Étude du développement de cellules dendritiques par knockdown de gènes médiés par l’ARN en épingle à cheveux court dans une lignée cellulaire hématopoïétique et progénitrice in vitro
7 mars 2022
Nous fournissons ici un protocole pour le dépistage des facteurs de transcription potentiels impliqués dans le développement de cellules dendritiques (DC) en utilisant la transduction lentivirale de l’ARNh pour obtenir des lignées cellulaires knockdown stables pour la différenciation DC in vitro .
Les cellules dendritiques, ou DC, sont des cellules immunitaires clés reliant le système immunitaire inné et adaptatif. Bien que les DC soient hétérogènes, cette méthode nous aide à comprendre quels gènes, y compris les facteurs de transcription, peuvent réguler le développement des DC. Cette technique fournit un moyen simple et rapide d’identifier un gène qui contrôle le développement dc à partir de leur progéniteur in vitro.
Pour commencer, maintenez les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées ou iHSPC dans un milieu RPMI 1640 complet, complété par 100 nanogrammes par millilitre du ligand FLT3 et un bêta-estradiol micromolaire. Pour la transduction lentivirale, plaquer les iHSPC dans 12 plaques de puits à une densité d’une fois 10 à la cinquième cellule par puits et un millilitre de milieu complet contenant le ligand FLT3, le bêta-estradiol et le polybrene. Ensuite, ajoutez le lentivirus portant l’ARN court en épingle à cheveux dans chaque puits à une multiplicité d’infection de 100.
Ensuite, faites tourner la plaque à 1100 fois g et 37 degrés Celsius pendant 90 minutes, puis incubez les cellules infectées pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, prélever le polybrene en recueillant les cellules dans des tubes de 15 millilitres en centrifugation, après avoir remplacé le milieu par un milieu frais complet contenant le ligand FLT3 et le bêta-estradiol. Après 24 heures supplémentaires, ajoutez six microgrammes par millilitre de puromycine au milieu pour sélectionner les cellules infectées.
Remplacez le milieu de sélection tous les trois jours et maintenez les cellules pendant au moins une semaine pour étendre les iHSPC transductés de manière stable. Générez et maintenez des iHSPC stables pour LacZ, Tcf4 et Id2 dans un milieu complet complété par le ligand FLT3 et le bêta-estradiol. Pour initier la différenciation in vitro, collectez les iHSPC indifférenciés dans des tubes de 15 millilitres et abattez les cellules par centrifugation.
Après centrifugation, jeter le surnageant et laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS. Après le deuxième lavage, remettez en suspension les cellules dans un milieu complet contenant uniquement le ligand FLT3, puis ensemencez-les à une densité de deux fois 10 à la cinquième vente par millilitre dans une plaque de 12 puits. Après trois jours, ajouter un millilitre de milieu frais complet contenant le ligand FLT3.
Après deux jours supplémentaires, procédez à l’analyse des cellules différenciées par cytométrie en flux. Pour l’analyse cytométrique en flux, pipettez les cellules de haut en bas deux à trois fois dans la plaque, puis collectez les cellules dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes et jetez le surnageant avant de réutiliser les cellules dans 50 microlitres de tampon de fax.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’anti-CD16 par 32 surnageants d’hybridome et incubez pendant cinq à 10 minutes sur de la glace. Ensuite, ajoutez des anticorps conjugués à des colorants fluorescents directement dans les cellules et incubez pendant 15 minutes sur de la glace dans l’obscurité. Après l’incubation, lavez les cellules avec un millilitre de tampon de télécopie et centrifugez l’échantillon.
Après centrifugation, remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon fax et analyser les échantillons par cytométrie en flux. Après une courte chute de LacZ, Tcf4 et Id2 par l’ARN en épingle à cheveux dans iHSPCS, la confirmation de l’efficacité de l’élimination par RTQ-PCR a montré que l’expression des iHSPC knockdown Tcf4 et Tcf4 était réduite par rapport à celle des iHSPC knockdown LacZ. Des résultats similaires ont été observés pour l’expression d’Id2 dans les iHSPC Knockdown Id2.
Après avoir cultivé lacZ knockdown iHSPC pendant cinq jours, la fréquence des cellules CD11c positives, qui représentent la population de cellules dendritiques, était d’environ 95%Cependant, l’élimination de Tcf4 ou Id2 a légèrement diminué la génération de cellules dendritiques CD11c positives. Une analyse plus approfondie des cellules dendritiques CD11c positives dérivées des iHSPC Knockdown lacZ a révélé que 70% étaient des cellules dendritiques conventionnelles tandis que 22% étaient des cellules dendritiques plasmacytoïdes. Les iHSPC knockdown Tcf4 ont généré un pourcentage significativement plus faible de cellules dendritiques plasmocytoïdes contrôlées par le Knockdown LacZ.
En revanche, les iHSPC Knockdown Id2 ont généré un pourcentage significativement plus faible de cellules dendritiques conventionnelles que les témoins LacZ knockdown, mais un pourcentage plus élevé de cellules dendritiques plasmacytoïdes. Les infections par spin augmentent l’efficacité de transduction de l’ARNh porteur de lentivirus dans les iHSPC. Cette technique aborde le rôle des facteurs de transcription et facilite l’étude d’autres gènes dans la transduction ou le métabolisme de la signalisation des cytokines, qui sont susceptibles d’être impliqués dans le développement des DC.
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Aperçu
Cet article présente un protocole de criblage de facteurs de transcription influençant le développement des cellules dendritiques (DC) par transduction lentivirale d'ARNi. La méthode permet la création de lignées cellulaires stables avec inhibition stable de l'expression génique pour la différenciation in vitro des DC.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Régulation transcriptionnelle
Contexte
- Les cellules dendritiques jouent un rôle essentiel dans la connexion entre l'immunité innée et l'immunité adaptative.
- La compréhension du développement des cellules dendritiques peut fournir des informations sur les réponses immunitaires.
- Cette étude se concentre sur l'identification des gènes régulant la différenciation des cellules dendritiques.
- La méthode utilise des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole de criblage des facteurs de transcription impliqués dans le développement des cellules dendritiques.
- Créer des lignées cellulaires stables avec inhibition stable de l'expression génique pour des études fonctionnelles.
- Faciliter la différenciation in vitro de cellules dendritiques à partir de cellules progénitrices.
Méthodes utilisées
- Entretien des iHSPC dans un milieu RPMI 1640 complet.
- Supplémentation avec le ligand FLT3 et l'estradiol bêta.
- Transduction lentivirale des iHSPC avec un ARNsh.
- Utilisation de la polybrene pour améliorer l'efficacité de la transduction.
Résultats principaux
- Génération réussie de lignées cellulaires stables avec inhibition stable de l'expression génique.
- Identification des facteurs de transcription impliqués dans le développement des cellules dendritiques.
- Démonstration des capacités de différenciation in vitro.
- Apercus sur la régulation génique du développement des cellules immunitaires.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour étudier le développement des cellules dendritiques.
- Il peut être utilisé pour identifier les gènes régulateurs clés en immunologie.
- Cette approche pourrait améliorer la compréhension des réponses immunitaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une interrogation systématique de la fonction des facteurs de transcription dans l'engagement de la lignée des cellules dendritiques, soutenant la validation de cibles dans les programmes de découverte axés sur l'immunologie. En reliant la perturbation génétique à la réponse phénotypique dans un système in vitro reproductible, elle offre une dé-risquisation mécanistique pour les hypothèses sur les cibles en phase précoce. L'approche renforce la confiance prédictive dans le classement par ordre de priorité des cibles immunomodulatrices avant les efforts coûteux d'identification de candidats.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation fonctionnelle des facteurs de transcription comme cibles thérapeutiques potentielles dans le développement des cellules dendritiques.
- Valeur opérationnelle : Fournit une plateforme évolutible pour le criblage d'inhibition par ARNsh délivrés par lentivirus dans des progéniteurs hématopoïétiques immortalisés.
- Valeur prédictive : Établit un lien entre la modulation de la cible et la production de sous-populations de cellules dendritiques, soutenant les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin basées sur des données de polarisation lignagère.
Élaboration de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives par cytométrie en flux concernant les cellules positives pour CD11c et la répartition des sous-populations (cDC contre pDC) après l'invalidation d'un facteur de transcription.
- Valeur opérationnelle : Met en place un test de différenciation standardisé avec des conditions cytoquines définies (ligand FLT3, béta-estradiol) et une sélection par la puromycine.
- Préparation du test : Produit des lignées cellulaires avec invalidation stable, utilisables de façon répétée dans des études de criblage de composés ou de modulation de voies biologiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Modélise la spécification précoce des cellules dendritiques à partir de progéniteurs, orientant les stratégies de biomarqueurs liées aux réseaux de facteurs de transcription.
- Réduction des risques mécanistiques : Précise le rôle d'Id2 dans la promotion du destin des cellules dendritiques conventionnelles et de Tcf4 dans le développement des cellules dendritiques plasmacytoïdes.
- Alignement préclinique : Permet l'évaluation de cibles influençant la différenciation des cellules immunitaires, pertinentes pour les programmes d'adjuvants vaccinaux ou d'auto-immunité.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase de biologie de la découverte, permettant de tester des hypothèses sur des cibles avant le développement de tests pour l'identification de composés d'intérêt, les données orientant le choix de candidats précliniques en immunomodulation.
- Biologie de la découverte : Permet l'analyse mécanistique des régulateurs transcriptionnels qui contrôlent l'engagement de la lignée des cellules dendritiques à partir des progéniteurs hématopoïétiques.
- Développement de tests : Génère des paramètres reproductibles et quantitatifs en immunofluorescence et en cytométrie en flux pour surveiller l'efficacité de la différenciation et la répartition des sous-populations.
- Analytique : Fournit des résultats quantifiables (pourcentage de CD11c+, cDC, pDC) permettant des comparaisons entre différentes conditions d'extinction génique et soutenant l'évaluation statistique de l'impact des cibles.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la différenciation des progéniteurs précoces et la fonction immunitaire ultérieure, ce qui est pertinent pour modéliser les réponses dans des contextes d'infection ou de tolérance.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'analyse de gènes supplémentaires impliqués dans la signalisation par cytokines, le métabolisme ou les réseaux transcriptionnels affectant le développement des cellules dendritiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en établissant un lien entre l'extinction d'un facteur de transcription et des modifications mesurables dans la génération de sous-populations de cellules dendritiques.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation des protocoles de différenciation et de lecture entre laboratoires grâce à des conditions de milieu définies et à des marqueurs de sélection.
- Valeur stratégique : Réduit le risque biologique dans le choix des cibles immunomodulatrices en fournissant dès les premières étapes des preuves fonctionnelles d'effets spécifiques à une lignée.
- Impact sur le portefeuille : Guide la priorisation ajustée au risque des cibles en fonction de leur influence sur les décisions de destin cellulaire des cellules dendritiques, favorisant une allocation efficace des ressources.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en transduction lentivirale, en culture de cellules hématopoïétiques et en cytométrie en flux.
- Dépend de l'accès à des bibliothèques lentivirales d'ARNi sous forme de shRNA, à la sélection par la puromycine et à des milieux enrichis en cytokines (ligand FLT3, béta-estradiol).
- Implique une standardisation de l'efficacité de transduction (par exemple, par infection centrifuge) et de la durée de sélection pour obtenir un abaissement stable de l'expression.
- Implique l'optimisation du moment de la différenciation et des panels d'anticorps pour une identification précise des sous-populations de cellules dendritiques par cytométrie en flux.
- Limité à la modélisation in vitro ; les résultats nécessitent une validation dans des systèmes primaires humains ou murins pour une pertinence translationnelle.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
