Name: Un modèle intact de rongeur ischémique péricardique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Découvrez une méthode de ligature coronaire chez la souris préservant le péricarde intact pour étudier la réparation cardiaque post-infarctus. Cette approche permet d'évaluer le rôle du péricarde et de ses macrophages résidents dans la cicatrisation.

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Des souris C57BL/6J mâles et femelles âgées de 8 à 14 semaines ont été utilisées pour ces expériences. Ce protocole a reçu l’approbation éthique du Comité de protection des animaux de l’Université de Calgary et respecte toutes les lignes directrices sur les soins aux animaux.
1. Préparation et chirurgie de la souris
<ol><li>Stériliser les outils chirurgicaux (via un stérilisateur de billes ou un autoclave).</li>
	<li>Peser la souris pour le poids préchirurgical et la dose analgésique.</li>
	<li>Placez la souris dans une boîte à induction contenant 4 % d’isoflurane et 800 mL/min d’oxygène. Confirmez le plan anesthésique en pinçant les orteils et en observant l’animal par manque de réflexe.</li>
	<li>Injecter un analgésique par voie sous-cutanée (0,1 mg/kg de buprénorphine) (voir le tableau des matières).</li>
	<li>Placez la souris sur un coussin chirurgical chauffé pendant la chirurgie et maintenez l’anesthésie avec 3% d’isoflurane administré par cône nasal. Appliquez une pommade ophtalmique pour éviter les yeux secs sur chaque œil.</li>
	<li>Rasez les cheveux des zones chirurgicales de la poitrine et du cou.</li>
	<li>Retenez les pattes de la souris et positionnez-les sur la table chirurgicale.</li>
	<li>Intuber la souris en insérant un cathéter lisse de 23 G dans la trachée par la bouche et le pharynx.<ol><li>Ventiler la souris après l’intubation avec 2 % d’isoflurane et 100 % d’oxygène comme gaz porteur à l’aide d’un ventilateur commercial (voir le tableau des matériaux) réglé à un débit de 110 respirations/min, un volume courant de 250 μL et une pression expiratoire positive (PEP) de 4 mmHg.</li>
	</ol></li>
	<li>Rouler la souris à 30% sur son côté droit pour positionner le côté gauche de la poitrine pour la chirurgie.</li>
	<li>Nettoyez la zone chirurgicale avec 3 gommages alternés d’éthanol à 70 % et de bétadine dans un mouvement circulaire (voirle tableau des matériaux). Placez des champs chirurgicaux stériles autour de la zone chirurgicale.</li>
	<li>Faites une incision latérale de 2-3 cm dans la peau de la poitrine pour visualiser les muscles pectoraux du côté gauche. Couper le grand et le mineur pectoral à l’aide d’une incision de 1 cm de la ligne médiane vers l’extérieur pour visualiser les muscles intercostaux entre la troisième et la quatrième côte. NOTE: Des précautions doivent être prises pour éviter les saignements excessifs du muscle pectoral par cautérisation des vaisseaux saignants.</li>
	<li>Faites une incision de 2 cm dans le muscle intercostal gauche pour introduire de l’air (par mouvement d’air passif) dans la cavité thoracique afin de permettre au cœur et aux poumons de s’éloigner de l’incision chirurgicale. En outre, élargir l’ouverture à l’aide d’un dispositif de cautérisation (voir le tableau des matériaux) pour inciser l’intercostal et prévenir les saignements NOTE: Le ventilateur doit être arrêté temporairement pendant la période de cautérisation pour éviter les réactions explosives avec l’oxygène. On veille à ne pas endommager le sac péricardique.</li>
	<li>À l’aide de rétracteurs, rétractez les côtes pour exposer le cœur.</li>
	<li>Observez le péricarde et le cœur sous-jacent au stéréomicroscope. REMARQUE: Le péricarde de la souris est assez mince pour visualiser le système vasculaire du cœur.</li>
	<li>Placez délicatement une pince à la surface du péricarde pour réduire son mouvement et celui du cœur sous-jacent.</li>
	<li>Repère visuellement l’artère coronaire descendante antérieure gauche (LAD) en traçant son émergence sous l’appendice gauche.</li>
	<li>À l’aide du conducteur à micro-aiguilles, guider une suture appropriée (voir le tableau des matériaux) à travers le péricarde, sous le DAL, la suture émergeant de l’autre côté du DAL et du péricarde. Attachez la suture pour restreindre le flux sanguin dans l’artère coronaire et coupez l’excès de suture à l’aide de ciseaux (Figure 1A). REMARQUE: Lors de la restriction du flux sanguin vers l’artère coronaire, le blanchiment de la partie antérieure du ventricule gauche devrait être visible. Cette procédure représente un modèle de ligature permanente. Cependant, une approche de ligature transitoire avec différentes périodes d’ischémie pourrait également être appliquée à ce stade.</li>
	<li>Sous le site d’incision dans la zone stérile, introduisez un cathéter de 24 G par voie percutanée dans la poitrine (retirez l’aiguille guide après être entré dans la cavité thoracique). Ensuite, fermez les côtes suivies des couches musculaires et de la peau à l’aide d’une suture appropriée (une aiguille conique pour le muscle, une aiguille de coupe conventionnelle pour la peau).</li>
	<li>Une fois la poitrine fermée, évacuez l’air restant de la cavité thoracique via le cathéter de 24 G en utilisant une aspiration douce avec une seringue de 3 ml et des compressions thoraciques. Une fois l’air retiré, retirez le cathéter de 24 G.</li>
	<li>Réduire l’isoflurane à 1%.</li>
	<li>Éteignez l’isoflurane tout en maintenant la ventilation avec de l’oxygène pour permettre à la souris de récupérer de l’anesthésie. Une fois que l’animal montre des signes de respiration autonome, retirez le tube trachéal de 23 G de la bouche et placez la souris dans une cage de récupération pour être surveillée pour la reprise de la respiration normale.</li>
	<li>Laissez la souris récupérer dans la cage avec une partie de la cage placée sur un coussin chauffant pour fournir une source de chaleur externe.</li>
	<li>Fournir des injections d’entretien d’analgésique (Buprénorphine 0,1 mg/kg, par voie sous-cutanée) toutes les 12 h pendant 72 h après la chirurgie.</li>
	<li>Surveillez quotidiennement l’état de santé des souris pendant 7 jours, ce qui comprend l’évaluation des incisions et de l’inconfort des animaux. REMARQUE: En raison du caractère invasif de cette procédure (thoracotomie), l’administration d’antibiotiques peut être nécessaire.</li>
</ol>2. Évaluation fonctionnelle de la fonction cardiaque par échocardiographie (ECG)
<ol><li>Induire et maintenir la souris sous anesthésie générale avec 1,5-2% d’isoflurane et 800 mL/min d’oxygène.</li>
	<li>Placez la souris en décubitus dorsal sur une plate-forme de scène chauffée et attachez les pattes aux fils ECG.</li>
	<li>Rasez la poitrine de la souris.</li>
	<li>Acquérir des images d’échocardiographie à l’aide d’une sonde à transducteur linéaire de 40 MHz et d’un gel de contact et les analyser avec le logiciel approprié (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Éteignez l’isoflurane et laissez la souris récupérer sur la plate-forme chauffante avant de remettre la cage à l’état actif. REMARQUE: L’évaluation par échocardiographie est non invasive et peut donc être effectuée longitudinalement tout au long de l’expérience pour déterminer les changements avant et après la ligature coronaire.</li>
</ol>3. Collecte de tissu cardiaque pour la coloration de la fibrose
<ol><li>Sacrifiez les souris avec inhalation de 100% CO2 et disséquez soigneusement le cœur. REMARQUE: À l’aide de ciseaux et de pinces, ceci est réalisé en coupant à travers les gros vaisseaux entrant (veine cave, veine pulmonaire) et sortant (artère pulmonaire, aorte) du cœur pour le libérer du système circulatoire dans la cavité thoracique.</li>
	<li>Fixez le cœur dans du formol à 10% pendant au moins 24 h.</li>
	<li>Couper les échantillons à l’aide d’une lame de rasoir droite à travers le ventricule droit, le septum interventriculaire et le ventricule gauche, en veillant à ce que l’incision passe par le centre de la zone de l’infarctus. Les échantillons sont ensuite envoyés à l’installation centrale pour l’incorporation de paraffine.</li>
	<li>Couper des sections de tissu de 5 μm d’épaisseur avec un microtome et les placer sur des lames de verre pour les colorer.</li>
	<li>Déparaffiner à l’aide de xylène commercial et de lavages à l’alcool gradués (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) avec de l’eau désionisée, puis réhydrater.</li>
	<li>Coloration avec 0,1% de rouge Sirius dans de l’acide picrique pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver les sections avec de l’acide acétique à 0,5 % pendant 3 min et rincer à l’éthanol à 70 % pendant 1 min.</li>
	<li>Déshydrater les sections en utilisant l’ordre inverse des lavages décrit au point 3.4, avec des concentrations croissantes et graduées d’éthanol puis de xylène.</li>
	<li>Montez les sections de tissu avec une solution de montage (voir le tableau des matériaux) pour une évaluation microscopique.</li>
</ol>4. Cytométrie en flux du lavage du cœur et de la cavité péricardique
<ol><li>Sacrifiez les souris avec inhalation de 100% CO2 à effet.</li>
	<li>Placez la souris sur son dos et fixez les bras et les jambes à une planche chirurgicale à l’aide de ruban adhésif.</li>
	<li>Ouvrez soigneusement le côté gauche (côté droit de la vue de l’expérimentateur) de la cavité thoracique, en commençant par couper le diaphragme jusqu’au point médian, puis en coupant à travers les côtes extérieures vers le sternum. REMARQUE: Évitez d’entailler les gros vaisseaux sanguins, en particulier ceux qui sont parallèles au sternum.</li>
	<li>Rétractez les côtes à l’aide d’un hémostatique pour exposer le cœur et le péricarde sous-jacents. NOTE: Le péricarde est très fragile, alors assurez-vous de ne pas l’attraper avec des ciseaux pendant la coupe.</li>
	<li>À l’aide d’un cathéter PE-10 inséré dans l’espace péricardique près de la jonction de l’oreillette gauche et du ventricule gauche, injecter 100 μL de solution saline stérile dans la cavité péricardique.<ol><li>Laissez la solution saline s’accumuler et s’accumuler du côté postérieur du cœur, en prenant soin de ne pas percer ou déchirer le péricarde dans le processus. Répétez cette étape deux fois et placez le liquide de lavage sur la glace pendant le traitement du cœur.</li>
	</ol></li>
	<li>Extrayez le cœur en coupant les principaux vaisseaux (aorte, artère pulmonaire, veine et veine cave) entrant et sortant du cœur. Retirez les oreillettes droite et gauche et pesez le tissu cardiaque ventriculaire.</li>
	<li>Hacher le tissu en petits morceaux de 1 mm2 à l’aide de ciseaux et les placer dans 10 mL de tampon de digestion contenant 450 U/mL de collagénase I, 125 U/mL de collagénase XI, 60 U/mL de DNase I et 60 U/mL de hyaluronidase dans du PBS pendant 1 h à 37 °C sur un agitateur orbital.</li>
	<li>Faire passer les homogénats de tissu cardiaque dans une crépine cellulaire de 70 μm (voir le tableau des matériaux) et faire tourner vers le bas à 60 x g pendant 5 minutes à 4 °C pour éliminer les cellules parenchymateuses cardiaques.</li>
	<li>Recueillir le surnageant, passer à travers une crépine cellulaire de 40 μm (voir le tableau des matériaux) pour une suspension unicellulaire, et faire tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules.</li>
	<li>Effectuer le blocage des récepteurs cristallisables par fragment (Fc) et la coloration des marqueurs cellulaires sur les cellules péricardiques et cardiaques comme décrit précédemment8.</li>
	<li>Exécuter des échantillons sur un cytomètre en flux.</li>
</ol>5. Marquage du macrophage péricardique à l’aide de la méthode ICAPS (Intercostal Approach to the Pleural Space)9
<ol><li>Stérilisez les outils chirurgicaux (à l’aide d’un stérilisateur à billes ou d’un autoclave) et vaporisez de l’éthanol à 70 % avant de commencer.</li>
	<li>Induire et maintenir la souris sous anesthésie générale avec 1,5-2% d’isoflurane et 800 mL/min d’oxygène. Confirmez le plan anesthésique en pinçant les orteils et en observant l’animal par manque de réflexe.</li>
	<li>Injecter un analgésique par voie sous-cutanée (Buprénorphine 0,1 mg/kg).</li>
	<li>Placez la souris sur un coussin chirurgical chauffé pendant la chirurgie.</li>
	<li>Rasez la région thoracique antérolatérale droite.</li>
	<li>Nettoyez la zone chirurgicale avec de l’éthanol et de la bétadine.</li>
	<li>Faites une incision de 3 cm de long dans la peau et, avec une pince, exposez la cage thoracique.</li>
	<li>Charger 5 μL de billes fluorescentes (microsphères fluorescentes disponibles dans le commerce, 1 μm, voir le tableau des matériaux) et 45 μL de solution saline dans un cathéter de seringue à tubulure PE-10 muni d’une pointe biseautée.</li>
	<li>Guidez le cathéter dans l’espace intercostal comme décrit précédemment9, injectez lentement la solution de bille et retirez le cathéter en un seul mouvement.</li>
	<li>Fermez la peau à l’aide d’agrafes. REMARQUE: Des agrafes sont utilisées à la place des sutures pour minimiser la réouverture potentielle de l’incision.</li>
	<li>Éteignez l’isoflurane, placez la souris dans la cage de récupération et surveillez les complications au cours des premières 24 heures.</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141, 139(2020).</li>
<li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).</li>
<li>Bayat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+heart+failure+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Progressive heart failure after myocardial infarction in mice.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. 52, 2581(2011).</li>
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<li>Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardium+of+rodents%3A+pores+connect+the+pericardial+and+pleural+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities.</a> The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).</li>
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<li>Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+left+and+right+pericardial+pressures+in+humans%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).</li>
<li>Park, D. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pericardial+proteoglycan+4+%28lubricin%29%3A+Implications+for+postcardiotomy+intrathoracic+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit à révéler.

L’induction d’un IM dans un péricarde fermé chez les rongeurs est unique et peut avoir des applications potentiellement importantes. La procédure repose fortement sur la familiarité du chirurgien avec le modèle de rongeur et l’anatomie cardiaque des rongeurs. Le succès dépend également des soins prodigués au cours de trois étapes critiques: l’incision musculaire intercostale et la rétraction des côtes (étapes 1.11-1.13), la création de l’infarctus (étape 1.17) et la récupération de l’animal (étapes 1.22-1.24).
<p cla...

À ce jour, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont reconnues comme la principale cause de décès dans le monde, entraînant un fardeau financier important et une réduction de la qualité de vie des patients1. La coronaropathie (CAD) est un sous-type de MCV et joue un rôle essentiel dans le développement de l’infarctus du myocarde (IM), qui est l’un des principaux contributeurs à la mortalité. Par définition, l’IM résulte d’une lésion irréversible du tissu myocardique due à des conditions prolongées d’ischémie et d’hypoxie. Le tissu myocardique manque de capacité de régénération, de sorte que les blessures sont permanentes et entraînent le remplacement du muscle cardiaque par une cicatrice fibrotique qui peut être initialement protectrice, mais qui contribue finalement à un remodelage cardiaque indésirable et à une éventuelle insuffisance cardiaque2.
Bien que la prise en charge des patients atteints de coronaropathie se soit considérablement améliorée au cours des dernières décennies, l’insuffisance cardiaque chronique (ICC) secondaire à l’ischémie affecte de nombreux patients dans le monde. Pour prévenir et gérer cette épidémie, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les résultats antérieurs soulignent les limites de la thérapie systémique et la nécessité de développer des alternatives précises. Étant donné que l’étude des séquelles moléculaires de l’IM chez l’homme est affectée par la capacité d’accéder aux tissus infarctus, des modèles animaux qui récapitulent les caractéristiques et le développement de l’IM humain et de l’ICC liés aux MCV sont indispensables.
Comme les modèles animaux idéaux ressemblent beaucoup à un trouble humain pour leurs caractéristiques structurelles et fonctionnelles, l’étiologie de la maladie devrait guider leur conception. Dans la coronaropathie, il s’agit de la sténose athéroscléreuse chronique des artères coronaires ou de l’occlusion thrombotique aiguë. Différentes méthodes ont été développées et appliquées chez diverses espèces d’animaux de laboratoire pour induire le rétrécissement ou l’occlusion des artères coronaires. De telles stratégies peuvent être classées en deux groupes: (1) manipulation mécanique d’une artère coronaire pour induire un IM et (2) accélération de l’athérosclérose pour faciliter le rétrécissement coronaire conduisant à un IM. La première stratégie implique généralement soit la ligature d’une artère coronaire, soit la mise en place d’un stent dans l’artère. La deuxième approche tend à s’appuyer sur la modification du régime alimentaire de l’animal pour inclure des aliments riches en graisses / cholestérol. Certaines des limites de cette dernière approche comprennent le manque de contrôle sur le moment et le site des occlusions coronaires.
En revanche, l’induction chirurgicale de l’IM ou de l’ischémie dans un modèle animal présente plusieurs avantages, tels que l’emplacement, le moment précis et l’étendue de l’événement coronarien, conduisant à des résultats plus reproductibles. La méthode la plus largement utilisée est la ligature chirurgicale de l’artère coronaire descendante antérieure gauche (DAL). Ces modèles récapitulent les réponses humaines aux lésions ischémiques aiguës, ainsi que la progression versCHF 3. Initialement développée chez les grands animaux, la chirurgie LAD sur de petits animaux tels que les rongeurs est devenue plus réalisable avec les progrès de la technologie4. Dans l’établissement de tels modèles, les souris ont été favorisées pour diverses raisons, notamment leur disponibilité relative, leur faible coût en logement et leur capacité de manipulation génétique.
Les modèles chirurgicaux contemporains de cardiopathie ischémique utilisant l’occlusion LAD nécessitent que le chercheur ouvre le péricarde pour ligaturer temporairement ou définitivement l’artère5. De telles stratégies entraînent la perturbation de l’espace péricardique, qui joue une fonction essentiellement mécanique et lubrifiante pour assurer une fonction cardiaque adéquate. Un autre inconvénient de l’ouverture du péricarde est de perdre le liquide péricardique natif de l’animal avec ses divers composants cellulaires et protéiques 6,7. En réponse, une méthode pour induire l’IM tout en gardant le péricarde intact a été développée par nous. En plus de minimiser la perturbation de cet environnement homéostatique, cette approche permet de marquer et de tracer des cellules spécifiques après avoir causé un IM. De plus, cette approche représente mieux les lésions ischémiques myocardiques en milieu humain.

<table><tbody><tr><td>Stérilisateur à billes Steri-350</td><td>Inotech</td><td>NC9449759</td><td></td></tr><tr><td>10 % formol</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro ; m Crépine à cellules</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td>Falcon, 352340</td></tr><tr><td>70 &micro ; m Filtre cellulaire</td><td>VWR</td><td>CA21008-952</td><td>Falcon, 352350</td></tr><tr><td>ACK Tampon de lyse</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte-W Aiguille de cathéter 24 G X 3/4"</td><td>CDMV Inc</td><td>108778</td><td></td></tr><tr><td>Bétadine (solution topique de povidone iodée à 10 %)</td><td>CDMV Inc</td><td>104826</td><td></td></tr><tr><td>Pince émoussée</td><td>Outils de haute science</td><td>FST 11000-12</td><td></td></tr><tr><td>BNP Pommade ophtalmique</td><td>CDMV Inc</td><td>17909</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Driver</td><td>Outils de sciences fines</td><td>FST 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR103</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 Aiguille conique</td><td>Medtronic Canada</td><td>GL-890</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Suture Polysorb - PC-13 Aiguille coupante</td><td>Medtronic Canada</td><td>SL-1659</td><td></td></tr><tr><td>Pince émoussée incurvée</td><td>Outils de sciences fines</td><td>FST 11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Dako Montage Moyen</td><td>Agilen</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, 100 %</td> <td>Millipore Sigma</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon 8-0 Suture Ethilon - BV-130-4 aiguille conique</td><td>Johnson & Johnson Inc.</td><td>2815G</td><td></td></tr><tr><td>Lampe à fibre optique</td><td>Nikon</td><td>2208502</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>FST 11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite&reg ; Microsphères de carboxylate YG 1,00 & micro ; m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15702</td><td></td></tr><tr><td>Unité de cauctérisation thermique Geiger</td><td>World Precision Instruments</td><td>501293</td><td>Modèle 150-ST</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur isofluorane</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-0951</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane USP, 250 mL</td><td>CDMV Inc</td><td>108737</td><td></td></tr><tr><td>Fixateur magnétique Système de rétraction</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>MX550D- Sonde 40 MHz</td><td>Fujifilm- Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 Tubing</td><td>Braintree Scienctific, Inc.</td><td>PE10 50 FT</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outils de sciences fines</td><td>FST 14184-09</td><td></td></tr><tr><td>SMZ-1B Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1-PS</td><td></td></tr><tr><td>VentElite Ventilateur pour petits animaux</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-7040</td><td></td></tr><tr><td>Vetergesic (10 mL, 0,3 mg/mL buprénorphine))</td><td>CDMV Inc</td><td>124918</td><td>médicament contrôlé</td></tr><tr><td>Vevo 2100 Logiciel</td><td>Fujifilm-Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle intact de rongeur ischémique péricardique

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

Ce protocole a montré que le péricarde et son contenu jouent un rôle anti-fibrotique essentiel dans le modèle de rongeur ischémique (ligature coronaire pour induire une lésion myocardique). La majorité des modèles précliniques d’infarctus du myocarde nécessitent la perturbation de l’intégrité péricardique avec perte du milieu cellulaire homéostatique. Cependant, récemment, une méthodologie a été développée par nous pour induire l’infarctus du myocarde, ce qui minimise les dommages péricardiques et conserve la population de cellules immunitaires résidentes du cœur. Une amélioration de la récupération fonctionnelle cardiaque chez les souris ayant un espace péricardique intact après une ligature coronarienne a été observée. Cette méthode permet d’étudier les réponses inflammatoires dans l’espace péricardique à la suite d’un infarctus du myocarde. Le développement ultérieur des techniques de marquage peut être combiné avec ce modèle pour comprendre le devenir et la fonction des cellules immunitaires péricardiques dans la régulation des mécanismes inflammatoires qui entraînent le remodelage dans le cœur, y compris la fibrose.

Ce modèle modifié de ligature coronaire a été optimisé pour atteindre la reproductibilité et la survie des animaux. Cependant, en raison de la blessure importante induite dans le cœur, une certaine mortalité peropératoire et postopératoire attendue est associée à la procédure. La mortalité standard est généralement plus élevée chez les hommes (~25-35%) que chez les femmes (~ 10-15%).
L’induction réussie d’un IM avec la ligature coronaire modifiée devrait être évidente par des changements dans ...

Ce protocole décrit les étapes pour induire un infarctus du myocarde chez la souris tout en préservant le péricarde et son contenu.

Un modèle intact de rongeur ischémique péricardique

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Cette méthode nous permettra d’évaluer le rôle de la cavité péricardique qui entoure le cœur et son contenu dans la réparation cardiaque à la suite d’un infarctus du myocarde. Par rapport aux méthodes conventionnelles de ligature coronaire pour la modélisation de l’infarctus du myocarde, notre méthode maintient une cavité péricardique intacte, permettant de déterminer le contenu et de suivre leurs rôles à la suite d’une lésion ischémique cardiaque. Comprendre la contribution de la cavité péricardique et la réponse aux blessures cardiaques fournira des informations importantes sur les stratégies thérapeutiques qui ciblent le péricarde pour améliorer la guérison cardiaque.Pour commencer par la post-anesthésie, retenez les pattes de la souris et positionnez-la sur la table chirurgicale. Après avoir préparé la souris pour la chirurgie comme décrit dans le manuscrit, ventiler la souris avec 2% d’isoflurane et 100% d’oxygène comme gaz porteur à l’aide d’un ventilateur commercial. Ensuite, définissez un taux de 110 respirations par minute, un volume courant de 250 microlitres et une pression expiratoire positive de quatre millimètres de mercure.Faites rouler la souris de 30% sur son côté droit pour positionner le côté gauche de la poitrine pour la chirurgie. Ensuite, faites une incision latérale de deux à trois centimètres dans la peau de la poitrine pour visualiser les muscles pectoraux du côté gauche. Faites une incision d’un centimètre de la ligne médiane vers l’extérieur pour couper le grand et le mineur pectoral.Évitez les saignements excessifs tout au long de la cautérisation des vaisseaux saignants. Visualisez les muscles intercostaux entre la troisième et la quatrième côte. Faites une incision de deux centimètres dans le muscle intercostal gauche pour introduire de l’air dans la cavité thoracique et permettre au cœur et aux poumons de tomber loin de l’incision.Pour inciser l’intercostal sans saignement, arrêtez temporairement le ventilateur et élargissez l’ouverture à l’aide d’un dispositif de cautérisation. À l’aide de rétracteurs, rétractez les côtes pour exposer le cœur. Ensuite, observez le péricarde et le cœur sous-jacent au microscope stéréoscopique.Placez doucement la pince sur la surface du péricarde pour réduire le péricarde et les mouvements cardiaques sous-jacents. Repère visuellement l’artère coronaire LAD en traçant son émergence sous l’appendice gauche. À l’aide du pilote de micro-aiguille, guider une suture appropriée à travers le péricarde sous le DAL.Observez la suture émergeant de l’autre côté du DAL et du péricarde. Représentant le modèle de ligature permanente, attachez la suture pour restreindre le flux sanguin dans l’artère coronaire, rendant visible le blanchiment de la partie antérieure du ventricule gauche. Ensuite, coupez l’excès de suture à l’aide de ciseaux.Fournir des injections d’entretien d’analgésique sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 72 heures après la chirurgie. Après avoir réduit l’isoflurane à 1%, éteignez l’isoflurane tout en maintenant la ventilation avec de l’oxygène. Une fois que l’animal montre des signes de respiration, retirez le tube trachéal de calibre 23 de la bouche et placez la souris dans une cage de récupération pour surveiller la reprise respiratoire.Laissez la souris récupérer dans la cage avec une partie de la cage placée sur un coussin chauffant pour fournir une source de chaleur externe. Surveillez quotidiennement l’état de santé de la souris pendant sept jours en évaluant les incisions et l’inconfort des animaux. Si nécessaire, administrer des antibiotiques pour une récupération réussie après la chirurgie invasive.Après avoir maintenu la souris sous anesthésie générale avec de l’oxygène, placez la souris en décubitus dorsal sur une plate-forme de scène chauffée et attachez les pattes aux fils ECG. Puis frotter la poitrine. Acquérir des images ECG à l’aide d’une sonde transductrice et d’un gel de contact et les analyser avec le logiciel approprié.Après une évaluation ECG non invasive, éteignez l’isoflurane et remettez la souris dans la cage. Fixez le cœur dans 10% de formol pendant au moins 24 heures. Coupez l’échantillon à l’aide d’une lame de rasoir droite à travers le ventricule droit, le septum interventriculaire et le ventricule gauche, en veillant à ce que l’incision passe par le centre de la zone de l’infarctus.Et puis la paraffine incorpore les échantillons de tissus. Les sections coupées sont ensuite placées dans une cassette de montage pour un enrobage ultérieur de la paraffine et une section ultérieure en sections de cinq micromètres d’épaisseur. Après la mise en place des sections de tissu sur les lames, déparaffiner à l’aide de toluène et de lavages à l’alcool gradués avec de l’eau désionisée.Puis réhydratez-vous. Ensuite, colorez la section avec 0,1% de rouge sirius dans de l’acide picrique pendant deux heures à température ambiante. Laver la section avec de l’acide acétique à 0,5 % pendant trois minutes, puis rincer avec de l’éthanol à 70 % pendant une minute.Déshydrater la section en utilisant l’ordre inverse des lavages avec des concentrations d’éthanol croissantes et graduées avant de monter pour une évaluation microscopique. L’induction réussie de l’infarctus du myocarde avec la ligature coronaire modifiée a été évaluée en examinant les paramètres fonctionnels et les caractéristiques structurelles du cœur. Pour la fonction, la diminution de la fraction d’éjection du ventricule gauche a été évaluée par échocardiographie dans les trois à quatre semaines suivant l’infarctus du myocarde.La coloration histologique a démontré que les changements fonctionnels s’accompagnaient d’une fibrose significative de la paroi du ventricule gauche, qui a été confirmée par la quantification de la fibrose colorée en rouge picrosirius dans les coupes transversales du cœur quatre semaines après l’infarctus avec les modèles de ligature coronaire péricardique perturbés ou intacts. La combinaison de la méthode de marquage des billes fluorescentes avec l’analyse par cytométrie en flux a fourni une approche pour suivre les macrophages péricardiques Gata6 positifs résidents. Fait important, peu ou pas d’étiquetage a été détecté dans le cœur ou le sang.Après un infarctus du myocarde, la relocalisation des cellules peut être suivie par cytométrie de flux et imagerie. La quantification des cellules myéloïdes péricardiques marquées par des billes fluorescentes avec ou sans infarctus du myocarde est présentée. Des précautions sont nécessaires pour éviter de perturber ou de déchirer par inadvertance le péricarde mince pendant la procédure.Cette méthode peut être combinée avec le traçage de la lignée cellulaire ou le blocage des effecteurs, ce qui permettra de suivre et de déterminer l’impact de la composante péricardique sur la réponse de guérison dans le cœur infarctus. Nous avons identifié que la cavité péricardique protège le cœur après une blessure, qui est en partie médiée par les macrophages péricardiques résidents. Cette approche ouvre un nouveau domaine de recherche pour les maladies cardiovasculaires.

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