Techniques de préparation tissulaire pour l’imagerie par micro-tomodensitométrie améliorée par contraste de modèles cardiaques de grands mammifères atteints de maladies chroniques

Ce protocole fournit un aperçu micro structurel des maladies pathologiques structurelles à l’échelle de l’ensemble de l’organe à l’aide de la tomographie par micro-ordinateur. Dans ce protocole, une méthode spécialisée de préparation des tissus est mise en œuvre pour optimiser l’imagerie à haute résolution d’échantillons de cœur entier à partir de modèles translationnels de grands mammifères chez l’homme avec une amélioration sélective du contraste des maladies structurelles. La microstructure cardiaque telle que la distribution de la fibrose et l’organisation du myocarde excitable sous-tend un large spectre de maladies cardiaques et prépare le terrain pour l’arythmie potentiellement mortelle.

Nestor Pallares-Lupon, post-doctorant et titulaire d’un doctorat pour mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez une solution cardioplégique contenant de l’héparine de sodium et conservez la solution à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez le PBS / EDTA en ajoutant d’abord de l’EDTA à un litre d’eau distillée pour une concentration finale de 10 millimolaires.

Ensuite, augmentez et maintenez le pH de la solution à 12 en utilisant de l’hydroxyde de sodium pour dissoudre l’EDTA. Une fois l’EDTA complètement dissous, abaissez le pH à 7,4 en utilisant de l’acide chlorhydrique. Ajoutez ensuite une pochette en aluminium de PBS pour obtenir une solution molaire de 0,01 avec un pH de 7,4.

Conservez la solution préparée à température ambiante. Enfin, préparez une solution d’agent de contraste PMA à 1% d’éthanol en ajoutant 10 grammes de PMA à un litre d’éthanol absolu. Conservez la solution préparée à température ambiante.

Préparez un réservoir d’un litre supporté à 80 centimètres au-dessus d’une boîte de dissection et couplez un tube thermoplastique à un orifice de vidange du réservoir. Fixez un robinet à trois voies au tuyau de drainage et couplez d’autres tubes thermoplastiques à chaque port libre du robinet à trois voies. Fixez des robinets bidirectionnels aux extrémités libres du tube.

Ensuite, remplissez le réservoir avec la solution cardioplégique complétée par de l’héparine. Ouvrez les robinets pour permettre à la solution cardioplégique de s’écouler en éliminant toutes les bulles d’air. Fermez ensuite les robinets bidirectionnels.

Après avoir extrait le cœur d’un animal euthanasié, placez-le dans une solution cardioplégique froide stockée sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la dissection. Ensuite, préparez la canule pour l’ostéo coronaire gauche et droit en coupant cinq centimètres de tube en PTFE et en chauffant une extrémité en plaçant la pointe à côté d’une flamme nue. Une fois qu’un millimètre de la pointe commence à fondre et devient translucide, appuyez sur la pointe contre une surface dure résistante à la chaleur pour former une crête à l’extrémité de la canule afin d’empêcher la canule de glisser hors des vaisseaux, puis insérez un centimètre de l’extrémité non chauffée de chaque canule dans les deux extrémités du tuyau de drainage du réservoir de drainage.

Ensuite, retirez la canule aortique et localisez l’ostéo gauche et droit des artères coronaires sous la solution cardioplégique froide. À l’aide de ciseaux pointus, séparez soigneusement la racine aortique du tissu environnant au-dessus et au-dessous de l’ostéo coronaire pour permettre le filetage d’une suture de soie de calibre zéro sous le vaisseau coronaire. Ouvrez ensuite les robinets bidirectionnels et insérez les pointes de la canule dans l’ostéo coronaire.

Avec les extrémités de la canule s’étendant d’un à deux centimètres dans l’ostéo et au-delà de la suture, attachez la canule. Ensuite, rincez le cœur tout en massant doucement les ventricules pendant 15 minutes jusqu’à ce que le cœur soit débarrassé du sang. Après le rinçage, fermez les robinets bidirectionnels, déconnectez-les du robinet à trois voies et transférez le cœur dans un récipient d’un litre résistant aux produits chimiques en plastique contenant 500 millilitres de solution PBS / EDTA.

Recirculez la solution PBS/EDTA dans le tube thermoplastique sous une hotte à l’aide d’une pompe péristaltique à deux canaux. Amorcer le tuyau de la pompe jusqu’à ce que le tube soit dépourvu de bulles d’air. Ensuite, parcourez chaque canule de l’artère coronaire par recirculation à température ambiante pendant deux heures à 80 millilitres par minute.

Après vous être assuré que la hotte est opérationnelle, arrêtez la pompe, vidangez la solution du récipient et remplacez-la par du formol à 10% pour une fixation d’une heure à 80 millilitres par minute. Parcourez le cœur en utilisant une série de concentrations d’éthanol incrémentielles, en commençant par 20% d’éthanol pendant au moins trois heures. Ensuite, remplacez l’éthanol à 20% par de l’éthanol à 30% et perfuser pendant deux heures.

Poursuivre la perfusion en incrémentant la concentration d’éthanol à chaque itération avec une perfusion minimale d’une heure à chaque concentration. Pour renforcer le tissu cardiaque avant le séchage à l’air, recirculez un mélange égal d’éthanol et de HMDS pendant 10 minutes, suivi de 100% HMDS pendant deux heures supplémentaires. Arrêtez la pompe de perfusion, puis débranchez la canule du tube et suspendez le cœur à une suture aortique à l’intérieur de la hotte.

Faites glisser soigneusement un sac à fermeture à glissière sur le cœur et fermez le sceau du sac sur la suture pour réduire l’exposition du cœur à l’air circulant. Laissez le cœur sécher par évaporation pendant une semaine. Pour les agents de contraste à chargement par diffusion, retirez le sac.

Lavez le cœur dans de l’éthanol à 100% pendant 15 minutes avec agitation avant de l’immerger dans du éthanol à 100% complété par 1% de PMA pendant 48 heures sous vide, puis couvrez le cœur avec un sac à fermeture à glissière comme démontré précédemment et laissez-le sécher. Montez le cœur séché à l’air sur un porte-échantillon approprié. Pour éviter tout mouvement pendant les mesures micro CT à rayons X, utilisez une pince ancrée au porte-échantillon et fixez le cœur via l’aorte séchée et rigide.

Montez le porte-échantillon dans le micro-tomodensitomètre. Ensuite, ouvrez le logiciel et lancez le système de micro-tomodensitométrie à rayons X. Réglez ensuite le filtre à rayons X en aluminium sur un millimètre.

Tension de la source de rayons X à 60 kilovolts et courant à 120 microampères. En outre, définissez les dimensions de l’image sur 2 016 par 1 344 pixels et la taille des pixels sur 20 micromètres. Visualisez les images de transmission de rayons X le long du support pour déterminer le champ d’imagerie global dans l’accès longitudinal du cœur.

Pour la numérisation, utilisez une étape de rotation de 0,18 degré, une moyenne d’image de cinq et une rotation d’échantillon de 180 degrés en désélectionnant l’option pour une acquisition à 360 degrés. Sélectionnez le mode de numérisation décalé pour imager toute la largeur du support de l’échantillon. Après la numérisation, utilisez le logiciel pour la reconstruction tomographique d’un volume d’image tridimensionnel isotrope.

En fin de compte, le logiciel de reconnaissance utilise la correction d’artefacts liée à l’acquisition, y compris des effets de durcissement de faisceau de 10% et une réduction d’artefact d’anneau de huit. Ensuite, à l’aide du logiciel Data Viewer, visualisez la pile de données reconstruite. Orientez numériquement l’échantillon à l’intérieur des limites de l’image pour réaligner les échantillons sur les axes long et court avec le principe des trois axes du volume de l’image.

Enfin, recadrez le volume de l’image dans les trois axes pour supprimer les calques d’arrière-plan extérieurs de l’image et réduire au maximum la taille totale de l’image. L’imagerie de transmission par rayons X de cœurs de porc séchés à l’air montre des repères anatomiques majeurs, notamment les cavités ventriculaires et la paroi musculaire. Les reconstructions tomographiques de volumes d’images tridimensionnelles ont montré une séparation distincte entre le tissu et l’arrière-plan aux limites épicardiques et endocardiques.

La coloration trichrome de Mason a montré une coloration positive du collagène au niveau des couches épithéliale et endothéliale paravasculairement dans le tissu sous-épicardique. L’éclairage du champ lumineux a montré une coloration plus foncée dans les structures collagènes après la coloration PMA, soutenant l’accumulation préférentielle de PMA. Les images fluorescentes colorées par PMA de coupes de tissus ventriculaires avaient une perte de fluorescence induite par la PMA sur les sites de collagène.

Lorsqu’un échantillon cardiaque est coloré avec un agent de contraste par perfusion avant le séchage à l’air, la reconstruction de l’image a révélé une coloration très inégale dans le compartiment myocardique. De plus, les tissus à faible contraste ont montré une mauvaise séparation de l’intensité de fond. L’imagerie micro CT d’une partie de mouton souffrant d’infarctus chronique du myocarde a révélé une lésion fibrotique dense centrale entourée d’une zone frontalière lâche et hétérogène.

Les plus grandes intensités de signal des volumes d’image reconstruits aux limites des tissus et des régions cicatricielles sont montrées ici. Les agents de contraste ont mal coloré le myocarde sain, mais le contraste micro structurel a été conservé. Dans la zone frontalière, le tissu cicatriciel était entrecoupé de myocarde survivant.

La fibrose dense est apparue transmurale mais texturée indiquant des variations dans la composition. La région ventriculaire gauche transmurale de la préparation tissulaire colorée en PMA a montré une coloration sélective du collagène et aucune coloration dans les régions du myocarde survivant. Des temps de perfusion plus longs à l’aide d’éthanol sont recommandés pour assurer l’échange complet de la teneur en eau du cœur avec de l’éthanol.

Les interactions entre le HMDS et l’eau produisent de la chaleur, ce qui peut endommager l’échantillon. Un avantage important de cette procédure est la possibilité de valider l’imagerie micro CT à l’aide de l’histologie. Les échantillons séchés à l’air peuvent être directement incorporés dans la paraffine pour la coloration de sectionnement et l’imagerie microscopique.