moyenne d’environ 10 micromètres par minute a été observée. L’installation du cathéter, a permis l’injection de médicaments pour étudier les effets sur la formation de proplaquettaires ou d’autres événements d’intérêt en temps réel.

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Dans cette vidéo, nous décrivons une intervention chirurgicale visant à implanter un ensemble d’anneau crânien sur l’os du crâne exposé et à immobiliser davantage la tête de la souris pour une imagerie cérébrale à haute résolution pendant une longue durée.

Installation d’un ensemble d’anneau crânien dans un modèle murin : une procédure chirurgicale pour implanter un ensemble de fenêtre de visualisation sur un crâne murin pour l’imagerie à haute résolution de la moelle osseuse du crâne

L’imagerie en accéléré chez l’animal vivant fournit des informations précieuses sur la réorganisation structurelle du cerveau intact. Ici, nous introduisons une préparation de crâne aminci qui permet l’imagerie transcrânienne de structures synaptiques marquées par fluorescence dans le cortex de souris vivantes par microscopie à deux photons.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

La nature des interactions entre les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) et les niches de la moelle osseuse est mal comprise. Mesure des modifications de matériel et un protocole d'acquisition en plusieurs étapes permettent l'utilisation de deux photons et la microscopie confocale à l'image ex vivo des HSPCs marqués hébergés dans les zones de la moelle osseuse, les interactions de suivi et mouvement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Les monocytes sont des régulateurs clés de l’immunité innée et jouent un rôle critique dans le renouvellement du système phagocytaire mononucléaire périphérique et en cas d’inflammation. Ce manuscrit décrit la procédure d’imagerie en temps réel de la moelle osseuse de la calvaria de souris pour étudier le mécanisme de mobilisation des monocytes.

Suivi moelle osseuse de souris monocytes<em&gt; In Vivo</em

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Le protocole décrit un nouveau modèle de chambre fenêtre du fémur murin qui peut être utilisé pour suivre le mouvement des cellules dans la moelle osseuse fémorale in vivo. La microscopie à fluorescence multiphotonique intravitale est utilisée pour imager trois composants de la moelle osseuse fémorale (système vasculaire, matrice de collagène et neutrophiles) au fil du temps.

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine

La microscopie intravitale fluorescence (IVFM) de la voûte crânienne est appliquée en combinaison avec des modèles animaux génétiques pour étudier la domiciliation et la greffe de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse (BM) niches.

Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

Nous présentons ici un protocole pour analyser l’ultrastructure des mégacaryocytes in situ en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM). Les moelles osseuses murines sont collectées, fixées, incorporées dans de la résine époxy et coupées en sections ultraminces. Après coloration par contraste, la moelle osseuse est observée au microscope TEM à 120 kV.

In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission

Ici, nous détaillons la méthode d’explantation de moelle osseuse, de la préparation de l’échantillon à l’analyse microscopique des lames, afin d’évaluer la capacité des mégacaryocytes qui se sont différenciés dans leur environnement physiologique à former des proplaquettaires.

Dynamique de formation proplaquettaire des explants de moelle osseuse fraîche de souris

La microscopie intravitale permet d’étudier des processus biologiques dynamiques tels que la régénération tissulaire et le développement tumorale. La moelle osseuse calvaire, un tissu très dynamique, offre des informations sur l’hématopoïèse et la fonction vasculaire. L’utilisation d’un implant de fixation de la tête biocompatible imprimé en 3D permet une imagerie longitudinale répétitive, améliorant ainsi notre compréhension de la dynamique des tissus et du microenvironnement tumoral.

Imagerie longitudinale intravitale de la dynamique vasculaire dans la moelle osseuse calvaire

Découvrez l'imagerie à deux photons de mégacaryocytes et proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris. Cette méthode permet de visualiser et quantifier la formation des plaquettes in vivo dans des conditions quasi physiologiques.

In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

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