Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères
30 juin 2021
Cet article vise à présenter un protocole de préparation d’endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose.
Ce protocole aide à isoler les endosomes de recyclage contenant une fraction des cellules de mammifères transfectées afin de faciliter l’investigation du trafic de protéines via le trafic endocytaire. Cette technique est facile à manipuler et applicable aux échantillons de tissus et de cellules. La démonstration de la procédure sera assurée par Mlle Zhai Yu Qi, doctorante du laboratoire du Dr Lao.
Pour commencer, plaquer 2 fois 10 aux 6 cellules dans une boîte de culture de 100 millimètres. Le lendemain, transfectez les cellules avec lipofectamine selon les instructions du fabricant. Pour récolter les cellules, jetez le milieu de culture 48 heures après la transfection et lavez les cellules deux fois avec du PBS glacé.
Ajoutez ensuite un millilitre de PBS glacé complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,5X dans un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase 0,5X à chaque plat. Ensuite, à l’aide d’un grattoir à cellules, collectez les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. les cellules par centrifugation à l’aide d’un rotor à godet oscillant.
Jetez le surnageant et remettez en suspension doucement la pastille cellulaire dans cinq millilitres de tampon d’homogénéisation. Prélever à nouveau les cellules par centrifugation et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon d’homogénéisation. Homogénéiser les cellules avec un homogénéisateur Dounce en utilisant 15 à 20 coups.
Transférez ensuite l’homogonate dans un tube de centrifugation de deux millilitres. Ajouter 700 microlitres de tampon d’homogénéisation à l’homogonate. Ensuite, faites tourner l’homogonate dilué et collectez 1,5 millilitre du surnageant.
Faites tourner à nouveau le surnageant collecté, puis collectez 1,4 millilitre du surnageant et étiquetez-le comme surnageant post-nucléaire. Pour préparer la colonne de gradient de densité, transférer 1,2 millilitre du surnageant post-nucléaire dans un tube ultracentrifuge. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de saccharose à 62% à l’échantillon et mélangez bien par pipetage doux.
Ensuite, ajoutez soigneusement 3,3 millilitres de solution de saccharose à 35% sur le dessus de l’échantillon, suivis de 2,2 millilitres de solution de saccharose à 25% sur la solution de saccharose à 35%. Enfin, remplissez le tube d’ultracentrifugation jusqu’au sommet avec un tampon d’homogénéisation. Centrifugez la colonne de gradient de densité et collectez soigneusement 12 fractions de 1 millilitre chacune, en commençant par le haut du gradient.
Ensuite, diluez toutes les fractions avec un millilitre de tampon de dilution et centrifugez les échantillons dilués. Après centrifugation, aspirer le surnageant et ajouter 50 microlitres de tampon d’échantillon 1X pour récolter les fractions. Le marqueur d’endosomes de recyclage Rab11 a été détecté dans la fraction sept.
D’autres marqueurs subcellulaires, notamment le bêta COP, la COX IV, le GAPDH, l’EEA1, le Rab 7 et le Lamp1 ont également été sondés. Un signal EEA1 positif a également été détecté dans la fraction sept. Les intensités de bande mesurées de GAPDH, Cox IV et Rab11 dans la fraction sept et le surnageant post-nucléaire sont montrées ici.
Après avoir transecté des cellules HEC293 avec ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L ou ELMO1 ARF6Q67L FE65, aucun changement n’a été trouvé dans la distribution d’ELMO1 avec une surexpression d’ARF6Q67L et FE65. Le taux d’ELMO1 dans la fraction sept a été comparé entre différentes transfections et s’est avéré élevé après la cotransfection d’ARF6Q67L. Une autre augmentation a été observée lorsque ARF6Q67L et FE65 ont été co-exprimés.
Inversement, l’élimination de FE65 a diminué l’enrichissement en Elmo1 médié par ARF6 dans la fraction sept. La fraction obtenue pourrait être utilisée pour une analyse ultérieure. Par exemple, le western blotting pour visualiser les changements de niveau de protéines dans la fraction.
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Aperçu
Cet article présente un protocole permettant la préparation de compartiments endosomaux recyclants à partir de cellules de mammifères en utilisant une ultracentrifugation sur gradient de densité de saccharose. Cette technique est conçue pour faciliter l'étude du trafic des protéines via les voies endocytiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Endocytose
- Trafic des protéines
Contexte
- Les endosomes de recyclage jouent un rôle crucial dans le trafic cellulaire.
- Comprendre le trafic des protéines est essentiel pour obtenir des informations sur divers processus cellulaires.
- L'ultracentrifugation est une technique largement utilisée pour isoler les composants cellulaires.
- Ce protocole est applicable aux échantillons de tissus et de cellules.
Objectif de l'étude
- Offrir une méthode fiable pour isoler les endosomes de recyclage.
- Approfondir la compréhension des mécanismes du trafic endocytique.
- Appuyer les recherches futures sur la dynamique des protéines au sein des cellules.
Méthodes utilisées
- Transfection de cellules de mammifères avec du Lipofectamine.
- Récupération des cellules 48 heures après la transfection.
- Lavage des cellules avec du PBS glacé.
- Utilisation de l'ultracentrifugation sur gradient de densité de saccharose pour l'isolement.
Résultats principaux
- Isolation réussie des endosomes de recyclage à partir de cellules transfectées.
- Démonstration du protocole par un étudiant en doctorat.
- Facilitation d'études supplémentaires sur le trafic des protéines.
- Validation de l'applicabilité de la méthode à divers types d'échantillons.
Conclusions
- Le protocole offre une approche simple pour isoler les endosomes de recyclage.
- Il devrait contribuer à la compréhension du trafic des protéines.
- Cette méthode peut être utilisée dans divers contextes de recherche biologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement des endosomes de recyclage permet une détection mécanistique des risques associés aux cibles du trafic endocytaire en fournissant des données quantitatives de fractionnement subcellulaire. Cela soutient la validation des cibles et le développement de tests pour les protéines régulant le recyclage des protéines membranaires, comme les effecteurs d'ARF6. La méthode renforce la confiance prédictive dans l'identification des candidats en reliant la localisation protéique aux voies fonctionnelles de recyclage.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques concernant des régulateurs du recyclage endocytaire tels que ARF6 et ELMO1.
- Valeur opérationnelle : Fournit des données de fractionnement permettant de clarifier les mécanismes de trafic protéique spécifiques à chaque voie.
- Valeur scientifique : Contribue à la détection biologique des risques en validant l'interaction avec la cible dans les fractions des endosomes de recyclage.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des fractions contenant des endosomes de recyclage validées pour une analyse par immunobuvardage en aval.
- Valeur opérationnelle : Permet l'isolement standardisé et reproductible d'organites pour la mesure quantitative des protéines.
- Valeur scientifique : Facilite la préparation aux essais pour le criblage de composés modulant le recyclage endocytique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Relie les données de trafic en phase de découverte à des modèles précliniques par l'isolement de la fraction positive pour Rab11.
- Valeur opérationnelle : Garantit la continuité entre la fractionation subcellulaire et la validation fonctionnelle dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur scientifique : Soutient une progression ajustée au risque en confirmant la localisation de la cible dans les voies de recyclage.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase initiale de découverte en isolant des fractions subcellulaires qui orientent les décisions de validation de cibles et d'identification de composés d'intérêt.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur les régulateurs du recyclage endocytaire par fractionnement et analyse de marqueurs.
- Essais : Facilite le développement de tests grâce à l'isolement normalisé de fractions positives pour Rab11 afin de quantifier les protéines.
- Analyse : Produit des résultats quantitatifs par immunobuvardage à partir de fractions, permettant de comparer l'enrichissement protéique entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les données de fractionnement à la continuité préclinique en validant l'isolement des endosomes de recyclage.
- Réutilisation institutionnelle : Offre une plateforme réutilisable de fractionnement subcellulaire applicable à plusieurs projets de validation de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies de trafic intracellulaire.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité et l'extensibilité de l'isolement des organites pour des analyses en aval cohérentes.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant des données de localisation subcellulaire pour les cibles impliquées dans les voies de recyclage.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles selon les données d'enrichissement dans les endosomes de recyclage.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, transfection et techniques d'ultracentrifugation.
- Est tributaire de l'accès à des rotors à bille et à des ultracentrifugeuses pour la séparation par gradient de densité.
- Exige une standardisation des protocoles de fractionnement entre les équipes afin d'obtenir une isolation comparable des fractions de Rab11.
- Requiert l'adaptation des panels de marqueurs (par exemple, Rab11, EEA1) selon les types cellulaires ou les voies de trafic.
- Est limité par la nécessité d'utiliser des marqueurs de validation pour confirmer la pureté des fractions avant les applications en aval.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
