Name: Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Apprenez une méthode efficace de production de vecteurs AAV à haut titre en utilisant des cellules HEK293 adhérentes. Cette technique optimise la thérapie génique pour les études précliniques sur grands modèles animaux.

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Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas et Jacob G. E. Yates ont reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario Veterinary College ainsi que des bourses d’études supérieures de l’Ontario. Amira D. Rghei a reçu une bourse d’études Mitacs Accelerate. Ces travaux ont été financés par la subvention de projet des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (no 66009) et une subvention de projets de recherche en santé concertée (partenariat avec le CRSNG) (no 433339) à SKW.

<ol><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+A+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020).</li>
<li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020).</li>
<li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020).</li>
<li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV+vector+toolkit%3A+poised+at+the+clinical+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li>
<li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus%3A+chemical+and+physical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li>
<li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li>
<li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy%3A+challenges+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li>
<li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li>
<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
<li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li>
<li>Liu, J., Moon, Y. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li>
<li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li>
<li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601(2019).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>dsDNA copy number calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html">http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html</a> (2021).</li>
<li>qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html">http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html</a> (2021).</li>
<li>Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li>
<li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+4+%28AAV4%29+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li>
<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

Sarah K. Wootton est l’inventrice d’un brevet américain US10806802B2 pour la capside AAV6.2FF.

La production de vecteurs AAV recombinants (rAAV) décrits dans cet article utilise des matériaux, des réactifs et de l’équipement courants trouvés dans la majorité des laboratoires et des installations de recherche en biologie moléculaire. Cet article permet au lecteur de produire des rAAV in vitro et in vivo de haute qualité. Surtout, ce protocole de production de rAAV, par rapport à des protocoles plus fastidieux impliquant la purification du chlorure de césium, est efficace et évite l’utilisation de ...

La thérapie génique utilisant des vecteurs de virus adéno-associés (AAV) a fait d’énormes progrès au cours des trois dernières décennies1,2. Les améliorations démontrées dans un large éventail de maladies génétiques, y compris la cécité congénitale, l’hémophilie et les maladies du système musculo-squelettique et du système nerveux central, ont amené la thérapie génique AAV à l’avant-garde de la recherche clinique3,4. En 2012, l’Agence européenne des médicaments (EMA) a approuvé Glybera, un vecteur AAV1 exprimant la lipoprotéine lipase (LPL) pour le traitement du déficit en LL, ce qui en fait la première autorisation de mise sur le marché pour un traitement de thérapie génique en Europe ou aux États-Unis5. Depuis lors, deux autres thérapies géniques AAV, Luxturna6 et Zolgensma7,ont reçu l’approbation de la FDA, et le marché devrait se développer rapidement au cours des 5 prochaines années avec jusqu’à 10-20 thérapies géniques attendues d’ici 20258. Les données cliniques disponibles indiquent que la thérapie génique AAV est une modalité sûre, bien tolérée et efficace, ce qui en fait l’un des vecteurs viraux les plus prometteurs, avec plus de 244 essais cliniques impliquant AAV enregistrés auprès de ClinicalTrials.gov. L’intérêt croissant pour les applications cliniques impliquant des vecteurs AAV nécessite des méthodes de production robustes et évolutives pour faciliter l’évaluation des thérapies AAV dans de grands modèles animaux, car il s’agit d’une étape critique dans le pipeline translationnel9.
Pour la production de vecteurs AAV, les deux principales exigences sont le génome AAV et la capside. Le génome de l’AAV de type sauvage (wt)-AAV est de l’ADN simple brin d’environ 4,7 kb de longueur10. Le génome wt-AAV comprend des répétitions terminales inversées (ITR) trouvées aux deux extrémités du génome, qui sont importantes pour l’emballage, et les gènes rep et cap 11. Les gènes rep et cap, nécessaires à la réplication du génome, à l’assemblage de la capside virale et à l’encapsulation du génome dans la capside virale, sont retirés du génome viral et fournis en trans pour la production de vecteurs AAV12. Le retrait de ces gènes du génome viral laisse place à des transgènes thérapeutiques et à tous les éléments régulateurs nécessaires, y compris le promoteur et le signal polyA. Les RTI restent dans le génome du vecteur pour assurer une réplication correcte du génome et une encapsulation virale13,14. Pour améliorer la cinétique de l’expression transgénique, les génomes des vecteurs AAV peuvent être conçus pour être auto-complémentaires, ce qui atténue le besoin de conversion de la conversion de l’ADN simple brin en double brin pendant la réplication du génome AAV, mais réduit la capacité de codage à ~ 2,4 kb15.
Au-delà de la conception du génome AAV, la sélection du sérotype de capside détermine le tropisme tissulaire et cellulaire du vecteur AAV in vivo2. En plus du tropisme tissulaire, il a été démontré que différents sérotypes AAV présentent une cinétique d’expression génique différente16. Par exemple, Zincarelli et coll.17 ont classé différents sérotypes AAV en sérotypes à faible expression (AAV2, 3, 4, 5), sérotypes à expression modérée (AAV1, 6, 8) et sérotypes à expression élevée (AAV7 et 9). Ils ont également classé les sérotypes AAV en expression lente (AAV2, 3, 4, 5) ou expression à apparition rapide (AAV1, 6, 7, 8 et 9). Ces tropismes divergents et la cinétique d’expression des gènes sont dus aux variations des acides aminés dans les protéines de la capside, aux formations de protéines de la capside et aux interactions avec les récepteurs/corécepteurs de la cellule hôte18. Certaines capsides AAV ont des caractéristiques bénéfiques supplémentaires telles que la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique après administration intravasculaire (AAV9) ou résident dans des cellules musculaires à longue durée de vie pour une expression transgénique durable (AAV6, 6.2FF, 8 et9) 19,20.
Cet article vise à détailler une méthode rentable pour produire des vecteurs AAV de haute pureté, à haut titre et de qualité recherche pour une utilisation dans des modèles précliniques de grands animaux. La production d’AAV à l’aide de ce protocole est réalisée par transfection à double plasmide dans des cellules adhérentes du rein embryonnaire humain (HEK)293 cultivées dans des piles cellulaires. En outre, l’étude décrit un protocole pour la purification par chromatographie d’affinité du sulfate d’héparine, qui peut être utilisé pour les sérotypes AAV qui contiennent des domaines de liaison à l’héparine, y compris AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 et DJ21,22.
Un certain nombre de systèmes d’emballage sont disponibles pour la production de vecteurs AAV. Parmi ceux-ci, l’utilisation d’un système de co-transfection à deux plasmides, dans lequel les gènes Rep et Cap et les gènes auxiliaires Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 et ARN VA) sont contenus dans un plasmide (pHelper), présente certains avantages pratiques par rapport à la méthode de transfection commune à trois plasmides (triple), y compris un coût réduit pour la production de plasmides23,24 . Le plasmide du génome AAV contenant la cassette d’expression du transgène (pTransgene) doit être flanqué de RTI et ne doit pas dépasser ~4,7 kb de longueur. Le titre et la pureté des vecteurs peuvent être affectés par le transgène en raison des effets cytotoxiques potentiels pendant la transfection. L’évaluation de la pureté du vecteur est décrite ici. Les vecteurs produits à l’aide de cette méthode, qui donnent un 1 x10 13 vg/mL pour chacun, ont été évalués chez des souris, des hamsters et des modèles animaux ovins.
Tableau 1 : Composition des solutions requises. Informations nécessaires, y compris les pourcentages et les volumes, des composants nécessaires pour diverses solutions tout au long du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu ; m filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td>ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter des gants</td></tr><tr><td>10 chambres pile de cellules</td><td>Corning</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille PETG 1L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à jupe 96 puits</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>Joints de plaque adhésive</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>MISE EN GARDE. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter des gants</td></tr><tr><td>Kit de nettoyage du sang et des tissus</td><td>Qiagen</td><td>69506</td> À <td>utiliser pour le nettoyage de l’ADN dans la section 4.6 du protocole</td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td>ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter des gants</td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>plaques de 15 cm</td></tr><tr><td>Culture Tube conique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>Tube conique de 15 mL</td></tr><tr><td>Culture Tube conique</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955240</td><td>Tube conique de 50 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec 1000 mg/L de D-glucose, L-glutamine</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blot Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Greenfield</td><td>P016EA95</td><td>Diluer l’alcool éthylique (95 % vol) à 20 % pour la section 3.7.4 et 70 % pour la section 6.1.1.1</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Fisher</td><td>Scientific A38-500</td><td>PRUDENCE. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter des gants</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS avec Mg2+ et Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sans Mg2+ et Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HEK293</td><td>American Tissue Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td>À la réception, décongeler les cellules et la culture comme décrit dans le fabricant' . Une fois que les cellules ont été peu circulées et qu’elles se développent bien, congelez une sous-fraction pour l’avenir dans des aliquotes et stockez-la dans de l’azote liquide. Utilisez toujours les cellules situées en dessous du numéro de passage 30. Une fois que les cellules cultivées ont été passées plus de 30 fois, il est recommandé de redémarrer une culture à partir des aliquotes stockées</td></tr> Kit <tr><td>ELISA de protéine de cellule hôte HEK293</td><td>Cygnus Technologies</td><td>F650S</td><td> Instructions pour la colonne de</td></tr><tr><td>sulfate d’héparine</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040703</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; L-glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>Coussin de support pour tube de centrifugeuse grand volume</td><td>Corning</td><td>CLS431124</td><td>Le coussin de support doit être utilisé avec des tubes de centrifugeuse de grand volume, sauf si le rotor de la centrifugeuse est équipé des coussins à fond en V appropriés</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger grand volume</td><td>Corning</td><td>CLS431123-6EA</td><td>Tubes à centrifuger de 500 mL</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp ; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Tube de microcentrifugation de 1,5 mL, stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>Eau de qualité moléculaire</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sel de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5125</td><td>ATTENTION. Porter</td></tr><tr><td>des gants NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP35810</td><td></td></tr><tr><td>Optimem, sérum réduit moyen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pippets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>Stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Diluer à 1x pour une utilisation sur cellules</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pHelper</td><td>Conception de novo ou obtenu à partir d’un dépôt de plasmides</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bassin de pipettes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>Achat de bassins de pipettes stériles</td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol tert-octylphényléther (Triton X-100)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>MISE EN GARDE. Porter des gants</td></tr><tr><td>Polyéthylénimine (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>Suivre le fabricant' pour produire une solution de 1 L. 0,22&mu ; m filtrer et stocker à 4&deg ; C</td></tr><tr><td>Plaque PCR semi-jupe en polypropylène</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>MISE EN GARDE. Portez des gants</td></tr> membrane <tr>en<td>difluorure de polyvinylidène (PVDF)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>10600023</td><td>Utilisez des pinces pour manipuler. Portez des gants.</td></tr><tr><td>Anticorps primaire</td><td>Progen</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>Protein Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pTrangene</td><td>Conception de novo ou obtenu à partir d’un dépôt de plasmides</td><td>NA</td><td>Doit contenir SV40 polyA dans le génome pour être compatible avec le titrage AAV de la section 5.0</td></tr><tr><td>Tubulure de pompe</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96440-14</td><td>Optimisation de la longueur de la tubulure et confinement du virus dans les fractions E1-E5</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase 10 Tampon de réaction</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Utilisation à une concentration de 10x dans le protocole de la section 4.0</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase sans Rnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Diluant d’échantillon</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td><td>Doit être acheté séparément pour être utilisé avec le kit</td></tr> <tr><td>ELISA de protéine de cellule hôte HEK293Anticorps secondaire, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Oxoid</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28312</td><td>ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter</td></tr><tr><td>des gants Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 polyA sonde d’amorce</td><td>IDT</td><td></td><td>Utiliser la séquence du tableau X pour la citation de l’IDT pour la synthèse</td></tr><tr><td>Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15524010</td><td>ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter</td></tr><tr><td>des gants Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810024</td><td>Ultra-4 Centrifuge 10K device doit être utilisé, car il a une coupure de 10000 poids moléculaire</td></tr><tr><td>Nucléase universelle pour la lyse cellulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>Universal qPCR master mix</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Portez des gants</td></tr><tr><td>ATTENTION :&nbsp ; Reportez-vous au tableau des matériaux pour les directives sur l’utilisation des produits chimiques dangereux.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Les vecteurs du virus adéno-associé (AAV) sont parmi les vecteurs de thérapie génique les plus avancés sur le plan clinique, avec trois thérapies géniques AAV approuvées pour les humains. L’avancement clinique de nouvelles applications pour l’AAV implique la transition de modèles de petits animaux, tels que des souris, à des modèles animaux plus grands, y compris des chiens, des moutons et des primates non humains. L’une des limites de l’administration d’AAV à des animaux plus gros est la nécessité de grandes quantités de virus à titre élevé. Bien que la culture cellulaire en suspension soit une méthode évolutive pour la production de vecteurs AAV, peu de laboratoires de recherche ont l’équipement (par exemple, les bioréacteurs) ou savent comment produire de l’AAV de cette manière. De plus, les titres AAV sont souvent significativement plus faibles lorsqu’ils sont produits dans des cellules HEK 293 en suspension par rapport aux cellules HEK293 adhérentes. Décrit ici est une méthode pour produire de grandes quantités d’AAV à titre élevé à l’aide de piles de cellules. Un protocole détaillé pour le titrage de l’AAV ainsi que des méthodes de validation de la pureté des vecteurs sont également décrits. Enfin, les résultats représentatifs de l’expression du transgène médiée par l’AAV dans un modèle ovin sont présentés. Ce protocole optimisé pour la production à grande échelle de vecteurs AAV dans les cellules adhérentes permettra aux laboratoires de biologie moléculaire de faire progresser les tests de leurs nouvelles thérapies AAV dans des modèles animaux plus grands.

La traduction de modèles de petits rongeurs en modèles animaux plus grands et l’application clinique éventuelle présentent un défi important en raison de la grande quantité d’AAV nécessaire pour transduire de plus gros animaux et obtenir des effets thérapeutiques. Pour comparer l’efficacité de transduction de la capside AAV6.2FF rationnellement conçue, précédemment démontrée une augmentation de 101 fois de l’efficacité de transduction dans les cellules musculaires murines par rapport à AAV63,des s...

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement >1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

Ce protocole pour la production de vecteurs viraux AAV est rentable et donne une AAV de haute pureté, à titre élevé et de qualité recherche pour une utilisation dans des modèles précliniques de grands animaux. Cette technique utilise des cellules HEK293 adhérentes dans des chambres de culture cellulaire, ce qui est efficace en termes de temps et moins pratique, ce qui permet moins de perturbations des cellules. Ce protocole peut grandement aider à la production de vecteurs viraux pour le domaine de la thérapie génique, et peut également être utilisé pour la production d’autres sérotypes AAV qui se lient également au sulfate d’héparane.Pour commencer, collectez les cellules HEK293 de la culture lorsqu’elle atteint 80% de confluence. Aspirer le milieu avant de laver doucement la plaque de culture cellulaire avec trois millilitres de PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez trois millilitres de trypsine.Incuber les plaques pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, neutraliser la trypsine, en ajoutant sept millilitres de DMEM complet à la plaque, et recueillir le surnageant dans des tubes coniques de 50 millilitres. Inversez doucement les tubes pour vous assurer que les cellules sont homogènes.Pour déterminer la densité cellulaire, mélanger 10 microlitres d’échantillons cellulaires avec 10 microlitres de bleu de trypan. Et ajoutez le mélange à une lame de comptage de cellules à analyser dans le compteur de cellules. Mélangez la suspension cellulaire avec un litre de DMEM complet préchauffé pour voir la chambre de culture.Faites pivoter doucement la chambre pour répartir les cellules uniformément. Incuber la chambre à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. En plus de la chambre de culture cellulaire, les cellules de culture à 10 à la quatrième cellule par centimètre carré dans une plaque de 15 centimètres comme référence pour la confluence.Après 65 heures d’incubation, lorsque les cellules sont confluentes à 80 à 90%, ajoutez lentement le mélange polyéthylèneimine-ADN et DMEM dans le port de la chambre de culture cellulaire. Répartissez le liquide uniformément sur toutes les rangées avant d’incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’incubation, secouez vigoureusement la chambre de culture cellulaire pour déloger les cellules jusqu’à ce que le milieu semble trouble et versez-la dans des tubes centrifuges de quatre ou 500 millilitres.Abattez les cellules par centrifugation à 18 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Versez le surnageant clarifié dans une bouteille petG d’un litre et remettez en suspension les pastilles de cellule dans 50 millilitres de tampon autorisé dans des tubes de centrifugeuse de 500 millilitres. Incuber les tubes pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.Après incubation, centrifugez les tubes à 18 000 fois G pendant 30 minutes et transférez le surnageant dans la même bouteille petG d’un litre. Conserver à moins 80 degrés Celsius. Décongeler le lysat brut à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Une fois décongelé, filtrez-le à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Immédiatement avant les étapes de purification, passivatez le concentrateur centrifuge en ajoutant quatre millilitres de tampon de prétraitement du filtre pour chaque colonne d’héparine-sépharose utilisée. Placez le tube dans une pompe péristaltique.Exécutez séquentiellement les solutions et les médias. Préparez-vous à la chromatographie en attachant une colonne d’héparine-sépharose de cinq millilitres au tube et en faisant passer 25 millilitres de DMEM Bazell à travers la colonne. Ensuite, chargez 0,2 micromolaire du lysat brut filtré sur la colonne à un débit d’une à deux gouttes par seconde.Lavez la colonne séquentiellement pour éluer cinq millilitres cinq fois avec 300 millimolaires de chlorure de sodium HBSS, avec du magnésium et du calcium, et étiquetez les cinq élutions comme E1 à E5. Lorsque vous êtes prêt, faites tourner le concentrateur centrifuge contenant le tampon de prétraitement à 900 fois G pendant deux minutes. Jetez le flux. Lavez le filtre du concentrateur centrifuge avec quatre millilitres de HBSS avec du magnésium et du calcium en tournant à 1000 fois G pendant deux minutes.Ajoutez ensuite l’élution E2 au concentrateur centrifuge et faites tourner à 1000 fois G pendant cinq minutes. Jetez le flux. De même, faites tourner l’élution E3 dans le concentrateur centrifuge jusqu’à ce que le virus concentré soit d’environ un millilitre.Retirez le virus concentré du concentrateur centrifuge à l’aide d’une pointe filtrée P200 et collectez-le dans un tube centrifuge stérile de 1,5 millilitre. Après la collecte du virus, rincer le concentrateur centrifuge avec 200 microlitres de HBSS avec du magnésium et du calcium. Pipettez vigoureusement de haut en bas pendant 30 secondes pour déloger tout virus adhéré à la membrane et recueillir le virus concentré dans le même tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.Mélangez bien le tube. Lavez la colonne et saturez avec de l’éthanol à 20% avant de la conserver à quatre degrés Celsius. Conservez le tube de la pompe dans un hydroxyde de sodium molaire.L’efficacité de transduction de la capside AAV6.2FF a été comparée chez des souris, des hamsters et des agneaux pendant 28 jours après administration intramusculaire. Des souris ont administré cinq fois 10 au 12e génome vecteur par kilogramme d’IgG humaine AAV6.2FF, exprimées entre 171 et 237 microgrammes par millilitre d’IgG humaine dans le sérum. Le hamster est administré à deux fois 10 à 13e génomes vectoriels par kilogramme d’IgG humaine AAV6.2FF, exprimées à des niveaux beaucoup plus élevés d’IgG humaine que les souris.Alors que le grand modèle animal a été capable d’exprimer en moyenne 35 microgrammes par millilitre des niveaux d’IgG humaine dans le plasma. Les grands modèles animaux peuvent déterminer l’expression du transgène AAV in vivo et déterminer si les transgènes ont un effet thérapeutique contre le trouble ou la maladie d’intérêt. L’étude a mis en évidence la grande capacité de transduction de l’AAV6.2FF, un nouveau vecteur de sérotype AAV 6 dans le muscle squelettique, ainsi que la faible immunogénicité des vecteurs viraux AAV in vivo.

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Recombinant virus adéno-associés (rAAVs) vecteurs sont de plus en plus précieux...

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

Nous démontrons la technique de base pour concevoir et faire évoluer moléculaire synthétiques viral adéno-associé (AAV) vecteurs de thérapie génique par l'intermédiaire de la famille réarrangement d'ADN. En outre, nous fournir des directives générales et des exemples représentatifs de sélection et d'analyse des différents capsides chimériques avec des propriétés améliorées sur les cellules cibles en culture ou chez la souris.

Vecteurs d&#39;ingénierie et de l&#39;évolution de la synthèse Adeno-Associated Virus (AAV) thérapie génique par la famille de réarrangement d&#39;ADN

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.

Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte

Dans ce manuscrit, l’injection sous-conjonctivale est démontrée comme une méthode d’administration vectorielle valide pour les tissus oculaires chez la souris utilisant un système d’injection composé d’une pompe à seringue de perfusion / retrait et d’une seringue amovible étanche couplée à des aiguilles de micro-injection. Ce système d’injection est également adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires.

Administration sous-conjonctivale de vecteurs de virus adéno-associés dans des modèles de petits animaux

Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.

Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293

Alors que le domaine de la thérapie génique continue d’évoluer, il existe un besoin croissant de méthodes innovantes capables de relever ces défis. Ici, une méthode unique est présentée, qui rationalise le processus de génération de vecteurs AAV à haut rendement et de haute pureté à l’aide d’une plate-forme d’usine de cellules, répondant aux normes de qualité des études in vivo .

Une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire

Le taux de rotation du virus dans les systèmes marins et d'eau douce peut être estimée par une réduction et la technique ne se reproduise. Les données permettent aux chercheurs de déduire les taux de mortalité microbienne virus de médiation dans les systèmes aquatiques.

Estimation des taux de production de virus dans les systèmes aquatiques

Cet article décrit les diverses procédures de dépistage pour les rats et les souris pour détecter l'endo-ou ectoparasites. Plusieurs tests diagnostiques seront démontrés, tant celles qui conviennent pour une utilisation sur les animaux vivants et ceux qui sont utilisés après l'euthanasie de l'animal. Photographies d'aide à l'identification des parasites chez le rat et la souris seront inclus.

Diagnostic de l&#39;ecto-et endoparasites chez les rats et les souris de laboratoire

Apprenez une méthode efficace de production de vecteurs AAV à haut titre en utilisant des cellules HEK293 adhérentes. Cette technique optimise la thérapie génique pour les études précliniques sur grands modèles animaux.

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux (Vidéo) | JoVE Journal

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

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