Système onePot PURE sans cellule

Ce protocole pour un système d’expression protéique sans cellules recombinantes, communément appelé système PURE, utilise la culture cellulaire et la purification cellulaire pour rationaliser les purifications protéiques requises. Cela minimise considérablement les besoins en temps et en main-d’œuvre. La méthode OnePot s’est avérée non seulement rentable, mais aussi rapide.

Il réduit les temps de préparation de plusieurs semaines à trois jours ouvrables. Cela rend la plate-forme pure sans cellules accessible à un plus grand nombre de laboratoires dans le monde entier et aide à mettre en œuvre cette plate-forme vraiment puissante pour la biologie synthétique sans cellules. Avant de commencer, assurez-vous que toutes les souches sur expriment bien leur protéine respective.

Pour commencer, préparez la colonne pour la purification de la protéine OnePot comme décrit dans le manuscrit du texte en utilisant deux millilitres de résine Sepharose, puis chargez la colonne avec du sulfate de nickel. Préparez les cultures de démarrage en combinant 20 millilitres de milieu LB avec 20 microlitres d’ampicilline. Ajouter 300 microlitres du milieu dans 35 puits d’une plaque de puits stérile de 96 profondeurs.

Inoculez chacun d’eux avec sa souche respective, à l’exception du facteur d’allongement thermo instable, ou EFTU, et scellez la plaque avec une membrane respirante. Pour la culture EFTU, inoculer trois millilitres d’ampicilline contenant du milieu LB dans un tube de culture de 14 millilitres avec un capuchon encliquetable. Environ trois millilitres de culture EFTU sont suffisants pour une culture d’expression OnePot.

Incubez-le à 37 degrés Celsius tout en secouant à 260 rotations par minute pendant la nuit. Le lendemain, transférez 500 millilitres de milieu LB et 500 microlitres d’ampicilline dans la fiole stérile déconcertée. Inoculer la culture OnePot PURE avec 1 675 microlitres de la culture EFTU et 55 microlitres de chacune des cultures de la plaque de puits profond.

Incuber la culture pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec une secousse de 260 rotations par minute, ou jusqu’à ce que la densité optique de la culture atteigne 0,2 à 0,3. Induire la culture avec 500 microlitres de 0,1 millimolaire IPTG et croître pendant trois heures supplémentaires. Récoltez les cellules par centrifugation à quatre degrés Celsius et 3 220 fois G pendant 10 minutes, et conservez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure.

Le troisième jour, mesurez les quantités de tampons nécessaires à leur purification et ajoutez du TCEP à chacun d’eux comme indiqué dans le texte. Stockez les tampons restants sans TCEP à quatre degrés Celsius pour les purifications futures. Équilibrez la colonne chargée avec 30 millilitres de tampon A.Après le passage de 25 millilitres de tampon A, fermez la colonne par le bas.

Décongelez les cellules et utilisez une pipette sérologique pour ressuspender la pastille de cellule dans 7,5 millilitres de tampon A.Lyse les cellules à l’aide d’une sonde de 130 watts. Si la sonication réussit, la solution deviendra plus sombre. Assurez-vous de garder les cellules sur la glace et placez la sonde assez profondément sans toucher le tube.

Enlevez les débris cellulaires par centrifugation à 21, 130 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et gardez le lysate sur la glace. Ajoutez le surnageant à la colonne équilibrée. Fermez la colonne par le haut et assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite.

Incuber la colonne pendant trois heures à quatre degrés Celsius en rotation à l’aide d’un rotateur à tube. Éluez les composants non liés de la colonne et lavez avec 25 millilitres de tampon A.Lavez la colonne avec 25 millilitres de tampon imidazole de 25 millimolaires. Éluez les protéines avec cinq millilitres de tampon imidazole de 450 millimolaires et gardez les protéines éluées sur la glace en tout temps.

Diluer l’éluat avec 25 millilitres de tampon HT et garder le mélange sur glace. Ajouter 15 millilitres à un filtre centrifuge de 15 millilitres et concentrer à un volume de 1,5 millilitre. Ajouter les 15 millilitres restants au filtre avec la solution concentrée et concentrer à nouveau à 1,5 millilitre.

Ajouter 10 millilitres de tampon HT à l’échantillon concentré et concentrer à un millilitre. Récupérez l’échantillon concentré et ajoutez une quantité égale de tampon B et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Pendant l’échange de mémoire tampon, restaurez la colonne comme spécifié dans le texte.

Le quatrième jour, mesurez la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford. Concentrer l’échantillon avec 0,5 millilitre de filtre centrifuge de coupure de trois kilodaltons à 20 milligrammes par millilitre. Vérifiez la composition de la protéine OnePot PURE à l’aide de la page SDS.

Diluer 2,5 microlitres de l’échantillon avec 7,5 microlitres d’eau mélangés à 10 microlitres de deux tampons X Laemmli, puis charger cinq microlitres et 2,5 microlitres des échantillons sur le gel. Exécutez la page SDS comme spécifié dans le texte. Remplissez la concentration et la longueur de l’ADN dans les cellules jaunes correspondantes dans la feuille de calcul en utilisant deux à 10 nanomolaires d’ADN pour la réaction.

Remplissez le volume total de réaction souhaité en microlitres. Retirez les réactifs requis du congélateur et décongelez-les sur de la glace. Ensuite, pipettez les quantités calculées d’eau, d’ADN et de solution d’énergie d’un côté du tube PCR ou d’un coin d’un puits sur la plaque de puits 384.

Pipeter les quantités calculées de protéines et de solution de ribosomes de l’autre côté d’un tube pcR ou dans le coin opposé de la plaque de puits 384. Tournez pendant environ 30 secondes pour fusionner les composants de la réaction. Pour éviter l’évaporation pendant les expériences de lecture de plaques, ajoutez 35 microlitres de cire liquide et scellez la plaque avec un scellant transparent.

Incuber pendant au moins trois heures à 37 degrés Celsius. Pour la lecture sur un lecteur de plaques, mesurez l’intensité de la floraison à la longueur d’onde requise toutes les deux minutes. La sur-expression réussie dans toutes les souches individuelles utilisées par la suite pour la préparation de protéines OnePot est montrée ici.

La composition globale de la solution finale de protéine OnePot PURE a été analysée par page SDS. Il est à noter que l’EFTU est présent à une concentration plus élevée par rapport aux autres protéines, comme prévu. Les rendements de synthèse de la solution protéique OnePot combinée aux ribosomes marqués ou non marqués his ont été analysés en surveillant la fluorescence eGFP au fil du temps.

Les niveaux d’expression de trois protéines différentes étiquetées à l’aide du système de étiquetage in vitro de l’ARNt de la liste verte, ou coloration de Kumasi, ont été analysés sur un gel de page SDS. Pour un système PURE fonctionnel, il est absolument essentiel que toutes les souches expriment bien leurs protéines respectives. Cette technique facilite la mise en œuvre du système PURE dans l’ingénierie des systèmes biologiques, permettant le développement de nouveaux réseaux génétiques, de diagnostics moléculaires, de thérapies et de kits éducatifs.