Études des interactions chaperonne-cochapéroé à l’aide d’un essai homogène à base de billes

Nous avons construit un test homogène à base de perles pour étudier les interactions chaperon-cochaperone. En utilisant cette technique, nous criblons de petites molécules inhibant les interactions entre Hsp90 et FKDP51 ou FKBP52 et identifions des inhibiteurs puissants et sélectifs. Cette technique de criblage à haut débit est robuste et fiable.

Les résultats peuvent être obtenus en une heure, et il ne nécessite que de petites quantités de protéines et de composés de perles. L’interaction de Hsp90 avec ces cochaperones a été impliquée dans des troubles humains, tels que la maladie d’Alzheimer, le cancer, la maladie auto-immune. Cette technique offre la possibilité de dépister les inhibiteurs chaperon-cochaperone de haute importance médicale.

Voici le principe de base de ce test. Lorsque l’interaction entre le peptide Hsp90C-Terminal et le domaine TPR des cochaperones rapproche les perles donneuses et acceptatrices, un signal hautement amplifié est généré. Lorsque les inhibiteurs d’interaction sont ajoutés, les billes donneuses et acceptrices ne peuvent pas atteindre la proximité et aucun signal détectable n’est produit.

Commencez par diluer le peptide Hsp90 dans le PBS à une concentration d’un milligramme par millilitre. Diluer les billes d’accepteur non conjuguées dans du PBS et transférer les billes dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez les billes diluées pour le lavage, puis retirez soigneusement le surnageant.

Pour la conjugaison, placez les billes acceptatrices dans les peptides à un rapport de 10 à 1. Aux billes de paletide au peptide dilué PBS, Tween 20 et solution d’hydrogénure de sodium, et incuber avec agitation bout à bout sur un agitateur rotatif. Pour bloquer les sites qui n’ont pas réagi, ajoutez 20 microlitres d’une solution molaire de chlorhydrate de Tris de pH 8,0 aux billes et éteignez la réaction en incubant pendant une heure à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, laver les billes par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille de perle dans un millilitre de solution de chlorhydrate de Tris. Répétez le lavage deux fois de plus. Après le dernier lavage, re-suspendre les billes à une concentration d’un milligramme par millilitre dans un tampon de stockage et stocker la solution de billes accepteurs conjugués à 4 degrés Celsius à l’abri de la lumière.

Ajouter des billes de donneur de glutathion à une concentration de 10 microgrammes par millilitre dans le PBS. Ajouter GSTFKBP51 à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et incuber la réaction pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius dans l’obscurité. Effectuer des dilutions en série du composé d’essai dans le DMSO.

Ajouter 0,25 microlitre de dilutions de composés d’essai et tripler dans le coin de chaque puits d’une plaque de 384 puits. Pour le contrôle négatif, ajoutez 0,25 microlitre de DMSO et pour le contrôle positif, ajoutez 0,25 microlitre de peptide Hsp90 C-Terminal dans les puits. Ajouter 22,5 microlitres de la solution contenant des perles de donneurs de glutathion avec des protéines marquées GST à chaque puits.

Secouez soigneusement l’assiette avec les mains et incubez dans l’obscurité à 25 degrés Celsius pendant 15 minutes. Diluer les billes accepteurs avec le peptide Hsp90C-Terminal attaché à 100 microgrammes par millilitre de concentration dans 0,5 fois PBS. Ajouter 2,25 microlitres de perles d’accepteur diluées à chaque puits.

Agiter et incuber la plaque dans l’obscurité pendant 15 minutes comme démontré. Allumez l’instrument de lecture de plaque, mesurez le signal de la plaque et analysez les données comme décrit dans le manuscrit textuel. Créez une table de données X-Y dans la boîte de dialogue de bienvenue, sélectionnez X nombres, Y et entrez trois valeurs de réplication dans des colonnes côte à côte.

Importez les valeurs de concentration dans la colonne X et les valeurs de signal dans la colonne Y. Cliquez sur Analyser, sélectionnez Transformer la concentration X, puis sélectionnez Transformer en logarithmes. Cliquez sur Analyser et choisissez Régression non linéaire sous Analyse X-Y.

Ouvrez l’option d’inhibition dose-réponse et choisissez l’équation de pente variable log versus réponse. Cliquez sur OK pour afficher les résultats contenant la valeur IC50 et les graphiques. Ce test a été utilisé pour le criblage de petites molécules, inhibant les interactions entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52.

Le score Z de plus de 0,8 et le rapport signal/arrière-plan de 13,35 démontrent la robustesse et la fiabilité du criblage à haut débit. L’effet du composé d’essai de poids moléculaire D10 sur l’inhibition des interactions chaperon-cochépéro a été évalué et les valeurs de la CI50 ont été calculées, où D10 a montré une inhibition dose-dépendante. La valeur IC50 pour les interactions Hsp90 GSTFKBP51 était de 65 nanomolaires.

Alors que pour Hsp90, les interactions GSTFKBP52, l’inhibition complète n’a pas été obtenue avec la concentration de composé la plus élevée indique que l’inhibition sélective de l’interaction protéine-protéine avec de petites molécules peut être réalisée. L’étape critique est l’ordre d’addition. Nous formons d’abord un complexe entre une petite molécule et sa cible TPR.

Sinon, une incubation plus longue et des concentrations de composés plus élevées sont nécessaires. Nous pouvons utiliser cette technique pour dépister de petites molécules perturbant l’interaction entre Hsp90 et FKB51 ou Hsp90 et FKB52. Il peut également être étendu à toute interaction entre Hsp90, Hsp70 et un motif de TPR contenant des inhibiteurs sélectifs de dépistage de la cochapérone.