Coloration immunohistochimique fluorescente multiplexée de quatre types de cellules immunitaires de l’endomètre lors d’une fausse couche récurrente
4 août 2021
Malgré les progrès de l’immunohistochimie multiplexe et de l’imagerie multispectrale, caractériser la densité et le regroupement simultané des principales cellules immunitaires dans l’endomètre reste un défi. Cet article décrit un protocole de coloration multiplex détaillé et une imagerie pour la localisation simultanée de quatre types de cellules immunitaires dans l’endomètre.
La technologie actuelle permet l’utilisation d’anticorps élevés chez la même espèce pour détecter jusqu’à sept marqueurs. Loucia Chan, une technicienne du laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par préparer les lames de verre en paraffine fixées au formol montées avec l’échantillon de tissu, en plaçant les lames à plat dans un four, pour cuire à 60 degrés Celsius avec le tissu tourné vers le haut.
Après une heure, décirez et réhydratez les lames toutes les 10 minutes chacune avec la série de produits chimiques, comme décrit dans le manuscrit. Immergez les lames dans une solution saline tamponnée tris, puis dans une boîte à lames en plastique remplie d’un mélange de formaldéhyde dilué dans du méthanol, pour fixer les échantillons. Ensuite, lavez les lames deux fois dans de l’eau désionisée pendant deux minutes.
Procéder à la récupération de l’épitope, en plaçant le rack de lames dans une boîte de résistance à la chaleur remplie de tampon d’acide citrique à pH 6,0. Et puis placer la boîte au micro-ondes, pour chauffer les lames d’abord à 100% de puissance pendant 50 secondes, puis 20 minutes à 20% de puissance, pour maintenir la même température. Après avoir rincé les lames à l’eau distillée et les avoir lavées avec tbST, immergez la lame dans un bocal contenant une solution bloquant la peroxydation pendant 10 minutes.
Après l’incubation, rincez les lames à l’eau distillée et lavez-les avec tbST, puis utilisez un stylo barrière hydrophobe pour marquer une limite autour de la section tissulaire sur la lame. Rincez ensuite la lame dans TBST, couvrez les sections de tissu avec le tampon bloquant et incubez les lames dans une chambre humidifiée pendant 15 minutes. Pour éliminer les réactifs bloquants, incuber d’abord les lames avec l’anticorps primaire d’intérêt, puis retirer l’anticorps primaire en lavant les lames trois fois avec tbST, avant l’incubation avec l’anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort polymère.
Après l’incubation, lavez les lames avant d’appliquer la flore opale pour la solution de travail TSA, puis rincez la lame avec le tampon de récupération de l’antigène. Effectuez le décapage à base de micro-ondes en chauffant les lames dans un tampon de récupération d’antigène dans un micro-ondes à 100% de puissance, pendant 50 secondes, suivi de 20% de puissance pendant 20 minutes dans les récipients de sécurité au micro-ondes. Après avoir refroidi les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes, rincer les lames à l’eau distillée et au TBST, puis incuber avec une solution de soupe pendant cinq minutes.
Ensuite, séchez la glissière à l’air libre avant de la monter avec le support de montage approprié. Avant l’imagerie des diapositives, préréglez les filtres appropriés dans le poste de travail. Capturez un minimum de 10 champs pour une analyse inférieure à un grossissement de 200 fois.
Pour compter les cellules, cliquez sur le bouton Compter les objets dans la barre d’étapes, pour afficher le panneau des paramètres de comptage d’objets. Si le tissu a été segmenté, sélectionnez la catégorie de tissu dans laquelle les objets se trouvent. Sélectionnez ensuite la mise à l’échelle de signal souhaitée à partir de l’échelle automatique ou de l’échelle fixe.
Pour la segmentation des objets, sélectionnez le composant principal dans la liste déroulante. Pour détecter les objets touchant d’autres objets en tant qu’objets individuels et non combinés, cochez la case taille maximale et pixels, puis optez pour le fractionnement affiné. Ensuite, comptez toutes les cellules stromales dans les cellules immunitaires séparément, pour exprimer les données en pourcentage des cellules immunitaires par rapport au nombre total de cellules stromales pour chaque image capturée.
Plus tard, indiquez le nombre final de cellules comme une moyenne de tous les champs. À l’aide de l’éditeur de vues, examinez le post-traitement des tables de données résultantes, puis exportez la table de données de comptage. Dans l’analyse représentative, quatre types de cellules immunitaires dans l’échantillon d’endomètre sont différenciés.
L’image traitée montre la segmentation des tissus sous forme de compartiments épithéliaux et stromaux. L’immunocoloration multiplex a été réalisée sur les biopsies de l’endomètre d’une femme témoin fertile et d’une femme présentant une fausse couche récurrente inexpliquée, un seul étage pour nous représentant CD3, CD56, CD68 et CD20 ont été révélés dans l’immunocoloration. Une fois que le son immunitaire a été identifié, une coloration supplémentaire sous la cytokine peut aider à traiter leur interaction et leur mécanisme de réussite de l’implantation.
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Aperçu
Cette étude aborde les défis liés à la caractérisation simultanée de la densité et du regroupement des principaux types de cellules immunitaires dans l'endomètre à l'aide de l'immunohistochimie multiplexe et de l'imagerie multispectrale. Un protocole de coloration détaillé est décrit pour la localisation simultanée de quatre types de cellules immunitaires dans l'endomètre.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Immunologie
- Biologie de l'endomètre
- Techniques d'imagerie multiplexe
Contexte
- Importance de la caractérisation des cellules immunitaires en biologie de la reproduction.
- Difficultés liées aux méthodes traditionnelles de coloration.
- Progrès réalisés dans les technologies d'imagerie.
Méthodes utilisées
- Immunohistochimie multiplex
- Échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine
- Imagerie multispectrale
Résultats principaux
- Détection réussie de quatre types de cellules immunitaires (CD3, CD56, CD68, CD20) dans l'endomètre.
- Visualisation de la distribution et de l'aggrégation des cellules immunitaires.
- Amélioration du protocole pour des études ultérieures.
Conclusions
- L'étude démontre une méthode fiable pour l'analyse des cellules immunitaires dans l'endomètre.
- Cela a des implications pour la compréhension de la santé reproductive et du succès de l'implantation.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La coloration immunohistochimique fluorescente multiplexée permet la quantification simultanée de plusieurs populations de cellules immunitaires au sein d'une même coupe tissulaire, comblant ainsi une lacune critique dans la recherche en immunologie de la reproduction. Cette approche facilite la détection mécanistique des hypothèses relatives au microenvironnement endométrial en fournissant des données de profilage immunitaire multiplexé avec une résolution spatiale directement issues d'échantillons provenant de patients. La méthode renforce la confiance prédictive dans les efforts de validation de cibles liés à l'échec d'implantation et aux fausses couches récurrentes en permettant une comparaison directe de la densité et du regroupement des cellules immunitaires entre les états fertiles et pathologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques impliquant des interactions entre cellules immunitaires dans l'endomètre grâce à la détection simultanée des marqueurs CD3, CD56, CD68 et CD20.
- Valeur opérationnelle : Réduit le besoin de sectionnement et de coloration en série, préservant ainsi des échantillons cliniques précieux tout en augmentant la densité de données par section tissulaire.
- Fiabilité prédictive : Fournit des paramètres quantitatifs et résolus spatialement des cellules immunitaires, soutenant la détection biologique des cibles impliquées dans la communication entre le système immunitaire et l'endomètre durant l'implantation.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des signaux fluorescents standardisés et reproductibles, adaptés aux plates-formes d’imagerie à haut contenu et aux flux de travail d’analyse d’image automatisée.
- Évolutivité : Compatible avec les biobanques de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), permettant l’analyse rétrospective de grands cohortes pour la découverte de biomarqueurs.
- Optimisation de la multiplexation : Réduit les interférences entre fluorophores par des cycles successifs de coloration et de décoloration, garantissant la spécificité du signal pour chaque marqueur de cellule immunitaire.
Recherche translationnelle et préclinique
- Système pertinent pour la maladie : Directement applicable aux biopsies endométriales humaines, fournissant un modèle cliniquement pertinent pour l'étude de la dysrégulation immunitaire dans les fausses couches récurrentes.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre le profilage immunitaire en phase de découverte et la validation préclinique en permettant un phénotypage immunitaire cohérent entre différents types d'échantillons.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet d'étudier les interactions entre cellules immunitaires médiées par les cytokines après l'identification initiale des types cellulaires, facilitant ainsi la validation ciblée au niveau des voies biologiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase de biologie de la découverte, en soutenant spécifiquement la validation des cibles immunitaires et les efforts de criblage phénotypique dans les programmes d'immunologie de la reproduction.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant la composition des cellules immunitaires et leur organisation spatiale dans l'endomètre pendant la fenêtre d'implantation.
- Dépistage : Génère des résultats quantitatifs d'immunofluorescence permettant de comparer les densités cellulaires et les profils de regroupement des cellules immunitaires selon différentes conditions expérimentales.
- Analytique : Fournit des données multiplexées sur l'intensité de fluorescence et la co-localisation, servant à la caractérisation phénotypique des cellules immunitaires et à l'inférence de leur état fonctionnel.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité entre l'analyse d'échantillons humains et les études mécanistiques ultérieures en proposant des marqueurs cellulaires immunitaires validés pour des tests fonctionnels en aval.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme d'immunomarquage réutilisable, applicable à de multiples études de profilage immunitaire dans l'endomètre et d'autres tissus.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en permettant une comparaison directe et multiplexée des populations de cellules immunitaires dans les tissus malades par rapport aux tissus contrôles.
- Valeur opérationnelle : Améliore l'efficacité des réactifs et réduit la variabilité grâce à des protocoles optimisés de coloration et de décoloration séquentielles sur des lames uniques.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon dans les thérapeutiques reproductives en précisant le rôle du microenvironnement immunitaire dans la réussite ou l'échec de l'implantation.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des cibles ajustée au risque, fondée sur la densité des cellules immunitaires, leur regroupement et leur corrélation spatiale avec les compartiments épithéliaux ou stromaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunohistochimie, en microscopie à fluorescence et en analyse d'images multispectrales pour une détection et une quantification précises des signaux.
- Dépend de l'accès à des systèmes de récupération d'antigènes par micro-ondes, à des scanners de lames compatibles fluorescence et à des kits de fluorophores Opal validés pour le cyclage multiplex.
- Exige une standardisation des conditions de blocage, d'incubation des anticorps et de décapage entre les laboratoires afin d'assurer la reproductibilité des résultats multiplex.
- Requiert l'adaptation des panels d'anticorps et des étapes de validation lors de l'application de la méthode à différents types de tissus ou à des marqueurs de cellules immunitaires autres que CD3, CD56, CD68 et CD20.
- Les limitations pratiques incluent le risque de recouvrement des fluorophores et la nécessité d'une séparation spectrale rigoureuse lors de l'acquisition d'images, ce qui est pris en compte par un décapage séquentiel et des réglages de filtres validés.
