Expériences de RMN à haute pression pour détecter les états conformationnels bas des protéines

La haute pression est la méthode de choix pour modifier la population relative d’un échantillon conformationnel de protéines. Il est extrêmement utile pour isoler et caractériser les états conformationnels à haute énergie. Par rapport à toutes les méthodes de perturbation, comme le pH ou la température, la perturbation de pression est facile à appliquer et entièrement réversible.

Il s’agit également d’une perturbation locale, affectant principalement les régions avec des cavités de verre ou des volumes vides. Pour commencer, introduisez l’échantillon marqué à l’azote 15 dans le tube en zircone à l’aide d’une pipette en verre et assurez-vous que l’échantillon se trouve au bas du tube. Pour éviter que l’échantillon ne se mélange au liquide de transmission, superposez l’échantillon avec 200 microlitres d’huile minérale, puis remplissez le reste du tube avec du liquide de transmission.

Placez un joint torique à usage unique sur le dessus du tube en zircone et faites glisser le tube dans la base. Ensuite, connectez le tube à la ligne d’attache haute pression et serrez la base à la cellule à la main. Appliquez ensuite un couple de 14,7 newtons-mètres pour éviter les fuites à basse pression.

Pour vérifier l’intégrité de l’ensemble de la cellule de pression, pressuriser le tube jusqu’à 300 bars à l’extérieur du spectromètre à l’aide du support de cellule et du récipient de confinement. Après 15 minutes, réinitialisez la pression à une barre et vérifiez les fuites avec une lingette propre non pelucheux. Insérez le tube non pressurisé dans le spectromètre en guidant soigneusement la ligne d’attache.

Faites glisser le tube dans le spectromètre jusqu’à ce que le tube atteigne la position assise de l’échantillon. Verrouillez, calez, assortissez et réglez les canaux de protium et d’azote et enregistrez les cales optimisées pour l’avenir. Mettre en place une spectroscopie optimisée pour la relaxation transversale avec une spectroscopie cohérente hétéro-quantique et procéder à l’enregistrement d’une expérience de référence dans les conditions atmosphériques.

Enregistrez une série d’expériences 2D d’une barre à 2,5 kilobars pour 500 barres. Si les taux précis de pliage ou de dépliage sont connus, après chaque incrément de 500 barres, laissez l’échantillon s’équilibrer pendant 15 à 20 minutes. Lorsque le point d’inflexion de la transition de pliage ou de dépliage atteint, enregistrez des expériences supplémentaires pour améliorer la précision de l’ajustement.

Ce protocole a été utilisé pour sonder la dépendance à la pression de RRM2, le deuxième motif de reconnaissance d’ARN hétérogène de la ribonucléoprotéine nucléaire A1. La spectroscopie optimisée pour la relaxation transversale avec des spectres de spectroscopie de cohérence hétéro quantique unique a été collectée à une barre, 1,5 kilobars, deux kilobars et 2,5 kilobars. Le RRM2 est presque entièrement déplié dans la plage de 2,5 kilobars. Des profils individuels d’intensité de pression ont été ajustés selon l’équation présentée ici, afin d’obtenir les changements correspondants dans l’énergie libre de Gibbs standard et le volume associés à la réaction de déroulement.

Lorsqu’ils ont été cartographiés sur la structure du domaine, les résidus ayant la plus grande amplitude de changement de volume ont été trouvés dans le noyau structurel du domaine, tandis que ceux ayant la plus petite magnitude de changement de volume étaient principalement situés dans les boucles de connexion entre les brins bêta et le brin bêta à l’hélice terminale C. Pour sonder le degré de compressibilité et d’hétérogénéité conformationnelle de l’ensemble d’état plié, les changements chimiques du protium ont été analysés. Des profils individuels des changements chimiques du protium en fonction de la pression ont été ajustés à l’aide de l’équation montrée, afin d’extraire les coefficients linéaires et non linéaires spécifiques au site.

Les résidus avec les plus grands coefficients non linéaires se trouvaient principalement dans le noyau structurel du domaine, tandis que les résidus avec les plus petits coefficients non linéaires étaient principalement situés dans des boucles reliant les différents motifs structurels. Il est important de configurer correctement le tube en tant que jeu de pression, afin d’éviter les fuites. Si une fuite se produit, la sonde devra probablement être retirée pour nettoyer toute trace d’huile minérale.