Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Notre découverte suggère que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture de cardiomyocytes des cellules endothéliales est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes contre les lésions simulées de reprofusion d’ischémie. Les modèles de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier le rôle des interactions cellule-cellule sur la fonction et la différenciation cellulaires. Cependant, des traitements distincts entre les types de cellules et l’analyse en aval d’un seul type de cellule ne sont pas facilement réalisables dans la co-culture mixte.

L’étude actuelle visait à créer deux couches cellulaires distinctes avec une distance significative entre elles où l’on peut induire une lésion de reprofusion d’hypoxie et étudier le résultat et les effets sur un seul type de cellule. Commencez la préparation en décongelant les deux lignées cellulaires. Plaquer les cellules dans des flacons de T25 après les avoir lavées avec des milieux frais.

Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et utilisez-les lorsqu’elles sont confluentes. Maintenez l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 21% d’oxygène, 5% de dioxyde de carbone et 74% d’azote. Gardez-le humidifié.

Estimer la confluence de la lignée cellulaire des cardiomyocytes au microscope optique. Retirer le milieu des flacons contenant des cultures cellulaires confluentes et essayer avec trois à cinq millilitres de trypsine-EDTA par flacon. Agiter doucement la fiole et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes.

Après cela, évaluez les progrès enzymatiques au microscope optique. Après le détachement, inactiver la solution de trypsine en ajoutant la trysine ou la solution cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu par fiole T25. Centrifuger la suspension de la cellule à 120 x g pendant deux minutes pour obtenir une pastille de cellule molle.

Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres d’un support. Ensuite, effectuez le comptage des cellules et confirmez la viabilité des cellules. Mélanger et aliquoter 10 microlitres de cellules remises en suspension et 10 microlitres de colorant bleu trypan, puis compter les cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules.

Diluer les cellules avec des milieux frais réguliers pour obtenir les densités d’ensemencement souhaitées. Prenez une plaque de 24 puits pré-enrobée avec une matrice extracellulaire et des cardiomyocytes de plaque à des densités d’ensemencement de 300 000 par puits sur le fond de la plaque. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Après 24 heures, plaquer les cellules endothéliales dans des inserts à une densité de placage optimale de 100 000 par insert. Après 24 heures de placage de cellules endothéliales, placez des inserts de cellules endothéliales à l’intérieur des puits de cardiomyocytes et initiez la co-culture. Permettre aux cellules de co-cultiver pendant 12 à 24 heures avant d’effectuer les expériences.

Préparez le milieu hypoxique en versant environ 25 millilitres de milieu dans un tube conique de 50 millilitres. Scellez le dessus à l’air avec une membrane en silicone et utilisez une pipette stérilisée pour percer un trou. Après cela, créez un autre trou et laissez environ 2/3 des pipettes immergées dans le média.

Rincez le milieu avec du gaz hypoxique pendant cinq minutes à un débit de 30 litres par minute, puis jetez le milieu des plaques de 24 puits ou des inserts de culture contenant des cellules attachées. Lavez-les très doucement avec 100 microlitres de 10% PBS par puits, ajoutez 500 microlitres de milieux hypoxiques fraîchement préparés à chaque puits des plaques ou des inserts. Remplacer le milieu d’origine par un milieu normal frais contenant du glucose et du sérum dans le groupe témoin normoxique.

Placez une boîte de Petri remplie d’eau stérile dans la chambre d’hypoxie pour humidifier la chambre. Placez ensuite les plaques contenant les groupes hypoxiques dans la chambre. Rincez la chambre d’hypoxie avec du gaz hypoxique pendant cinq minutes à un débit de 30 litres par minute.

Après cela, placez la chambre à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’hypoxie, jetez les anciens milieux des plaques ou des inserts et ajoutez 500 microlitres de milieux normaux contenant du glucose et du sérum à chaque paroi des plaques, puis stockez les plaques à l’intérieur d’un incubateur dans des conditions de culture normales pendant deux heures pour imiter la reperfusion. Transférer le milieu de culture cellulaire de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits, puis prélever 200 microlitres de milieu de chaque puits de la plaque de 24 puits et répartir également dans quatre puits de la plaque de 96 puits.

Mesurez l’absorbance de la LDH à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité dans une plaque de 96 puits et suivez les instructions du fabricant pour déterminer le degré de lésion cellulaire. Dans cette étude, trois types d’inserts ont été évalués. Les trois inserts avaient la même taille de pores de 0,4 micromètre.

La seule différence entre eux était l’insert à la hauteur de la base, permettant aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 millimètres. En utilisant ce protocole, les cellules ont été cultivées dans des conditions normales d’oxygène, puis divisées en deux groupes, un groupe témoin normoxique et le groupe hypoxie. Après 24 heures, les deux groupes ont été rafraîchis avec un milieu et cultivés dans des conditions normales d’oxygène pendant deux autres heures avant d’effectuer les tests d’évaluation.

Une comparaison des trois types d’inserts de culture dans l’évaluation de la libération de lactate déshydrogénase pour les cardiomyocytes seuls, les cellules endothéliales seules et la co-culture de cardiomyocytes avec des cellules endothéliales est présentée ici dans des conditions de réoxygénation normoxique, hypoxie uniquement et hypoxie. Avec une distance de 0,5 millimètre entre les couches cellulaires, l’hypoxie a entraîné une augmentation significative de la libération de LDH par rapport à la normoxie lorsque les cardiomyocytes étaient cultivés seuls. Cependant, la LDH n’a été que légèrement augmentée dans le groupe de réoxygénation de l’hypoxie par rapport au groupe d’hypoxie uniquement.

Lorsque les cellules endothéliales et les cardiomyocytes ont été co-cultivés ensemble, l’augmentation de la libération de LDH dans les seules conditions d’hypoxie n’a pas été atténuée. Cela indique que les cellules endothéliales n’ont eu aucun effet protecteur par rapport au groupe des cardiomyocytes seuls dans les conditions d’hypoxie uniquement. Cependant, les cellules endothéliales ont exercé une protection légère mais significative sur les cardiomyocytes pendant la HR. Lorsque la distance entre les couches cellulaires était d’un millimètre, la libération de LDH était également significativement augmentée dans les cardiomyocytes uniquement dans la condition d’hypoxie.

Cependant, contrairement à l’insert de 0,5 millimètre, l’augmentation de la LDH dans les cardiomyocytes seulement a été potentialisée par HR sur les conditions d’hypoxie seulement. Cette augmentation était encore plus prononcée avec l’insert de deux millimètres. La concentration de cellules endothéliales plaquées dans des inserts de deux millimètres a été titrée à 25 000, 50 000 et 100 000 cellules par insert, respectivement.

il a été constaté que l’augmentation de l’intensité des cellules endothéliales dans la co-culture entraînait une atténuation dose-dépendante de la libération de LDH causée par hr. Cependant, aucun effet de ce type n’a été observé dans des conditions normoxiques. Cette méthodologie de co-culture ne se limite pas aux cellules endothéliales et aux cardiomyocytes. Ces méthodes devraient aider à étudier les interactions cellulaires spécifiques entre des lignées cellulaires variées dans plusieurs organes d’intérêt.