Name: Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Découvrez un modèle de co-culture endothélium-cardiomyocytes pour étudier l'ischémie-reperfusion in vitro. Cette méthode permet d'évaluer la protection des cellules cardiaques par les cellules endothéliales selon la distance spatiale entre les couches cellulaires.

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Ce travail a été soutenu, en partie, par le service de R&D du laboratoire biomédical du département des Anciens Combattants des États-Unis (I01 BX003482) et par des fonds institutionnels versés à M.L.R.

1. Préparation/placage expérimental
<ol><li>Entretenez les CM et les CE conformément aux instructions du fabricant.<ol>
<li>Décongelez les deux lignées cellulaires lorsqu’elles arrivent des fournisseurs. Plaque dans des flacons T25 après avoir été lavée avec du milieu frais. Il est recommandé d’acheter chaque milieu de culture cellulaire auprès des mêmes fournisseurs que ceux auprès desquels les cellules ont été achetées. Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et utilisez-les lorsqu’elles sont confluentes.</li>
		<li>Maintenez l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 21 % O2, 5 % CO2, 74 % N2 et maintenez-le humidifié. REMARQUE: Les cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris utilisées dans ce protocole sont isolées des artères coronaires de souris C57BL / 6, et les cardiomyocytes de souris adultes sont isolés à partir de cœurs de souris C57BL / 6J adultes et obtenus commercialement (voir tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaques CM dans des conditions stériles sur le fond de plaques de 24 puits (couche inférieure). 24 h plus tard, plaquez les CE dans l’insert (ou la partie supérieure) du puits de co-culture. 24 h après le placage EC, placez les inserts EC sur des bases de plaques CM, commençant la période de co-culture. Laisser les cellules co-cultiver pendant au moins 12-24 h avant utilisation. Ces étapes sont décrites en détail ci-dessous.<ol>
<li>Estimer la confluence des lignées cellulaires CM au microscope optique. Lorsque les cellules semblent être confluentes à 90% à 100% dans des flacons de culture, procédez au placage expérimental.</li>
		<li>Retirer le milieu des flacons contenant des cultures cellulaires confluentes et trypsiniser avec 3 à 5 mL de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour les flacons de T25. Agiter doucement la fiole, incuber à 37 °C pendant 2 à 5 min, puis évaluer la progression enzymatique au microscope optique. Une fois que les cellules commencent à s’arrondir, utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules de la surface.</li>
		<li>Après le détachement, inactiver la solution de trypsine en ajoutant la solution de trypsine/cellule dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu pour les flacons de T25. Centrifuger la suspension de la cellule à 120 x g pendant 2 min pour obtenir une pastille de cellule molle. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de support.</li>
		<li>Pour effectuer le comptage cellulaire et confirmer la viabilité cellulaire, mélanger une aliquote de 10 μL de cellules remises en suspension et 10 μL de colorant bleu de trypan. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules. Diluer les cellules avec des milieux frais réguliers pour obtenir les densités d’ensemencement souhaitées. Les volumes sont calculés en fonction de la densité de graines souhaitée et de la concentration cellulaire des solutions mères. Tout placage doit être effectué dans des conditions stériles.</li>
		<li>Plaques CM à des densités d’ensemencement de 300 000 par puits sur le fond d’une plaque de 24 puits pré-enduite de matrice extracellulaire. Maintenez les cellules à 37 °C avec 21 % d’O2et 5 % de CO2 pendant la nuit.</li>
		<li>Après 24 h, les EC de plaque dans des inserts à une densité de placage optimale de 100 000 par insert (la surface de culture est de 33,6 mm2) (Figure 1). Après 24 h de placage EC, placez des inserts EC à l’intérieur des puits CM, initiant ainsi la co-culture. Permettre aux cellules de co-cultiver pendant 12-24 h avant d’effectuer les expériences.</li>
		<li>Assurez-vous qu’au moment où les expériences sont effectuées, les CM et les CE ont atteint une confluence de 80 % à 90 %.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hypoxie/réoxygénation pour simuler une lésion d’ischémie/reperfusion in vitro
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées comme décrit, ne faites pas de pause entre les deux.
<ol><li>Préparez le milieu hypoxique en versant environ 25 mL de milieu dans un tube conique de 50 mL. Scellez le dessus à l’air avec une membrane en silicone et utilisez une pipette stérilisée pour percer un trou. Créez un autre trou, cette fois en laissant la pipette immergée environ 2/3 dans le média.</li>
	<li>Rincer le milieu avec du gaz hypoxique (0,0125 % O2, 5 % CO2, 94,99 % N2) pendant 5 min à un débit de 30 L/min. Cela minimisel’O2 dissous dans le milieu lorsque l’hypoxie commence (étape 2.5).</li>
	<li>Jeter les milieux des plaques de 24 puits ou des inserts de culture contenant des cellules attachées et laver avec 100 μL / puits de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 10% très doucement. Ensuite, ajoutez 500 μL de milieux hypoxiques fraîchement préparés à chaque puits des plaques ou des inserts. REMARQUE: L’hypoxie dans les médias est interrompue aussi brièvement que possible au cours de cette étape avant que la véritable hypoxie pour les cellules et les médias ne commence à l’étape 2.5.<ol>
<li>Dans le groupe témoin normoxique, remplacez le milieu d’origine par un milieu normal frais contenant du glucose et du sérum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Humidifiez la chambre d’hypoxie en plaçant une boîte de Petri remplie d’eau stérile dans la chambre. Ensuite, placez les plaques comprenant les groupes hypoxiques dans la chambre.</li>
	<li>Rincer la chambre d’hypoxie avec du gaz hypoxique (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) pendant 5 min à un débit de 30 L/min. Placez la chambre dans l’incubateur à 37 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Après l’hypoxie, cultivez les CM et les CE dans des conditions normales. Pour ce faire, jetez l’ancien milieu des plaques/inserts, remplacez-le par un milieu normal (contenant du glucose et du sérum; 500 μL de chaque puits/insert) et conservez-le dans l’incubateur dans des conditions de culture normales (21 % O2, 5 % CO2, 74 % N2, 37 °C) pendant 2 h pour imiter la reperfusion.</li>
	<li>Pour contrôler les effets du remplacement du milieu, modifiez le milieu des cellules normoxiques en même temps que le milieu hypoxique est modifié. REMARQUE : La figure 2 fournit une vue d’ensemble schématique de ce protocole.</li>
</ol>3. Évaluation des points de terminaison
<ol><li>Transférer le milieu de culture cellulaire de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits. Utilisez 200 μL de média de chaque puits de la plaque de 24 puits et répartissez également dans quatre puits de la plaque de 96 puits, en conséquence. Utilisez une plaque chacune pour la normoxie par rapport à l’hypoxie par rapport à la HR.</li>
	<li>Déterminer le degré de lésion cellulaire, par exemple, en mesurant l’absorbance de la LDH à l’aide d’une trousse de dosage de cytotoxicité en suivant les instructions du fabricant. Effectuez le test dans une plaque de 96 puits comme indiqué dans le protocole d’essai.</li>
</ol>4. Statistiques
<ol><li>Affichez les données paramétriques sous forme d’écart-type moyen et les données non paramétriques sous forme de diagrammes en boîte avec plage médiane/interquartile. Des tests de comparaisons multiples paramétriques et non paramétriques adéquats avec des tests post-hoc acceptables pour réduire le risque d’erreur de type 1 doivent être effectués. La signification est généralement fixée à un alpha de 0,05 (à deux queues).</li>
	<li>Pour toutes les expériences réalisées dans la présente étude, effectuer au moins trois répliques de puits dans une expérience. Il y avait trois à six répétitions de chaque expérience utilisée pour l’analyse statistique.</li>
</ol>

<ol><li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury%3A+a+30+year+voyage+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).</li>
<li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+a+neglected+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+pathways+in+acute+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li>
<li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li>
<li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li>
<li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711(2012).</li>
<li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Étapes critiques du protocole Des modèles de co-culture cellulaire ont été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires de la cardioprotection. Comment créer deux couches distinctes avec une distance significative entre elles est donc crucial pour le développement d’un modèle de co-culture approprié. Un défi dans l’étude de la lésion simulée IR, c’est-à-dire HR, est que non seulement l’ischémie (hypoxie) elle-même, mais aussi la reperfusion (réoxygénation) aggravent le dysfonctionnement cellulaire...

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde 1,2. Cependant, le processus de traitement de la reperfusion peut lui-même provoquer la mort des cardiomyocytes, connue sous le nom de lésion d’ischémie / reperfusion myocardique (IR), pour laquelle il n’existe toujours pas de remède efficace3. Les cellules endothéliales (CE) ont été suggérées pour protéger les cardiomyocytes (CM) par la sécrétion de signaux paracrines, ainsi que par des interactions de cellule à cellule4.
Les modèles de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier le rôle des interactions cellule-cellule autocrine et/ou paracrine sur la fonction et la différenciation cellulaires. Parmi les modèles de co-culture, la co-culture mixte est la plus simple, où deux types différents de cellules sont en contact direct dans un seul compartiment de culture à un rapport cellulaire souhaité5. Cependant, des traitements distincts entre les types de cellules et l’analyse en aval d’un seul type de cellule ne sont pas facilement réalisables compte tenu de la population mixte.
Des études antérieures ont indiqué que les insultes hypoxiques et ischémiques causent des dommages importants à l’intégrité de la membrane cellulaire mesurée par la libération de lactate déshydrogénase (LDH). Cette blessure est aggravée lors de la réoxygénation, imitant la lésion de reperfusion 6,7,8. L’objectif du protocole actuel était de tester les hypothèses selon lesquelles la présence d’EC peut atténuer en fonction de la dose les fuites de membrane cellulaire des CM causées par l’hypoxie et la réoxygénation (HR) et que l’effet protecteur des CE peut être optimisé en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires. Ainsi, nous avons utilisé trois types d’inserts de culture cellulaire et des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes. Les inserts, marqués par Corning, Merck Millipore et Greiner Bio-One, nous ont permis de créer trois conditions de diaphonie de culture cellulaire différentes avec des distances intercellulaires de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. 100 000 CE ont été plaqués par insert dans chaque cas.
De plus, afin de déterminer si la densité des CE en co-culture contribue à l’atténuation des lésions HR dans ce modèle, nous avons étudié la relation dose-réponse entre la concentration d’EC et la libération de LDH par les CM. Les EC ont été plaqués à 25 000, 50 000 et 100 000 par insert, respectivement, dans l’insert de 2,0 mm.
Le présent rapport offre aux enquêteurs une approche étape par étape pour qu’ils utilisent cet important modèle à leur avantage.

<table><tbody><tr><td>Cardiomyocytes de souris adultes (CM)</td><td>Celprogen Inc</td><td>11041-14</td><td>Isolé du tissu cardiaque de souris adulte C57BL/6J</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>Comptage des cellules pour le calcul</td></tr><tr><td>du nombre de cellules Bio-Safety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU425400</td><td>Capot stérile de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Culture cellulaire Congélation</td><td>de cellules moyennes Biological Logics Inc</td><td>6916</td><td>Utilisé pour la congélation cellulaire pour le stockage à long terme de lignées cellulaires</td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire</td><td>Nuaire</td><td>Nu-5500</td><td>Pour fournir des conditions de vie cellulaires normales (21 %O2, 5 %CO2, 74 %N2, 37&deg ; C, humidifié)</td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire Réservoir de gaz</td><td>A-L Gaz comprimés</td><td>UN1013</td><td>Gaz nécessaire pour l’incubateur de culture cellulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire A (0,5 mm)</td><td>Corning Inc</td><td>353095</td><td>Utilisés pour la co-culture EC-CM</td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire B (1,0 mm)</td><td>Millicell Millipore</td><td>PIHP01250</td><td>Utilisés pour la co-culture EC-CM</td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire C (2,0 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662640</td><td>Utilisé pour la co-culture EC-CM</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Anstel Enterprises Inc</td><td>4235</td><td>Pour le placage et le passage de cultures cellulaires</td></tr><tr><td>CMs Flacons de culture cellulaire T25</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14</td><td>Utilisé pour la culture régulière de CMs, enrobé par le fabricant</td></tr><tr><td>CMs Milieu de culture cellulaire complet</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14S</td><td>Milieu de culture CMs</td></tr><tr><td>complet CMs Milieu de culture cellulaire Complet sans phénol</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14PN</td><td>Milieu de culture CM sans rouge de phénol utilisé lors de la mesure de la LDH</td></tr><tr><td>CMs Plaques de culture cellulaire 96 well</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14-96well</td><td>Utilisé pour les expériences de mesure de la LDH, enduit par le fabricant</td></tr><tr><td>CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14GFPN</td><td>CMs Culture cellulaire dans des conditions hypoxiques (sans glucose ni sérum)</td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage cellulaire Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Lames de comptage utilisées pour le compteur de cellules</td></tr><tr><td>Cyquant Kit de cytotoxicité</td> <td>LDHThermo Scientific&nbsp ;</td><td>C20301</td><td>Kit de mesure LDH</td></tr><tr><td>ECs Flacons de culture cellulaire T25</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>FB012935</td><td>Utilisé pour la culture régulière ECs</td></tr><tr><td>Milieu de culture cellulaire ECs Complete</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>ECs Milieu complet sans phénol</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168PF</td><td>Milieu de culture ECs sans rouge de phénol utilisé lors de la mesure de la LDH</td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire ECs 96 puits</td><td>Fisher Scientific (Costar)</td><td>3370</td><td>Utilisé pour les expériences de LDH mesure</td></tr><tr><td>ECs Culture Solution d’enrobage à base de gélatine</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6950</td><td>Utilisé pour l’enrobage des flacons et des plaques pour ECs</td></tr><tr><td>ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>GPF1168</td><td>ECs Culture cellulaire dans des conditions hypoxiques (sans glucose ni sérum)</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35011CV</td><td>FBS-HI Approuvé par l’USDA pour la culture cellulaire et l’entretien</td></tr><tr><td>Chambre d’hypoxie</td><td>StemCell Technologies</td><td>27310</td><td>Pour créer une condition hypoxique avec un environnement 0,01 % O2</td></tr><tr><td>Débitmètre de chambre d’hypoxie</td><td>StemCell Technologies</td><td>27311</td><td>Pour se connecter à un réservoir de gaz hypoxique pour une vitesse d’écoulement de gaz constante</td></tr><tr><td>Réservoir de gaz hypoxique (0,01 % O2</sous-> Bouteille)</td><td>A-L Gaz comprimés</td><td>UN1956</td><td>Utilisé pour rincer le milieu hypoxique et la chambre (0,01 %O2/5 %CO2/94,99N2)</td></tr><tr><td>Microscope&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Pour observer l’état cellulaire</td></tr><tr><td>Souris Cellules endothéliales primaires de l’artère coronaire (CE)</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>C57-6093</td><td>Isolé de l’artère coronaire de souris C57BL/6</td></tr><tr><td>NUNC 15ML CONICL Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td>Pour le processus de culture cellulaire, les expériences, la préparation de solutions, etc.</td></tr><tr><td>NUNC 50ML CONICL Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td>Pour le processus de culture cellulaire, les expériences, la préparation de solutions, etc.</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Utilisé pour le lavage cellulaire pendant la culture ou les expériences</td></tr><tr><td>Lecteur de plaque</td><td>Instrument BioTek</td><td>11120533</td><td>Lecture de plaque colorimétrique ou fluorométrique</td></tr><tr><td>Réaction 96 Bien pâle (transparent sans couvercle)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565226</td><td>Utilisé pour la lecture de plaque de mesure LDH</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA pour CM</td><td>Celprogen Inc</td><td>T1509-014</td><td>1 x stérile filtré et testé pour culture tissulaire</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA pour EC</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6914/0619</td><td>0,25 %, testé pour la cuture cellulaire</td></tr></tbody></table>

développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde. La reperfusion provoque des blessures supplémentaires au-delà de l’ischémie. Les cellules endothéliales (CE) peuvent protéger les cardiomyocytes (CM) contre les lésions de reperfusion par le biais d’interactions cellule-cellule. Les co-cultures peuvent aider à étudier le rôle des interactions cellule-cellule. Une co-culture mixte est l’approche la plus simple, mais elle est limitée car les traitements isolés et les analyses en aval de types de cellules uniques ne sont pas réalisables. Pour déterminer si les CE peuvent atténuer les dommages aux cellules CM en fonction de la dose et si cette protection peut être encore optimisée en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires, nous avons utilisé des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes pour tester trois types d’inserts de culture cellulaire qui variaient dans leur distance de couche intercellulaire à 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. Dans les CM seulement, les lésions cellulaires évaluées par la libération de lactate déshydrogénase (LDH) ont augmenté de manière significative pendant l’hypoxie et plus loin lors de la réoxygénation lorsque la distance était de 2,0 mm par rapport à 0,5 et 1,0 mm. Lorsque les EC et les CM étaient en contact presque direct (0,5 mm), il n’y avait qu’une légère atténuation de la lésion de réoxygénation des CM après une hypoxie. Cette atténuation a été considérablement augmentée lorsque la distance spatiale était de 1,0 mm. Avec une distance de 2,0 mm, les CE atténuaient les lésions cm pendant l’hypoxie et l’hypoxie/réoxygénation, ce qui indique qu’une distance de culture suffisante est nécessaire pour que les CE puissent communiquer avec les CM, afin que les molécules de signal sécrétées puissent circuler et stimuler pleinement les voies protectrices. Nos résultats suggèrent, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture EC/CM est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des CE dans la protection contre la CM contre les lésions simulées d’ischémie / reperfusion. L’objectif de ce rapport est de fournir une approche étape par étape permettant aux enquêteurs d’utiliser cet important modèle à leur avantage.

Les trois types d’inserts (A, B, C) utilisés dans cette expérience ont la même taille de pores de 0,4 μm. La seule différence entre eux est la hauteur de l’insert à la base, qui permet aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement, (Figure 3) et qu’elles proviennent de fournisseurs différents (pour plus de détails, voir tableau des matériaux).
Pour établir un modèle de co-culture in ...

La distance spatiale est un paramètre clé dans l’évaluation des lésions d’hypoxie / réoxygénation dans un modèle de co-culture de couches cellulaires endothéliales et cardiomyocytaires séparées, suggérant, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes.

Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Notre découverte suggère que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture de cardiomyocytes des cellules endothéliales est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes contre les lésions simulées de reprofusion d’ischémie. Les modèles de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier le rôle des interactions cellule-cellule sur la fonction et la différenciation cellulaires. Cependant, des traitements distincts entre les types de cellules et l’analyse en aval d’un seul type de cellule ne sont pas facilement réalisables dans la co-culture mixte.L’étude actuelle visait à créer deux couches cellulaires distinctes avec une distance significative entre elles où l’on peut induire une lésion de reprofusion d’hypoxie et étudier le résultat et les effets sur un seul type de cellule. Commencez la préparation en décongelant les deux lignées cellulaires. Plaquer les cellules dans des flacons de T25 après les avoir lavées avec des milieux frais.Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et utilisez-les lorsqu’elles sont confluentes. Maintenez l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 21% d’oxygène, 5% de dioxyde de carbone et 74% d’azote. Gardez-le humidifié.Estimer la confluence de la lignée cellulaire des cardiomyocytes au microscope optique. Retirer le milieu des flacons contenant des cultures cellulaires confluentes et essayer avec trois à cinq millilitres de trypsine-EDTA par flacon. Agiter doucement la fiole et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes.Après cela, évaluez les progrès enzymatiques au microscope optique. Après le détachement, inactiver la solution de trypsine en ajoutant la trysine ou la solution cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu par fiole T25. Centrifuger la suspension de la cellule à 120 x g pendant deux minutes pour obtenir une pastille de cellule molle.Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres d’un support. Ensuite, effectuez le comptage des cellules et confirmez la viabilité des cellules. Mélanger et aliquoter 10 microlitres de cellules remises en suspension et 10 microlitres de colorant bleu trypan, puis compter les cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules.Diluer les cellules avec des milieux frais réguliers pour obtenir les densités d’ensemencement souhaitées. Prenez une plaque de 24 puits pré-enrobée avec une matrice extracellulaire et des cardiomyocytes de plaque à des densités d’ensemencement de 300 000 par puits sur le fond de la plaque. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit.Après 24 heures, plaquer les cellules endothéliales dans des inserts à une densité de placage optimale de 100 000 par insert. Après 24 heures de placage de cellules endothéliales, placez des inserts de cellules endothéliales à l’intérieur des puits de cardiomyocytes et initiez la co-culture. Permettre aux cellules de co-cultiver pendant 12 à 24 heures avant d’effectuer les expériences.Préparez le milieu hypoxique en versant environ 25 millilitres de milieu dans un tube conique de 50 millilitres. Scellez le dessus à l’air avec une membrane en silicone et utilisez une pipette stérilisée pour percer un trou. Après cela, créez un autre trou et laissez environ 2/3 des pipettes immergées dans le média.Rincez le milieu avec du gaz hypoxique pendant cinq minutes à un débit de 30 litres par minute, puis jetez le milieu des plaques de 24 puits ou des inserts de culture contenant des cellules attachées. Lavez-les très doucement avec 100 microlitres de 10% PBS par puits, ajoutez 500 microlitres de milieux hypoxiques fraîchement préparés à chaque puits des plaques ou des inserts. Remplacer le milieu d’origine par un milieu normal frais contenant du glucose et du sérum dans le groupe témoin normoxique.Placez une boîte de Petri remplie d’eau stérile dans la chambre d’hypoxie pour humidifier la chambre. Placez ensuite les plaques contenant les groupes hypoxiques dans la chambre. Rincez la chambre d’hypoxie avec du gaz hypoxique pendant cinq minutes à un débit de 30 litres par minute.Après cela, placez la chambre à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’hypoxie, jetez les anciens milieux des plaques ou des inserts et ajoutez 500 microlitres de milieux normaux contenant du glucose et du sérum à chaque paroi des plaques, puis stockez les plaques à l’intérieur d’un incubateur dans des conditions de culture normales pendant deux heures pour imiter la reperfusion. Transférer le milieu de culture cellulaire de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits, puis prélever 200 microlitres de milieu de chaque puits de la plaque de 24 puits et répartir également dans quatre puits de la plaque de 96 puits.Mesurez l’absorbance de la LDH à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité dans une plaque de 96 puits et suivez les instructions du fabricant pour déterminer le degré de lésion cellulaire. Dans cette étude, trois types d’inserts ont été évalués. Les trois inserts avaient la même taille de pores de 0,4 micromètre.La seule différence entre eux était l’insert à la hauteur de la base, permettant aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 millimètres. En utilisant ce protocole, les cellules ont été cultivées dans des conditions normales d’oxygène, puis divisées en deux groupes, un groupe témoin normoxique et le groupe hypoxie. Après 24 heures, les deux groupes ont été rafraîchis avec un milieu et cultivés dans des conditions normales d’oxygène pendant deux autres heures avant d’effectuer les tests d’évaluation.Une comparaison des trois types d’inserts de culture dans l’évaluation de la libération de lactate déshydrogénase pour les cardiomyocytes seuls, les cellules endothéliales seules et la co-culture de cardiomyocytes avec des cellules endothéliales est présentée ici dans des conditions de réoxygénation normoxique, hypoxie uniquement et hypoxie. Avec une distance de 0,5 millimètre entre les couches cellulaires, l’hypoxie a entraîné une augmentation significative de la libération de LDH par rapport à la normoxie lorsque les cardiomyocytes étaient cultivés seuls. Cependant, la LDH n’a été que légèrement augmentée dans le groupe de réoxygénation de l’hypoxie par rapport au groupe d’hypoxie uniquement.Lorsque les cellules endothéliales et les cardiomyocytes ont été co-cultivés ensemble, l’augmentation de la libération de LDH dans les seules conditions d’hypoxie n’a pas été atténuée. Cela indique que les cellules endothéliales n’ont eu aucun effet protecteur par rapport au groupe des cardiomyocytes seuls dans les conditions d’hypoxie uniquement. Cependant, les cellules endothéliales ont exercé une protection légère mais significative sur les cardiomyocytes pendant la HR. Lorsque la distance entre les couches cellulaires était d’un millimètre, la libération de LDH était également significativement augmentée dans les cardiomyocytes uniquement dans la condition d’hypoxie.Cependant, contrairement à l’insert de 0,5 millimètre, l’augmentation de la LDH dans les cardiomyocytes seulement a été potentialisée par HR sur les conditions d’hypoxie seulement. Cette augmentation était encore plus prononcée avec l’insert de deux millimètres. La concentration de cellules endothéliales plaquées dans des inserts de deux millimètres a été titrée à 25 000, 50 000 et 100 000 cellules par insert, respectivement.il a été constaté que l’augmentation de l’intensité des cellules endothéliales dans la co-culture entraînait une atténuation dose-dépendante de la libération de LDH causée par hr. Cependant, aucun effet de ce type n’a été observé dans des conditions normoxiques. Cette méthodologie de co-culture ne se limite pas aux cellules endothéliales et aux cardiomyocytes. Ces méthodes devraient aider à étudier les interactions cellulaires spécifiques entre des lignées cellulaires variées dans plusieurs organes d’intérêt.

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