Dissection planaire de l’ovaire pour l’analyse ultrastructurale et la coloration des anticorps
10 septembre 2021
Ce protocole présente les étapes prises pour disséquer les ovaires chez les planaires d’eau douce, Schmidtea mediterranea. Les ovaires disséqués sont compatibles pour l’immunocoloration par anticorps et l’analyse ultrastructurale avec microscopie électronique à transmission pour étudier la biologie cellulaire des ovocytes et des cellules somatiques, offrant une profondeur et une qualité d’imagerie qui étaient auparavant inaccessibles.
Le but de cette méthode est de disséquer les ovaires du Planaire Schmidtea mediterranea pour l’analyse cellulaire et subcellulaire de la biologie des ovocytes avec TEM ou coloration par anticorps. Ce protocole utilise une brève étape de fixation pour faciliter la localisation et la dissection des ovaires planaires, ce qui fournira une profondeur et une qualité d’imagerie auparavant inaccessibles. La plus grande difficulté pour quelqu’un qui n’a jamais pratiqué cette technique auparavant sera de localiser les ovaires après la fixation.
Il sera utile de se familiariser avec l’anatomie des planaires sexuels avant l’expérience. Préparez-vous à l’expérience en nourrissant les planaires sexuels avec de la pâte de foie biologique deux fois par semaine pour atteindre la maturité sexuelle. Traitez les vers sexuellement matures avec 5 % de N-acétyl-L-cystéine, ou NAC, dans une coupelle à température ambiante pendant cinq minutes.
Remplacez le NAC par 10 millilitres de paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparé, et fixez les vers pendant une heure à température ambiante en les secouant de temps en temps. Commencez la dissection 10 minutes après avoir ajouté 4% de paraformaldéhyde pendant que les vers sont en train de se fixer. Observez la pigmentation épithéliale pour localiser les cordons nerveux ventraux, qui apparaissent comme deux lignes avec une pigmentation plus claire allant des ganglions céphaliques antérieurs vers la queue.
Localiser les ovaires présumés en observant la pigmentation et valider leur position. À l’aide de deux couteaux chirurgicaux, faites des incisions à l’arrière et à l’avant des ovaires pour enlever complètement les fragments de vers antérieurs et postérieurs. Utilisez un couteau pour ancrer le ver et l’autre couteau pour la dissection.
Nettoyez le couteau utilisé pour faire les coupes. Pour séparer les deux ovaires, coupez la ligne médiane du fragment d’ovaire, puis retournez le fragment côté ventral vers le bas. Utilisez deux paires de pinces pointues de type 5-SA pour décoller le tissu dorsal afin d’exposer l’intestin.
Retirez délicatement les branches intestinales situées au-dessus des tissus ventraux avec la pointe de la pince à épiler ou une brosse douce pour exposer l’ovaire. Retirez les tissus environnants pour retirer l’ovaire. Retirez les ovaires et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre pour les laver avec 1 millilitre de PBS.
Les motifs de pigmentation dorsale et ventrale ont été utilisés pour localiser la position des ovaires. L’excès de tissu a été coupé étape par étape. Une fois l’ovaire exposé, le tissu environnant a été coupé.
Des ovaires contenant plusieurs types de cellules somatiques ont été utilisés à la fois pour l’analyse ultrastructurale et la coloration par immunofluorescence. Les ovaires disséqués permettent une imagerie de haute qualité de l’anatomie cellulaire et subcellulaire des ovocytes. Cette procédure devrait permettre des expériences d’interférence d’ARN pour examiner les régulations moléculaires de la biologie des ovocytes.
Cette technique a conduit à la découverte d’un nouveau phénomène dans les ovocytes de vers plats selon lequel l’enveloppe nucléaire se décompose en vésicules encapsulant des protéines nucléaires au lieu de rester intactes, c’est-à-dire la mitose fermée, ou de se briser en morceaux, c’est-à-dire la mitose ouverte.
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Aperçu
Ce protocole décrit la dissection des ovaires chez le planaire d'eau douce Schmidtea mediterranea, destinée à permettre l'analyse cellulaire et subcellulaire de la biologie des ovocytes. La méthode améliore la qualité et la profondeur de l'imagerie grâce à des techniques telles que la microscopie électronique en transmission (MET) et l'immunomarquage par anticorps.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Analyse des ovocytes
- Biologie des planaires
Contexte
- L'anatomie des planaires sexuées est essentielle pour une dissection efficace.
- L'alimentation des planaires avec une pâte hépatique organique favorise la maturité sexuelle.
- Les ovaires sont localisés en fonction des motifs de pigmentation épithéliale.
Méthodes utilisées
- Méthodes de dissection chirurgicale
- Plathelminthe d'eau douce Schmidtea mediterranea
- Microscopie électronique en transmission (MET) et coloration immunofluorescente
Résultats principaux
- Localisation et dissection efficaces des ovaires chez les planaires sexués.
- Imagerie de haute qualité des structures cellulaires et des types de cellules somatiques.
- La méthode permet des expériences d'interférence ARN pour étudier les régulations moléculaires.
Conclusions
- Cette étude propose une technique novatrice pour l'analyse des cellules reproductrices chez les planaires.
- Elle approfondit la compréhension de la biologie des ovocytes et soutient les futures études génétiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'accès direct aux ovaires intacts de planaires permet une analyse à haute résolution du développement des cellules germinales, soutenant une détection mécanistique des risques en phase de découverte précoce. Ce protocole facilite l'imagerie quantitative et l'interrogation moléculaire de la biologie des ovocytes, renforçant la fiabilité prédictive des études sur la lignée germinale. Cette approche est particulièrement adaptée pour guider la validation de cibles et la génomique fonctionnelle dans les pipelines de biologie de la reproduction.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une analyse précise du développement des cellules germinales et des processus méiotiques.
- Permet la validation fonctionnelle de perturbations géniques par interférence ARN dans les ovocytes.
- Améliore la clarté mécanistique pour la sélection des cibles reproductrices et la réduction des risques.
Développement de criblages et de tests
- Permet une préparation standardisée des ovaires intacts pour l'imagerie en aval et les dosages basés sur les anticorps.
- Facilite une analyse quantitative reproductible des structures cellulaires et subcellulaires.
- Permet une évaluation robuste de la fonction des gènes dans des conditions expérimentales contrôlées.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour l'étude de l'épigénétique germinale et de l'architecture cellulaire dans les maladies.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique des cibles reproductrices.
- Offre des perspectives prédictives sur les mécanismes conservés de la biologie de l'ovocyte.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de dissection s'intègre aux étapes précoces de la découverte et de la validation de cibles, permettant des analyses ultrastructurales et d'immunomarquage en aval. Il soutient les flux de travail allant de la vérification d'hypothèses à l'évaluation de la fonction génique dans les systèmes germinaux.
- Découverte en biologie : Facilite les études fondées sur des hypothèses concernant la spécification des cellules germinales et la régulation de la méiose.
- Criblage : Fournit des tissus ovariens prêts à l'analyse pour l'imagerie quantitative et le criblage d'anticorps.
- Analytique : Fournit des données cellulaires et subcellulaires à haute résolution pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte fondamentale à l'évaluation préclinique de cibles reproductrices.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un protocole réutilisable pour diverses études sur la lignée germinale et les perturbations géniques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté dans la validation des cibles cellulaires germinales.
- Valeur opérationnelle : Normalise les protocoles de dissection et d'imagerie ovarienne afin d'assurer la reproductibilité.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées de type « poursuivre/interrompre » dans les programmes de biologie de la reproduction.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles germinales et des études sur la fonction génique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en anatomie des planaires et en techniques de dissection.
- Suppose l'accès à une infrastructure de microscopie électronique en transmission et de coloration immunohistochimique.
- Exige une standardisation entre équipes pour la préparation des tissus et l'imagerie reproductible.
- Une adaptation pourrait être nécessaire pour d'autres systèmes modèles d'invertébrés ou de lignée germinale.
- Limité par le faible nombre et la localisation profonde des ovocytes chez les planaires.
