Essais en laboratoire en petite cage de moustiques anophélines génétiquement modifiés

Le protocole décrit ici est approprié pour évaluer la performance des moustiques transgéniques et les comparaisons avec leurs homologues de type sauvage dans un petit laboratoire d’essais en cage. Les essais en petite cage sont importants pour fournir des valeurs empiriques qui aideront à la mise en œuvre de nouvelles technologies pour l’élimination du paludisme. Les essais en cage peuvent être adaptés à d’autres conceptions expérimentales et conviennent pour évaluer la dynamique d’une menace d’un transgénique de désir.

Suite à l’introduction des individus transgéniques. Commencez la phase initiale de l’expérience en installant trois cages de 0,216 mètre cube en triples. Et en ajoutant 60 larves de type sauvage de deuxième stade à chaque cage pendant trois semaines successives.

Chaque semaine, fournissez aux femelles adultes dans chaque cage des souris anesthésiées comme source de repas de sang. Et un récipient de ponte trois jours après le repas de sang. Faites éclore les œufs de chaque cage chaque semaine.

De la quatrième à la huitième semaine, sélectionnez au hasard 60 larves L2 du deuxième stade pour retourner dans leurs cages respectives. À la neuvième semaine, attribuez au hasard un ensemble de cages triples comme témoins et un ensemble pour chaque rapport de libération souhaité. Ajoutez 60 nymphes de type sauvage avec 30 mâles et 30 femelles aux cages de contrôle chaque semaine.

Maintenez un ratio de un pour un dans chaque cage respective en ajoutant chaque semaine 30 nymphes mâles transgéniques ainsi que 60 nymphes de type sauvage. Pour un rapport de un à 0,1, ajoutez 300 pupes mâles transgéniques chaque semaine dans chaque cage respective ainsi que 60 nymphes de type sauvage. Répétez l’ajout de pupes de moustiques dans la cage, en fournissant de la farine de sang et des œufs à couver chaque semaine.

Sélectionnez un total de 300 larves dans chaque cage au hasard pour le dépistage. Filtrer les larves au stéréomicroscope avec des filtres de fluorescence pour l’expression du marqueur dominant fluorescent au stade larvaire et nymphal. Marquez le sexe des nymphes résultantes.

Dans l’expérience de forçage génétique, utilisez une stratégie de barrière en gardant les moustiques dans un insectaire sécurisé et en suivant des procédures d’exploitation normalisées avec une surveillance régulière. Préparez une cage avec deux ensembles de cages triples de 0,216 mètre cube pour chaque rapport de libération mâle transgénique / sauvage souhaité. Pour obtenir un rapport de libération mâle de un pour un, ajoutez 120 mâles transgéniques, 120 mâles et femelles de type sauvage au stade de nymphe à chaque cage répliquée.

Fournissez un repas de sang à l’aide de souris anesthésiées à des femelles de quatre à sept jours dans chaque cage. Après avoir fait éclore les œufs dans un plateau larvaire, sélectionnez environ 240 larves du premier stade L1 au hasard dans chaque cage et élevez-les jusqu’à des nymphes avant de retourner dans leurs cages respectives. Sélectionnez et dépister les larves pour le marqueur oculaire et le phénotype sexuel comme décrit précédemment.

Assemblez une configuration de cage de 0,005 mètre cube avec un nombre égal de mâles et de femelles pour chaque rapport de libération spécifique des transgéniques aux mâles de type sauvage. À l’aide d’un appareil d’alimentation artificiel, fournissez des repas de sang aux femelles de quatre à sept jours dans chaque cage pendant deux jours consécutifs. Trois jours après le deuxième repas de sang, ajoutez un récipient de ponte et retirez les récipients après trois jours.

Après avoir noté tous les morts et les adultes vivants restant dans la cage par sexe, stockez-les à moins 80 degrés Celsius pour l’analyse moléculaire. Faites éclore les œufs et sélectionnez 200 larves L1 et mettez les larves de côté pour peupler de nouvelles cages pour la prochaine génération. Ensuite, sélectionnez au hasard 500 autres larves dans chaque cage réservée au dépistage.

Élevez les 200 larves sélectionnées au stade de pupe et 500 larves au stade L4. Retournez la nymphe de 200 plateaux pour peupler une nouvelle cage. Dépister les larves sélectionnées au hasard pour le marqueur oculaire et le phénotype sexuel Comme précédemment.

Dans l’analyse représentative, la dynamique phénotypique attendue des répliques les plus performantes est montrée pour les différents protocoles d’essais en cage de remplacement de population. Les résultats ont montré l’augmentation linéaire de la proportion de larves avec le phénotype marqueur DsRed sur sept générations. La version mono-disque a atteint un peu plus de 80% d’introduction transgénique en sept générations.

Les protocoles de forçage génétique y sont parvenus en trois à quatre générations. Validant ainsi qu’une seule libération d’un système de forçage génétique peut être plus efficace pour l’introduction de transgènes. À la fin de l’observation, la propagation du transgène avait atteint une introduction presque complète dans les systèmes de forçage génétique.

Des paramètres importants, tels que la structure par âge de la population de dissémination, la taille de la cage et d’autres, varieront en fonction du but de l’expérience et des objectifs spécifiques. Des expériences pour évaluer les paramètres de condition physique tels que la fertilité et la fécondité peuvent être faites. D’autres données plus empiriques issues des essais en cage peuvent être utilisées pour paramétrer des modèles mathématiques de la dynamique des populations.