Name: Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Apprenez l'ultracentrifugation à gradient de densité pour isoler les endosomes de recyclage dans les cellules de mammifères. Cette méthode facilite l'étude du trafic protéique par voie endocytaire.

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Ce travail a été soutenu par des fonds du Research Grants Council Hong Kong, du programme de subventions directes CUHK, du fonds de dotation United College et du TUYF Charitable Trust. Les chiffres de ce travail ont été adaptés de notre publication précédente, « ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentialiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1 » publié dans le FASEB Journal en octobre 2020.

1. Culture et transfection de cellules de mammifères
<ol><li>Plaque 2 x 106 cellules dans un plat de culture de 100 mm. Utilisez quatre plats pour chaque transfection. REMARQUE : Le nombre de cellules requises peut varier selon les lignées cellulaires. L’optimisation peut être nécessaire avant de passer à l’étape d’isolement.</li>
	<li>Le lendemain, transfectez les cellules avec de la lipofectamine selon les instructions du fabricant.</li>
</ol>2. Récolte cellulaire
<ol><li>Jeter le milieu de culture 48 h après la transfection.</li>
	<li>Lavez les cellules avec du PBS glacé (phosphates de sodium de 10 mM, chlorure de potassium de 2,68 mM, chlorure de sodium de 140 mM) deux fois.</li>
	<li>Ajouter 1 mL dePBS+ glacé (PBS complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,5x et un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase 0,5x) à chaque plat.</li>
	<li>Recueillir les cellules avec un grattoir à cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.</li>
	<li>Abattez les cellules par centrifugation à l’aide d’un rotor à godet oscillant à 400 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement la pastille cellulaire dans 5 mL de tampon d’homogénéisation (HB; 250 mM de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4, 1 mM d’EDTA complété par 0,03 mM de cycloheximide, 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase et 1x cocktail d’inhibiteurs de phosphatase).</li>
	<li>Prélever les cellules par centrifugation à 1 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de HB.</li>
	<li>Homogénéiser les cellules avec un homogénéisateur Dounce pendant 15 à 20 coups. REMARQUE: D’autres méthodes d’homogénéisation, par exemple, le passage de l’échantillon à travers une seringue, pourraient être utilisées. L’efficacité de l’homogénéisation pourrait être révélée en observant l’homogénat sous un microscope à contraste de phase.</li>
	<li>Transférer l’homogénat dans un tube de centrifugation de 2 mL. REMARQUE: Récoltez 50 μL d’homogénat avec 12,5 μL de tampon d’échantillon 5x et étiquetez-le comme lysat total.</li>
	<li>Ajouter 0,7 mL de HB à l’homogénat.</li>
	<li>Faire tourner l’homogénat dilué à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C. REMARQUE: La pastille contient des noyaux et des cellules ininterrompues.</li>
	<li>Recueillir 1,5 mL du surnageant et répéter l’étape 2,12 une fois.</li>
	<li>Recueillir 1,4 mL du surnageant et l’étiqueter comme surnageant post-nucléaire (SNP).</li>
</ol>3. Préparation de la colonne de gradient de densité
<ol><li>Transférer 1,2 mL de PNS dans un tube ultracentrifuge.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution de saccharose à 62 % (2,351 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) à l’échantillon et bien mélanger par pipetage doux. REMARQUE: La solution résultante est une solution de saccharose à 40,6%.</li>
	<li>Ajouter soigneusement 3,3 mL de solution de saccharose à 35 % (1,177 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) sur l’échantillon.</li>
	<li>Ajouter soigneusement 2,2 mL de solution de saccharose à 25 % (0,806 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) sur la solution de saccharose à 35 %. NOTE: L’indice de réfraction des solutions de saccharose à 62%, 40,6%, 35% et 25% à température ambiante est de 1,44, 1,40, 1,39 et 1,37, respectivement. Les indices de réfraction des solutions de saccharose pourraient être vérifiés à l’aide d’un réfractomètre pour assurer la précision et la cohérence de l’expérience.</li>
	<li>Remplissez le tube d’ultracentrifugation avec HB. REMARQUE : Stocker temporairement la colonne de gradient de densité préparée à 4 °C.</li>
</ol>4. Fractionnement et récupération de la fraction contenant des endosomes recyclés
<ol><li>Centrifuger la colonne à 210 000 x g pendant 3 h à 4 °C.</li>
	<li>Collectez 12 fractions (1 mL chacune) avec soin, en commençant par le haut du gradient. REMARQUE: Les endosomes de recyclage doivent être trouvés à l’interface entre 35% et 25% de solutions de saccharose. Les fractions collectées peuvent être congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C.</li>
	<li>Diluer toutes les fractions avec 1 mL de tampon de dilution (3 mM d’imidazole à pH 7,4, 1 mM d’EDTA).</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon dilué à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et ajouter 50 μL de tampon d’échantillon 1x pour récolter les fractions.</li>
	<li>Analyser la teneur en protéines dans les fractions par western blotting.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.

Le protocole ci-dessus décrit les procédures d’isolement des endosomes de recyclage des cellules cultivées par ultracentrifugation. La fiabilité de cette méthode a été démontrée par la dernière publication22, prouvant que les endosomes de recyclage sont isolés avec succès d’autres organites(Figure 1),tels que l’appareil de Golgi et les mitochondries. Certaines étapes critiques doivent être prises en compte pour obtenir un bon résultat de séparation. Lors de la prépara...

Le trafic endosomal est un processus physiologique essentiel qui implique divers événements biologiques1,par exemple, le transport des récepteurs de signalisation, des canaux ioniques et des molécules d’adhésion. Les protéines localisées au niveau de la membrane plasmique sont internalisées par endocytose2. Les protéines internalisées sont ensuite triées par l’endosomeprécoce 3. Certaines des protéines sont ciblées sur les lysosomes pour la dégradation4. Cependant, une quantité importante de protéines est recyclée à la surface de la cellule par des processus de recyclage rapides et lents. Lors d’un recyclage rapide, les protéines quittent les premiers endosomes et retournent directement à la membrane plasmique. Inversement, en cas de recyclage lent, les protéines sont d’abord triées dans le compartiment de recyclage endocytaire, puis transportées vers la membrane plasmique. Diverses protéines de cargaison, par exemple la clathrine, le complexe rétromère, le complexe retriever et la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich, et le complexe SCAR Homologue (WASH), participent à de tels processus de recyclage membranaire4,5,6,7,8,9. L’équilibre de l’endocytose et de l’événement de recyclage est crucial pour la survie cellulaire et contribue à divers événements cellulaires10, par exemple, l’adhésion cellulaire, la migration cellulaire, la polarité cellulaire et la transduction du signal.
ARF6, une petite GTPase, est un régulateur signalé du trafic endocytaire7,11,12. Fait intéressant, divers groupes de recherche ont illustré l’importance de l’ARF6 dans le recyclage endocytaire13,14,15,16,17. L’étude vise à étudier la relation entre l’excroissance de neurites médiée par ARF6 et le recyclage endocytaire. Le rapport précédent suggère que l’activation d’ARF6 se fait en amont de l’activité rac1 en agissant sur ELMO1-dédicace du complexe de cytocinèse 1 (DOCK180)18. Cependant, la façon dont ARF6 déclenche la signalisation Rac1 médiée par ELMO1-DOCK180 reste incertaine. L’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour étudier le rôle du recyclage endocytaire médié par ARF6 dans un tel processus. En utilisant cela, la fraction contenant des endosomes de recyclage a été obtenue à partir de lysats cellulaires19. La fraction a été soumise à un transfert western pour l’analyse de la teneur en protéines. Les résultats de l’immunoblot ont révélé que sous la présence de FE65, une protéine adaptatrice enrichie en cerveau, l’ARF6 actif augmentait considérablement le niveau d’ELMO1 dans la fraction contenant des endosomes de recyclage. Le protocole suivant comprend les procédures pour (1) transfecter les cellules de mammifères; 2° la préparation des échantillons et des colonnes de gradient de densité; et (3) l’obtention de la fraction contenant des endosomes de recyclage.

<table><tbody><tr><td>1 ml, tube en polypropylène à paroi épaisse ouvert, 11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de culture tissulaire</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13,2 mL, tube ultra-transparent à paroi mince à toit ouvert certifié libre, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x Tampon d’échantillon</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Technologie</td><td>de signalisation cellulaire</td> mAb de lapin <td>4850S</td><td>Anticorps monoclonal de lapin pour la détection de COX IV.</td></tr><tr><td>Broyeur de tissus Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce, 7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec faible teneur en glucose</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps ELMO1 (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>Anticorps monoclonal de souris pour la détection d’ELMO1.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps FE65 (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>Anticorps polyclonal de chèvre pour la détection de FE65.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin,</td><td>HyClone</td> de qualité recherche <td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal GAPDH (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>Anticorps monoclonal de souris pour la détection de GAPDH.</td></tr><tr><td>Logiciel ImageLab</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Mesure de l’intensité de la bande</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Réactif de transfection</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-&bêta ;-COP</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>Anticorps monoclonal de souris pour la détection de &bêta ;-COP.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) souris mAb</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>2276S</td><td>Anticorps monoclonal de souris pour la détection des protéines marquées myc.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, sel disodique, dihydraté</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum réduit</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS Comprimés</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal spécifique à 4906845001 RAB11A</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Anticorps polyclonal de lapin pour la détection de Rab11.</td></tr>Rotor à godets oscillants <tr><td>Sucrose</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti</td><td>Beckman Soc</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Rotor à angle fixe</td><td>Beckman Soc</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge phénol</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Le trafic endosomal est un processus cellulaire essentiel qui régule un large éventail d’événements biologiques. Les protéines sont internalisées à partir de la membrane plasmique, puis transportées vers les premiers endosomes. Les protéines internalisées pourraient être transitées vers le lysosome pour être dégradées ou recyclées vers la membrane plasmique. Une voie de recyclage endocytaire robuste est nécessaire pour équilibrer l’élimination des matériaux membranaires de l’endocytose. Diverses protéines régulent la voie, y compris le facteur ADP-ribosylation 6 (ARF6). L’ultracentrifugation par gradient de densité est une méthode classique de fractionnement cellulaire. Après la centrifugation, les organites sont sédimentés à leur surface isopycnique. Les fractions sont collectées et utilisées pour d’autres applications en aval. Décrit ici est un protocole pour obtenir une fraction contenant des endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères transfectées en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité. Les fractions isolées ont été soumises à un transfert Western standard pour analyser leur teneur en protéines. En utilisant cette méthode, nous avons identifié que le ciblage de la membrane plasmique de l’engloutissement et de la motilité cellulaire 1 (ELMO1), un facteur d’échange de nucléotides de guanine substrat 1 de la toxine botulique C3 (Rac1) lié à Ras, se fait par recyclage endocytaire médié par ARF6.

Après avoir fractionné les cellules HEK293 non transfectées par ultracentrifugation du gradient de densité, 12 fractions ont été collectées à partir du haut du gradient. Les fractions récoltées ont été diluées avec le tampon de dilution dans un rapport de 1:1 et soumises à une deuxième série de centrifugation. Les échantillons ont ensuite été soumis à un transfert Western pour analyser leur teneur en protéines. Comme le montre la figure 1,le marqueur d’endosomes de recyclage Rab11 est détect...

Cet article vise à présenter un protocole de préparation d’endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose.

Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Ce protocole aide à isoler les endosomes de recyclage contenant une fraction des cellules de mammifères transfectées afin de faciliter l’investigation du trafic de protéines via le trafic endocytaire. Cette technique est facile à manipuler et applicable aux échantillons de tissus et de cellules. La démonstration de la procédure sera assurée par Mlle Zhai Yu Qi, doctorante du laboratoire du Dr Lao.Pour commencer, plaquer 2 fois 10 aux 6 cellules dans une boîte de culture de 100 millimètres. Le lendemain, transfectez les cellules avec lipofectamine selon les instructions du fabricant. Pour récolter les cellules, jetez le milieu de culture 48 heures après la transfection et lavez les cellules deux fois avec du PBS glacé.Ajoutez ensuite un millilitre de PBS glacé complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,5X dans un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase 0,5X à chaque plat. Ensuite, à l’aide d’un grattoir à cellules, collectez les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. les cellules par centrifugation à l’aide d’un rotor à godet oscillant.Jetez le surnageant et remettez en suspension doucement la pastille cellulaire dans cinq millilitres de tampon d’homogénéisation. Prélever à nouveau les cellules par centrifugation et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon d’homogénéisation. Homogénéiser les cellules avec un homogénéisateur Dounce en utilisant 15 à 20 coups.Transférez ensuite l’homogonate dans un tube de centrifugation de deux millilitres. Ajouter 700 microlitres de tampon d’homogénéisation à l’homogonate. Ensuite, faites tourner l’homogonate dilué et collectez 1,5 millilitre du surnageant.Faites tourner à nouveau le surnageant collecté, puis collectez 1,4 millilitre du surnageant et étiquetez-le comme surnageant post-nucléaire. Pour préparer la colonne de gradient de densité, transférer 1,2 millilitre du surnageant post-nucléaire dans un tube ultracentrifuge. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de saccharose à 62% à l’échantillon et mélangez bien par pipetage doux.Ensuite, ajoutez soigneusement 3,3 millilitres de solution de saccharose à 35% sur le dessus de l’échantillon, suivis de 2,2 millilitres de solution de saccharose à 25% sur la solution de saccharose à 35%. Enfin, remplissez le tube d’ultracentrifugation jusqu’au sommet avec un tampon d’homogénéisation. Centrifugez la colonne de gradient de densité et collectez soigneusement 12 fractions de 1 millilitre chacune, en commençant par le haut du gradient.Ensuite, diluez toutes les fractions avec un millilitre de tampon de dilution et centrifugez les échantillons dilués. Après centrifugation, aspirer le surnageant et ajouter 50 microlitres de tampon d’échantillon 1X pour récolter les fractions. Le marqueur d’endosomes de recyclage Rab11 a été détecté dans la fraction sept.D’autres marqueurs subcellulaires, notamment le bêta COP, la COX IV, le GAPDH, l’EEA1, le Rab 7 et le Lamp1 ont également été sondés. Un signal EEA1 positif a également été détecté dans la fraction sept. Les intensités de bande mesurées de GAPDH, Cox IV et Rab11 dans la fraction sept et le surnageant post-nucléaire sont montrées ici.Après avoir transecté des cellules HEC293 avec ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L ou ELMO1 ARF6Q67L FE65, aucun changement n’a été trouvé dans la distribution d’ELMO1 avec une surexpression d’ARF6Q67L et FE65. Le taux d’ELMO1 dans la fraction sept a été comparé entre différentes transfections et s’est avéré élevé après la cotransfection d’ARF6Q67L. Une autre augmentation a été observée lorsque ARF6Q67L et FE65 ont été co-exprimés.Inversement, l’élimination de FE65 a diminué l’enrichissement en Elmo1 médié par ARF6 dans la fraction sept. La fraction obtenue pourrait être utilisée pour une analyse ultérieure. Par exemple, le western blotting pour visualiser les changements de niveau de protéines dans la fraction.

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JoVE Journal

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Biochimie

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Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

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