Name: Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Découvrez l'évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae par cytométrie en flux et microscopie confocale. Ces méthodes permettent d'analyser la phagocytose, la production de cytokines et l'activité protéasique dans les maladies pulmonaires chroniques.

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Les auteurs tiennent à remercier le personnel d’immunologie clinique de Monash Health pour son aide dans ce travail.

<ol><li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li>
<li>Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+TF+%22Harrisons+Principles+of+Internal+Medicine%22">Harrisons Principles of Internal Medicine</a>. 152, (2018).</li>
<li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+%28lung+immunity+to+NTHi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376(2015).</li>
<li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9(2017).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li>
<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1(2013).</li>
<li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li>
<li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li>
<li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).</li>
<li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li>
<li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li>
<li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371(2015).</li>
<li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li>
<li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li>
<li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459(2017).</li>
<li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36(2015).</li>
<li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times%2C+cell+division+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li>
<li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li>
<li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69(2011).</li>
<li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bronchology+%26+Interventional+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li>
<li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606(2016).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes énumérées ici utilisent la cytométrie en flux basée sur la fluorescence et des techniques de microscopie confocale qui peuvent être utilisées conjointement pour obtenir des informations détaillées sur la réponse pulmonaire inflammatoire à Hi.
Il est essentiel d’établir la formulation antigénique appropriée de Hi à utiliser, et il est conseillé d’avoir une contribution spécifique d’un microbiologiste à cet égard. Live Hi induit une réponse plus forte, tandis que les préparations Hi...

Haemophilus influenzae (Hi) est une bactérie commensale normale présente dans le pharynx de la plupart des adultes en bonne santé. Hi peut avoir une capsule de polysaccharide (types A-F, p. ex. type B ou HiB) ou ne pas avoir de capsule et être non typable (NTHi)1. La colonisation de la muqueuse avec cette bactérie commence dans la petite enfance et il y a un renouvellement de différentes souches colonisatrices2. Cette bactérie est également capable d’envahir les voies respiratoires supérieures et inférieures; Dans ce contexte, il peut induire l’activation de la réponse immunitaire et l’inflammation 3,4. Cette réponse inflammatoire peut causer une maladie clinique et contribuer à une variété de conditions respiratoires importantes, y compris la sinusite, l’otite moyenne, la bronchite, la fibrose kystique, la pneumonie et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). La plupart de ces conditions sont dues aux souches NTHi2. Cet article décrit les méthodes d’évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Hi à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie confocale.
Les méthodes décrites ci-dessous ont été adaptées à partir de techniques bien établies qui ont été modifiées pour évaluer la réponse inflammatoire à Hi. Le choix d’une forme antigénique appropriée de Hi est un élément clé de cette évaluation. Les préparations antigéniques vont des composants de la paroi cellulaire aux bactéries vivantes. Pour établir et normaliser les essais, l’utilisation d’échantillons de sang périphérique peut être très utile au départ.
La cytométrie en flux permet de mesurer une variété de paramètres et de tests fonctionnels à partir d’un échantillon au niveau cellulaire. Cette technique présente l’avantage que des réponses cellulaires spécifiques (par exemple, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ou la production de cytokines intracellulaires) peuvent être évaluées par rapport à d’autres méthodes plus générales telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou ELISspot.
Les pièges extracellulaires sont exprimés par les neutrophiles (TNE)5,6,7 et par d’autres cellules telles que les macrophages (MET)8. Ils sont de plus en plus reconnus comme une réponse inflammatoire clé, en particulier dans l’infection des poumons9. Ils peuvent être évalués par microscopie confocale à fluorescence. Cette technique permet d’identifier définitivement les TNE/MET et de distinguer leur expression des autres formes de mort cellulaire6.
La cytométrie en flux et la microscopie confocale sont des tests basés sur la fluorescence. Leur succès dépend de protocoles de filtrage optimaux des échantillons biologiques. Ces méthodes prennent un certain temps à apprendre et nécessitent une expertise de supervision appropriée. Les instruments impliqués sont également coûteux à l’achat et à l’utilisation. Le cadre optimal pour leur utilisation comprend les grandes universités et les hôpitaux de référence tertiaires.
Les méthodes utilisées dans ce protocole sont transférables pour l’étude d’autres organismes similaires impliqués dans les maladies respiratoires (par exemple, Moxarella catarrhalis et Streptococcus pneumoniae). NTHi interagit également avec d’autres bactéries respiratoires communes10.

<table><tbody><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213330</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD28</td><td>Thermofisher</td><td>16-0289-81</td><td></td></tr><tr><td>CD49d</td><td>Thermofisher</td><td>534048</td><td></td></tr><tr><td>DAPI prolong gold</td><td>Thermofisher</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DHR123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109244-58-8</td><td></td></tr><tr><td>Filcon maille de nylon stérile</td><td>Becton Dickinson</td><td>340606</td><td></td></tr><tr><td>substrat gélatineux, Enzchek</td><td>Sondes moléculaires</td><td>E12055</td><td></td></tr><tr><td>MACS mix tube rotater</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Numéro de catalogue non disponible</td></tr><tr><td>Medicons 50 &micro ; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>340592</td><td></td></tr><tr><td>Pansorbin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>507858</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8047152</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost slides</td><td>Thermofisher</td><td>11562203</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à haemophilus influenzae

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) est une bactérie répandue dans une gamme de conditions respiratoires. Une variété de dosages / techniques différents peuvent être utilisés pour évaluer la réponse immunitaire / inflammatoire respiratoire à cette bactérie. La cytométrie en flux et la microscopie confocale sont des technologies basées sur la fluorescence qui permettent une caractérisation détaillée des réponses biologiques. Différentes formes d’antigène Hi peuvent être utilisées, y compris les composants de la paroi cellulaire, les préparations tuées / inactivées et les bactéries vivantes. Hi est une bactérie fastidieuse qui nécessite un milieu enrichi, mais qui est généralement facile à cultiver dans des environnements de laboratoire standard. Les échantillons de tissus pour la stimulation par Hi peuvent être obtenus à partir de sang périphérique, de bronchoscopie ou de poumon réséqué (par exemple, chez les patients subissant une intervention chirurgicale pour le traitement du cancer du poumon). La fonction des macrophages et des neutrophiles peut être évaluée de manière exhaustive à l’aide de la cytométrie en flux avec une variété de paramètres mesurés, y compris la phagocytose, les espèces réactives de l’oxygène et la production intracellulaire de cytokines. La fonction lymphocytaire (p. ex. fonction des lymphocytes T et des cellules NK) peut être spécifiquement évaluée à l’aide de la cytométrie en flux, principalement pour la production intracellulaire de cytokines. L’infection à Hi est un puissant inducteur de la production de pièges extracellulaires, à la fois par les neutrophiles (TNE) et les macrophages (MET). La microscopie confocale est sans doute le moyen le plus optimal d’évaluer l’expression de la TNE et de la MET, qui peut également être utilisée pour évaluer l’activité de la protéase. L’immunité pulmonaire à Haemophilus influenzae peut être évaluée par cytométrie de flux et microscopie confocale.

Les résultats représentatifs montrent comment les réponses immunitaires inflammatoires à la NTHi peuvent être évaluées/quantifiées par cytométrie de flux et microscopie confocale. Un élément clé de l’interprétation des résultats est la comparaison en fluorescence entre les échantillons témoins et stimulés. Un certain nombre d’expériences préliminaires sont généralement nécessaires pour optimiser la coloration des échantillons. Le nombre de couleurs différentes pouvant être examinées simultanément dépendra du nombre de ca...

Haemophilus influenzae induit une inflammation des voies respiratoires. Cet article portera sur l’utilisation de la cytométrie en flux et de la microscopie confocale pour définir les réponses immunitaires des phagocytes et des lymphocytes en réponse à cette bactérie.

Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Haemophilus influenza est une cause majeure d’inflammation dans diverses maladies pulmonaires chroniques, y compris la BPCO et la pneumonie. Ce protocole décrit des méthodes pour évaluer l’effet de l’haemophilus sur l’inflammation pulmonaire. Les avantages de cette technique sont qu’elle permet une évaluation complète des réponses immunitaires innées et adaptatives.Incuber 450 microlitres de sang périphérique avec 50 microlitres d’un iodure de propidium activé marqué H influenzae dans un tube de cinq millilitres pendant 20 minutes au bain-marie à 37 degrés Celsius. Retirez l’échantillon du bain-marie, ajoutez cinq microlitres de DHR et de vortex pendant 10 secondes. Ensuite, replacez-le au bain-marie pendant encore 10 minutes.Après avoir retiré l’échantillon du bain-marie, lyser les érythrocytes avec cinq millilitres de solution de chlorure d’ammonium à 0,8% et analyser les échantillons sur un cytomètre en flux comme décrit dans le texte. Diviser l’échantillon de sang périphérique en aliquotes pour le contrôle et la stimulation de l’antigène. Ajouter des anticorps costimulants aux deux échantillons.Ajoutez ensuite le virus H influenzae non typable à l’échantillon d’antigène et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, ajoutez l’agent bloquant de Golgi brefeldin A aux échantillons et incuberez-les pendant cinq heures supplémentaires. Après avoir lysé les érythrocytes comme démontré précédemment, fixer les leucocytes en utilisant 500 microlitres de un à 2% de para-formaldéhyde pendant une heure.Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, puis perméabiliser 1 million de cellules avec 100 microlitres de saponine à 0,1% pendant 15 minutes. Ensuite, incuber les cellules avec des anticorps marqués fluorescents appropriés. Lavez les cellules, puis analysez-les à l’aide d’un cytomètre en flux.Déterminer la proportion de cellules répondant à l’antigène en obtenant les populations de lymphocytes pertinentes. Effectuer une coloration de fond sur les cellules non stimulées pour toutes les cytokines à analyser. Trancher environ 20 à 40 grammes de l’échantillon de lobectomie en trois à cinq coupes de millimètres cubes.Placez-les dans une chambre stérile de 50 microlitres et fragmentez mécaniquement le tissu à l’aide d’un désagrégateur approprié. Après la désagrégation des tissus, lyser les globules rouges comme démontré et remettre les cellules en suspension dans un RPMI stérile. Ensuite, filtrez les cellules à travers un treillis de nylon stérile de 100 micromètres et comptez les cellules viables en utilisant la méthode d’exclusion du bleu de trypan.Pour le test d’infection, remettre en suspension les cellules pulmonaires dans RPMI à une concentration finale de 4 millions de cellules par millilitre et par tube. Ensuite, infectez les cellules à un MOI de 100 bactéries par cellule. Desserrez le bouchon d’une demi-rotation pour permettre le transfert de gaz dans les tubes.Placez les cellules dans le rotateur tubulaire et incuberez-les à 37 degrés Celsius tout en tournant à 12 RPM. Une heure après la stimulation, ajoutez de la grefeldine A pour empêcher l’exportation extracellulaire des cytokines et incuber les suspensions cellulaires pendant 16 à 22 heures supplémentaires avec rotation. Le lendemain, laver la suspension cellulaire avec 500 microlitres de PBS contenant 1% d’albumine sérique bovine et 0,01% d’azoture de sodium.Ensuite, colorez la suspension cellulaire pour des marqueurs de surface cellulaire de lymphocytes humains spécifiques pendant une heure. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS et fixez-les et perméabilisez-les comme démontré précédemment. Ensuite, incuber les cellules avec des anticorps de coloration de cytokines intracellulaires pendant une heure.Ensuite, lavez les cellules et remettez-les en suspension dans 100 microlitres de PBS avant l’acquisition des données sur un cytomètre en flux. Mesurer la protéolyse via l’action des métalloprotéinases, ajouter un substrat de gélatine marqué à la fluorescéine directement sur les lames de coupe de tissu pulmonaire. Placez les lames horizontalement et incuberez-les dans une chambre humidifiée protégée par la lumière à 37 degrés Celsius pendant une heure.Pour préparer les témoins négatifs, ajouter un tampon de réaction x sans gélatine fluorescente aux sections pour une analyse plus approfondie. Les cellules mononucléées du sang périphérique ont été fermées en utilisant la dispersion vers l’avant et sur le côté pour définir la population phagocytaire. La population de phagocytes a été définie par l’expression de CD14 pour marquer les monocytes.La mesure des ROS a été réalisée par oxydation de DHR 123 pour produire une fluorescence. La fluorescence médiane de l’échantillon stimulé a été comparée au témoin. La production de cytokines intracellulaires par les lymphocytes a été mesurée par cytométrie en flux.Les cellules ont d’abord été analysées pour leur expression du marqueur leucocytaire CD45, puis pour CD trois et CD quatre, CD huit. Les cellules CD trois, CD quatre positives ont été évaluées pour la production intracellulaire de cytokines dans des échantillons témoins et stimulés. L’activité de la protéase a été mesurée par zymographie NC deux dans des coupes de tissu pulmonaire non fixées.La coloration fluorescente indiquait la présence d’une activité MMP, qui était également colocalisée avec l’expression de la chromatine. L’ajout d’anticorps aux échantillons de tissu pulmonaire nécessite une concentration et la coloration des cellules nécessitera une optimisation dans les expériences préliminaires. Le surnageant des échantillons de tissu pulmonaire peut être analysé plus en détail pour d’autres médiateurs inflammatoires en utilisant des techniques telles que ELISA et Ces techniques peuvent être utilisées pour évaluer l’effet des thérapies potentielles sur l’inflammation pulmonaire.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique in vitro pour stimuler les lymphocytes via Haemophilus influenzae non typable (NTHi) et pour évaluer la réponse immunitaire. L’incubation de cellules mononucléées isolées du sang périphérique (PBMC) avec NTHi amène les cellules bactériennes à stimuler les lymphocytes T, ce qui entraîne la production de cytokines. Lors de l’inhibition de la sécrétion de cytokines, une coloration par immunofluorescence est effectuée pour détecter les cytokines intracellulaires...

Une technique in vitro pour stimuler les lymphocytes via des bactéries pathogènes

Cette vidéo démontre la quantification des médiateurs inflammatoires au cours de l’infection en incubant des cellules immunitaires dérivées de tissus pulmonaires humains avec Haemophilus influenzae. La cytométrie en flux est utilisée pour mesurer la fluorescence des cytokines dans les lymphocytes marqués, en corrélation avec la production de cytokines pro-inflammatoires en réponse à une infection bactérienne.

Quantification des médiateurs inflammatoires dans des cellules dérivées de tissus humains infectés

Cette vidéo présente un test de mesure des anticorps neutralisants contre le virus respiratoire syncytial (VRS). La pré-incubation avec un sérum contenant des anticorps neutralisants contre le VRS neutralise les particules virales, réduisant ainsi l’infection cellulaire et la formation de plaques. Les cellules infectées par le virus sont ensuite soumises à la fixation, au blocage et au marquage d’anticorps conjugués aux fluorophores pour la visualisation de la plaque. Ce processus permet...

Un test pour mesurer le titre d’anticorps neutralisants spécifiques du virus respiratoire syncytial

Le virus respiratoire syncytial humain (HRSV) peut provoquer une bronchiolite sévère chez les jeunes nourrissons. Une partie de la pathogenèse de la maladie grave du VRSL est causée par la réponse immunitaire de l’hôte. La stimulation des cellules immunitaires humaines primaires avec le HRSV fournit un système modèle rapide et reproductible pour étudier l’activation des voies inflammatoires et l’infection.

Un modèle in vitro pour étudier les réponses immunitaires des cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’infection par le virus respiratoire syncytial humain

Nous démontrons la procédure d’inoculation intra-trachéale d’Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures de souris. Il s’agit d’un outil très utile pour étudier les voies de signalisation qui régulent l’inflammation des voies respiratoires dans des modèles murins.

Administration intra-trachéale de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation

Ce protocole décrit une technique non invasive pour l’échantillonnage des liquides de muqueuse intacte les voies aériennes supérieures. Il peut être utilisé pour effectuer la quantification des niveaux de in vivo des médiateurs de protéines, tels que les cytokines et chimiokines, chez les sujets de tous âges.

Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures

Les protocoles présentés décrivent comment effectuer un test d’inhibition hémagglutination afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe d’échantillons de sérum des destinataires de vaccin contre la grippe. Le premier dosage détermine la concentration optimale d’antigène viral par hémagglutination. Le deuxième essai quantifie les titres d’anticorps spécifiques à la grippe par l’inhibition de l’hémagglutination.

Un test d’Inhibition (HI) hémagglutination optimisé pour quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe

Les auteurs décrivent une méthode pour mesurer l’activation des fonctions effectrices Fc-médiée par les anticorps qui ciblent l’hémagglutinine du virus influenza. Ce test peut également être adapté afin d’évaluer la capacité des anticorps monoclonaux ou polyclonaux sérums ciblant d’autres glycoprotéines de surface virales à provoquer l’immunité induite par le Fc.

Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

L’objectif du présent article est de fournir une description détaillée des procédures recommandées pour évaluer la fonction respiratoire chez des souris conscientes par pléthysmographie double-chambre.

Évaluation de la fonction respiratoire chez des souris conscientes par pléthysmographie Double-chambre

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Ce protocole détaille une étude des interactions précoces entre les cellules épithéliales nasales infectées par le virus et l’activation des cellules innées. Des sous-ensembles individuels de cellules immunitaires peuvent être distingués en fonction de leur activation en réponse à des infections virales. Ils peuvent ensuite être étudiés plus avant pour déterminer leurs effets sur les réponses antivirales précoces.

Modèle de co-culture sans contact pour l’étude de l’activation des cellules immunitaires innées au cours d’une infection virale respiratoire

Découvrez l'évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae par cytométrie en flux et microscopie confocale. Ces méthodes permettent d'analyser la phagocytose, la production de cytokines et l'activité protéasique dans les maladies pulmonaires chroniques.

Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae

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