Name: Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Découvrez comment induire des transitions de phase optogénétiques de TDP-43 dans les motoneurones spinaux de larves de poisson zèbre. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de dégénérescence motoneuronale liés à la SLA.

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Ce travail a été soutenu par SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numbers JP19K06933 (KA) et JP20H05345 (KA).

Tous les travaux sur les poissons ont été effectués conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (numéro d’identification d’approbation 24-2) de l’Institut national de génétique (Japon), qui a une assurance du bien-être animal dans ses dossiers (numéro d’assurance A5561-01) au Bureau du bien-être des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH, États-Unis).
1. Construction de CBC pour l’expression du gène optogénétique TDP-43 à partir du promoteur mnr2b
<ol><li>Préparation bac<ol>
<li>Achetez un clone BAC de poisson zèbre contenant le locus mnr2b du poisson-zèbre (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purifier l’ADN BAC d’une culture LB de 5 mL pendant la nuit d’Escherichia coli DH10B (E. coli) hébergeant CH211-172N16 comme décrit dans Warming et al.18.</li>
		<li>Transformer CH211-172N16 en cellules SW102 E. coli par électroporation, comme décrit dans Warming et al.18. REMARQUE: La purification de l’ADN BAC de L’E. coli le même jour d’électroporation donne généralement un taux de réussite plus élevé de la transformation BAC18. Sinon, l’ADN BAC purifié est maintenu à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
		<li>Introduisez la cassette iTol2-amp pour la transgénèse BAC médiée par transposon Tol219 dans l’épine dorsale du CH211-172N16 par électroporation, comme décrit dans Asakawa et al.20.<ol>
<li>Fabriquer un stock de glycérol des clones de cellules d’E. coli porteurs de CH211-172N16 avec l’intégration de cassette iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) après avoir confirmé l’intégration médiée par recombinaison homologue par réaction en chaîne par polymérase (PCR) (Ex Taq) en utilisant la paire d’amorces Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') et pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') et les conditions suivantes: une étape de dénaturation à 98 °C pendant 1 min, suivie de 25 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, d’un recuit d’apprêt à 55 °C pendant 15 s et d’une extension d’amorce à 72 °C pendant 1 min, amplifiant un produit PCR de 354 paires de bases (pb).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:opTDP-43h construction<ol>
<li>Construire un plasmide portant la cassette d’expression pour le TDP-43/TARDBP de type sauvage humain (TDP-43h) qui est marqué avec mRFP1 et CRY2olig aux termini N et C, respectivement (ci-après, opTDP-43h)14. REMARQUE: Le fragment opTDP-43h doit être flanqué de la séquence promotrice du gène hsp70l du poisson-zèbre (650 pb) et de la séquence de signal de polyadénylation (polyA), suivie d’un gène de résistance à la kanamycine (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.</li>
		<li>Amplifier la cassette hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan avec des amorces qui recuit hsp70l et Kan et contiennent des séquences de 45 bp de l’amont et de l’aval des codons initiateurs du gène mnr2b par PCR (GXL DNA Polymerase) en utilisant la paire d’amorces mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') et Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') avec les conditions suivantes : une étape de dénaturation à 98 °C pendant 1 min, suivie de 30 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, un recuit d’apprêt à 55 °C pendant 15 s et une extension d’apprêt à 68 °C pendant 30 s, amplification d’un produit PCR d’environ 5,7 pb.</li>
		<li>Séparez les produits pcR par électrophorèse sur gel d’agarose (100 V) et purifiez la bande d’ADN hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan avec une colonne d’ADN. Ajuster la concentration de la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan purifiée à 50 ng/μL dans un tampon Tris-EDTA (TE) contenant 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) et 1 mM d’EDTA.</li>
		<li>Introduire la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan dans CH211-172N16-iTol2A par électroporation comme décrit dans Warming et al.18 et sélectionner des transformants résistants à l’ampicilline et à la kanamycine sur des plaques de gélose LB. Ch211-172N16-iTol2A transportant la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan est désigné comme mnr2b-hs:opTDP-43h.</li>
		<li>Purifier mnr2b-hs:opTDP-43h à l’aide d’un kit de purification BAC et le dissoudre à 250 ng/μL dans TE après extraction phénol/chloroforme.</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:Construction EGFP-TDP-43z<ol>
<li>Construire un autre plasmide portant le tardbp de type sauvage du poisson-zèbre qui est marqué avec une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) à son terminus N (EGFP-TDP-43z) au lieu de opTDP-43h mais qui est par ailleurs identique à la construction hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Utilisez EGFP-TDP-43z comme contrôle interne pour la stimulation lumineuse de l’opTDP-43h.</li>
		<li>Construire CH211-172N16-iTol2A hébergeant la cassette hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan dans le locus mnr2b comme décrit dans 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A transportant la cassette hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan est désigné comme mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transgénèse BAC médiée par transposon Tol2 chez le poisson-zèbre
<ol><li>Préparer la solution injectable contenant 40 mM de KCl, du rouge phénol (10 % v/v), 25 ng/μL d’ADN mnr2b-hs:opTDP-43h et 25 ng/μL d’ARNm transposase Tol219.</li>
	<li>Injecter 1 nL de la solution injectable (une gouttelette d’un diamètre d’environ 123 μm calibrée dans de l’huile minérale) dans le cytosol d’embryons de poisson zèbre de type sauvage au stade unicellulaire. Dépister les poissons injectés pour la formation d’agrégats positifs de protéines fluorescentes rouges (RFP) dans divers tissus embryonnaires, y compris les motoneurones spinaux, sous un stéréomicroscope à fluorescence 2-3 jours après la fécondation (dpf). Élever le poisson rfP positif à l’âge adulte.</li>
	<li>Injecter l’ADN mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z comme décrit aux points 2.1 et 2.2. Élever les poissons POSITIFS À l’EGFP jusqu’à l’âge adulte.</li>
	<li>Après quelques mois, mettez les poissons injectés sexuellement matures et les poissons de type sauvage par paires dans des cages d’accouplement standard de 2 L pour obtenir une progéniture F1. Cribler les poissons F1 à 3 dpf pour la fluorescence RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) dans la colonne vertébrale motrice à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’une lentille d’objectif Plan-Neofluar 5x/0.15. En règle générale, un poisson fondateur est identifié à partir de 10 à 20 poissons injectés (le taux de transmission germinale est de 5% à 10%).</li>
	<li>Isolez et comparez plusieurs inserts Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] et Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de différents poissons fondateurs, car l’intensité, mais pas le motif, de l’expression opTDP-43h ou EGFP-TDP-43z peut varier d’un poisson fondateur à l’autre en raison des effets de position chromosomique.</li>
	<li>Croisez les lignées de poissons Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] et Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pour obtenir une progéniture contenant des poissons double transgéniques Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dans un rapport mendélien.</li>
	<li>Élever le poisson dans un plat en plastique contenant 30 mL de tampon E3 (5 mM naCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5 % de bleu de méthylène) et ajouter 0,003 % (p/v) de N-phénylthiourée à 8-10 h après la fécondation (HPF) pour inhiber la mélanogenèse.</li>
	<li>Couvrir le plat en plastique avec du papier d’aluminium après 30 hpf.</li>
</ol>3. Préparation de la LED pour l’éclairage de la lumière bleue
<ol><li>Allumez un panneau LED à l’aide de l’application associée installée sur une tablette/un téléphone. Placez la sonde d’un spectromètre dans un puits vide d’une antenne parabolique de 6 puits et ajustez la lumière LED à la longueur d’onde culminant à ~ 456 nm à travers l’application. Placez le capteur optique d’un capteur de puissance optique dans le puits vide et réglez la puissance de la lumière LED (~ 0,61 mW / cm2). Le réglage de la lumière LED peut être enregistré et peut être récupéré dans l’application.</li>
	<li>Introduisez le réglage du panneau plat/LED dans l’incubateur à 28 °C. Terminez cette étape avant que l’imagerie des poissons ne commence à 48 hpf.</li>
</ol>4. Imagerie de larves de poisson zèbre exprimant le TDP-43 optogénétique
<ol><li>Sélectionnez Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] poisson double transgénique au moins avant 47 hpf, basé sur la fluorescence RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) dans la colonne motrice spinale à l’aide de la configuration du microscope à épifluorescence décrite ci-dessus.</li>
	<li>Déchorionate le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].</li>
	<li>Préchauffer 1 % d’agarose à basse température de fusion contenant 250 μg/mL de sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate à 42 °C.</li>
	<li>Anesthésier brièvement le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] à 48 hpf dans le tampon E3 contenant la même concentration de Tricane.</li>
	<li>Mettez une goutte de l’agarose préchauffée à basse température de fusion de 1% sur le plat de base en verre à la température ambiante. Le diamètre de la goutte d’agarose en forme de dôme sur le plat en verre est de 8 à 10 mm.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter le poisson anesthésié à l’agarose à basse température de fusion sur le plat de base en verre, puis mélanger en pipetant plusieurs fois. Minimisez la quantité de tampon E3 ajoutée à l’agarose avec le poisson.</li>
	<li>Maintenez le poisson sur le côté en utilisant une aiguille de seringue pendant la solidification de l’agarose (généralement ~ 1 min) pour s’assurer que la moelle épinière est dans une position horizontale appropriée. Après la solidification, placez quelques gouttes de tampon E3 sur le poisson monté sur l’agarose en forme de dôme.</li>
	<li>Acquérir des sections z confocales en série de la moelle épinière en scannant avec un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20x avec l’ouverture numérique 1,00, en utilisant une vitesse de balayage de 4,0 μs par pixel (12 bits par pixel), une taille de pas de 1,0 μm par tranche pour l’objectif et une combinaison de longueurs d’onde d’excitation / émission: Canal 1) 473/510 nm pour EGFP et canal 2) 559/583 nm pour mRFP1. REMARQUE: Le cloaque sur la face ventrale du poisson est inclus dans les régions d’intérêt (ROI) comme référence, ce qui aide à identifier et à comparer les segments de la colonne vertébrale (niveaux 16-17) à travers les points temporels.</li>
	<li>Retirez le poisson de l’agarose en craquant soigneusement l’agarose avec une aiguille de seringue dès que l’imagerie est terminée. Gardez la durée pendant laquelle le poisson est incrusté dans l’agarose aussi courte que possible, bien que l’encastrement de l’agarose pendant <30 min n’affecte pas la viabilité du poisson.</li>
</ol>5. Stimulation lumineuse des poissons exprimant l’opTDP-43h par l’éclairage sur le terrain d’une diode électroluminescente bleue (LED)
<ol><li>Ajouter 7,5 mL de tampon E3 au puits et placer le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] imagé dans le puits. Placez la parabole à six puits sur le panneau LED en gardant la parabole et le panneau LED espacés de 5 mm avec une entretoise (par exemple, avec cinq verres coulissants empilés).</li>
	<li>Allumez le voyant LED bleu. Conservez une partie du poisson Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] à double transg dans un plat séparé de six puits recouvert de papier d’aluminium lorsque des poissons témoins non éclairés sont nécessaires (c.-à-d. dans des conditions sombres)14.</li>
	<li>Après l’éclairage (par exemple, pendant 24 h à 72 hpf sur la figure 3), imagez la moelle épinière du poisson illuminé en répétant les étapes 4.3 - 4.9.</li>
</ol>6. Visualisation de la relocalisation cytoplasmique du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux
<ol><li>Ouvrez le fichier image dans ImageJ/Fiji21 (Version: 2.1.0/1.53c), un programme de traitement d’image Java open-source développé par NIH Image, qui peut être téléchargé à partir de https://imagej.net/Fiji/Downloads.</li>
	<li>Utilisez la barre de défilement Z pour vous déplacer dans les plans focaux. Créez une projection d’intensité maximale de plusieurs tranches en cliquant sur Image | Piles | | de projet Z Intensité maximale et réglage Tranche de démarrage et tranche d’arrêt qui couvrent les hémisegments de la colonne motrice spinale.</li>
	<li>Divisez l’image multicanal en deux images monocanal en cliquant sur Image | | de couleur Fractionner les canaux.</li>
	<li>Améliorez le signal EGFP-TDP-43z pour vous assurer que l’EGFP-TDP-43z cytoplasmique est clairement visible en cliquant sur Image | Ajuster | Luminosité/Contraste et réglage minimum
</li>
	<li>Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Trouvez les cellules identifiables dans les deux images à 48 hpf et 72 hpf, en fonction des positions relatives des corps cellulaires. Définissez les ROI en décrivant les contours des corps cellulaires des motoneurones spinaux uniques visualisés par le signal EGFP-TDP-43z à l’aide de sélections à main levée, puis en cliquant sur Ajouter[t] dans le gestionnaire de retour sur investissement.</li>
	<li>Définissez un axe principal du soma en traçant une ligne droite à l’aide de Droite et en cliquant sur Analyser | Profil de tracé pour les images EGFP-TDP-43z (C1) et opTDP-43h (C2) à 48 et 72 chf.</li>
	<li>Normalisez le profil du tracé en divisant les valeurs par la valeur la plus élevée pour chaque signal EGFP-TDP-43z et opTDP-43h. Tracez les valeurs normalisées avec les coordonnées x-y, où x et y représentent l’axe principal des intensités fluorescentes soma et relatives, respectivement, à l’aide du graphique XY dans un logiciel statistique.</li>
</ol>7. Comparaison ratiométrique entre les signaux opTDP-43h et EGFP-TDP-43z à l’aide d’ImageJ/Fiji
<ol><li>Ouvrez le fichier image dans ImageJ/Fiji et définissez les retours sur investissement des cellules mnr2b positives uniques à l’aide d’une image de projection d’intensité maximale de EGFP-TDP-43z comme dans 6.1-6.5. Ajoutez un retour sur investissement à l’extérieur de la moelle épinière ventrale (par exemple, notochord) pour représenter le signal de fond (retour sur investissement d’arrière-plan).</li>
	<li>Pour chaque image EGFP-TDP-43z et opTDP-43, créez une projection de plusieurs tranches en cliquant sur Image | Piles | | de projet Z Additionnez les tranches et définissez la tranche Démarrer et la tranche Stop qui couvrent la colonne du moteur hémispinal.</li>
	<li>Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement créé avec l’image de projection d’intensité maximale. Affichez les retours sur investissement sur l’image Sum Slices en sélectionnant la fenêtre d’image pour EGFP-TDP-43z, puis en cliquant sur Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir des valeurs moyennes pour chaque retour sur investissement.</li>
	<li>Acquérir des valeurs moyennes pour opTDP-43h en suivant la même procédure que celle prévue à la section 7.3.</li>
	<li>Pour chaque ROI, après avoir soustrait la moyenne du ROI de fond, divisez la moyenne soustraite pour opTDP-43h par la moyenne soustraite pour EGFP-TDP-43z pour obtenir la valeur ratiométrique. Les valeurs ratiométriques peuvent être comparées entre différents points temporels et présentées à l’aide du graphique en colonnes dans le logiciel Prism.</li>
</ol>

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<li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925(2014).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li>
<li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605(2020).</li>
</ol>

KA et KK sont les inventeurs de la propriété intellectuelle décrite dans ce manuscrit et des brevets provisoires ont été déposés par l’Institut national de génétique.

L’expression médiée par mnr2b-BAC de l’opTDP-43h et de l’EGFP-TDP-43z chez le poisson-zèbre offre une occasion unique d’imagerie en direct de la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux. La transparence optique des tissus corporels des larves de poisson zèbre permet la stimulation optogénétique simple et non invasive de l’opTDP-43h. Les comparaisons entre les motoneurones spinaux uniques au fil du temps ont démontré que l’oligomérisation dépendante de la lumière de l’opTDP-43h provoque son regrou...

Les granules de ribonucléoprotéines (RNP) contrôlent une myriade d’activités cellulaires dans le noyau et le cytoplasme en assemblant des partitions sans membrane via la séparation de phase liquide-liquide (LLPS), un phénomène dans lequel un fluide homogène se décompose en deux phases liquides distinctes1,2. Le LLPS dérégulé des protéines de liaison à l’ARN qui fonctionnent normalement comme des composants de granules RNP favorise une transition de phase anormale, conduisant à l’agrégation des protéines. Ce processus a été impliqué dans les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives3,4,5. L’évaluation précise d’une relation causale entre le LLPS aberrant des protéines de liaison à l’ARN et la pathogenèse de la maladie est cruciale pour déterminer si et comment le LLPS peut être exploité comme cible thérapeutique efficace. Le LLPS des protéines de liaison à l’ARN est relativement facile à étudier in vitro et dans des modèles unicellulaires, mais est difficile dans les organismes multicellulaires, en particulier chez les vertébrés. Une exigence critique pour l’analyse d’un tel LLPS dans des cellules individuelles dans un environnement tissulaire est d’exprimer de manière stable une sonde pour l’imagerie et la manipulation du LLPS dans un type de cellule vulnérable à la maladie.
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un trouble neurologique finalement mortel dans lequel les motoneurones du cerveau et de la moelle épinière sont perdus sélectivement et progressivement en raison de la dégénérescence. À ce jour, des mutations dans plus de 25 gènes ont été associées à la forme héréditaire (ou familiale) de la SLA, qui représente 5 % à 10 % du total des cas de SLA, et certains de ces gènes causant la SLA codent pour des protéines de liaison à l’ARN constituées de RNI, telles que hnRNPA1, TDP-43 et FUS6,7. De plus, la forme sporadique de la SLA, qui représente 90% à 95% du total des cas de SLA, est caractérisée par l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 déposée dans les motoneurones en dégénérescence. Une caractéristique majeure de ces protéines de liaison à l’ARN associées à la SLA est leurs régions intrinsèquement désordonnées (IDR) ou domaines de faible complexité qui manquent de structures tridimensionnelles ordonnées et interviennent dans de faibles interactions protéine-protéine avec de nombreuses protéines différentes qui conduisent LLPS7,8. Le fait que des mutations causant la SLA se produisent souvent dans les IDR a conduit à l’idée que le LLP aberrant et la transition de phase de ces protéines liées à la SLA peuvent sous-tendre la pathogenèse de la SLA9,10.
Récemment, la méthode optoDroplet, une technique optogénétique basée sur Cryptochrome 2 qui permet la modulation des interactions protéine-protéine par la lumière, a été développée pour induire la transition de phase des protéines avec IDRs11. Comme cette technique a été étendue avec succès au TDP-43, elle a commencé à découvrir les mécanismes sous-jacents à la transition de phase pathologique du TDP-43 et sa cytotoxicité associée12,13,14,15. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode génétique pour délivrer un TDP-43 optogénétique aux types de cellules vulnérables à la SLA, à savoir les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre en utilisant le BAC pour le gène mnr2b / mnx2b codant pour une protéine homéodomaine pour la spécification des motoneurones16,17. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet une stimulation lumineuse simple et non invasive du TDP-43 optogénétique qui déclenche sa transition de phase dans les motoneurones spinaux. Nous présentons également un flux de travail de base pour l’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et l’analyse d’images à l’aide du logiciel Fidji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à la stimulation lumineuse. Ces méthodes permettent d’étudier la transition de phase du TDP-43 dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA et devraient aider à explorer ses conséquences pathologiques aux niveaux cellulaire et comportemental.

<table><tbody><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence</td><td>ZEISS</td><td>Axioimager Z1</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope à fluorescence</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Plat à base en verre</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>MEE</td><td>CN-25C</td><td></td></tr><tr><td>Panneau LED</td><td>Nanoleaf Limited</td><td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus</td><td>TAKARA</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond BAC100</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>LONZA</td><td>50181</td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFL N 20&times ;/1.00</td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>ZEISS</td><td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td><td></td></tr><tr><td>Capteur de puissance optique</td><td>HIOKI</td><td>3664</td><td></td></tr><tr><td>Capteur optique</td><td>HIOKI</td><td>9742-10</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rouge de phénol 0,5</td> %<td>Merck</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td><td>TAKARA</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Plat à six puits</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Sonde spectromètre BLUE-Wave</td><td>StellerNet Inc.</td><td>VIS-50</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de seringue</td><td>TERUMO</td><td>NN-2725R</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Tricane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td><td>BACPAC Genomics</td><td>CH211-172N16</td><td></td></tr></tbody></table>

transition de phase optogénétique du tdp-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

L’agrégation anormale des protéines et la vulnérabilité neuronale sélective sont deux caractéristiques majeures des maladies neurodégénératives. Les relations causales entre ces caractéristiques peuvent être interrogées en contrôlant la transition de phase d’une protéine associée à la maladie dans un type de cellule vulnérable, bien que cette approche expérimentale ait été limitée jusqu’à présent. Ici, nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine de liaison ARN/ADN TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre pour modéliser l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 se produisant dans les motoneurones en dégénérescence dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons une méthode génétique basée sur le chromosome artificiel bactérien (BAC) pour administrer une variante optogénétique du TDP-43 de manière sélective aux motoneurones spinaux du poisson-zèbre. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet la transition de phase du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux par un simple éclairage externe à l’aide d’une diode électroluminescente (LED) contre les poissons non retenus. Nous présentons également un flux de travail de base d’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et d’analyse d’images avec le logiciel Fiji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à l’éclairage lumineux. Ce protocole permet de caractériser la transition de phase du TDP-43 et la formation d’agrégats dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA, ce qui devrait faciliter l’étude de ses conséquences cellulaires et comportementales.

Imagerie en direct des protéines TDP-43 optogénétiques et non optogénétiques dans les motoneurones rachidiens mnr2b+ des larves de poisson zèbre Pour induire la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre, un TDP-43h humain marqué avec mRFP1 et CRY2olig22 aux N- et C-termini, respectivement, a été construit et désigné comme opTDP-43h14 (Figure 1A)...

Nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine 43 de liaison à l’ADN TAR (TDP-43) par la lumière dans les motoneurones de la colonne vertébrale en utilisant le poisson-zèbre comme modèle.

Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Ce protocole nous permet donc d’induire des transitions de phase pathologiques du TDP-43 et d’aborder leurs conséquences cellulaires dans les motoneurones spinaux in vivo, ce qui est pertinent pour comprendre pourquoi les motoneurones dégénèrent dans la SLA. En raison de la grande transparence des larves de poisson zèbre, les motoneurones de la moelle épinière sont directement visibles. Ainsi, on peut visualiser le comportement dynamique du TDP-43 subissant des transitions de phase dans les motoneurones spinaux simples.Cette méthode offre un nouveau modèle animal de la SLA. Nous croyons que toute méthode qui peut empêcher la transition de phase et l’agrégation du TDP-43 induites par la lumière dans ce modèle de SLA peut être un candidat potentiel pour le traitement de la SLA. D’autres protéines liées à la SLA avec des régions intrinsèquement désordonnées peuvent être exprimées pour explorer la neurotoxicité associée aux transitions de phase anormales.La clé du succès de cette approche est d’exprimer le TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux au niveau non toxique. La transgénèse BAC est une étape qui prend beaucoup de temps, mais une fois que vous créez un poisson transgénique approprié, les étapes suivantes sont relativement plus faciles et directes. Pour commencer, allumez la diode électroluminescente, ou panneau LED, à l’aide de l’application associée installée sur une tablette ou un téléphone.Ensuite, placez la sonde du spectromètre dans un puits vide d’une antenne parabolique de 6 puits. Ensuite, à l’aide de l’application, ajustez la lumière LED à une longueur d’onde culminant à 456 nm. Placez le capteur optique d’un capteur de puissance optique dans le puits vide et réglez la puissance de la lumière LED.Placez ensuite le plat avec le réglage du panneau LED dans un incubateur à 28 C.Pour l’imagerie des larves de poisson zèbre exprimant le TDP-43 optogénétique, déchorionatez les poissons à double transgénique et anesthésiez-les dans un tampon E3 contenant 250 g / mL de Tricane. Ensuite, préchauffer 1% d’agarose à basse température de fusion contenant 250 g / mL de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate à 42 C.Ensuite, mettez une goutte d’agarose sur le plat de base en verre. Le diamètre de la goutte d’agarose en forme de dôme sur le plat en verre doit être de 8 à 10 mm.Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez le poisson anesthésié à l’agarose sur le plat à base de verre. Minimisez la quantité de tampon E3 ajoutée à l’agarose avec le poisson. Ensuite, mélangez en pipetant plusieurs fois.Pendant la solidification de l’agarose, maintenez le poisson sur le côté à l’aide d’une aiguille de seringue, de sorte que la moelle épinière soit dans une position horizontale appropriée. Une fois l’agarose solidifiée, ajoutez quelques gouttes de tampon E3 sur le poisson monté sur l’agarose en forme de dôme. À l’aide d’un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20 fois, acquérir des sections Z confocales en série de la moelle épinière.Inclure le cloaque sur la face ventrale du poisson dans les régions d’intérêt comme référence pour identifier et comparer les segments de la colonne vertébrale à travers les points temporels. Dès que l’imagerie est terminée, utilisez une aiguille de seringue pour casser soigneusement l’agarose et retirer le poisson de l’agarose. Gardez la durée pendant laquelle le poisson est incrusté dans l’agarose aussi courte que possible, bien que l’incorporation de l’agarose pendant moins de 30 minutes n’affecte pas la viabilité du poisson.Ajoutez 7,5 mL de tampon E3 à un puits d’un plat à 6 puits et placez le poisson double transgénique imagé dans ce puits. Ensuite, placez le plat sur le panneau LED, en gardant le parabole et le panneau LED à 5 mm l’un de l’autre avec une entretoise, puis allumez la lumière LED bleue. Conservez du poisson à double transgénique dans un plat séparé de 6 puits recouvert de papier d’aluminium pour les poissons témoins non éclairés.Après le temps d’éclairage souhaité, imagez la moelle épinière du poisson illuminé comme démontré précédemment. La relocalisation cytoplasmique de l’opTDP-43h dans les motoneurones spinaux simples a été visualisée en séparant les images de la série z acquises à 48. et 72 heures après la fertilisation dans chaque canal EGFP-TDP-43z et opTDP-43h.À partir d’images de projection d’intensité maximale de l’EGFP-TDP-43z, un seul neurone spinal isolé identifiable aux deux 48. et 72 heures après la fécondation ont été sélectionnées. Les régions d’intérêt couvrant les somas des motoneurones ont été définies en traçant le bord du signal EGFP à 48.et 72 heures après la fécondation. L’intensité fluorescente normalisée le long de l’axe principal du soma a été tracée. Et 48 heures après la fécondation, les modèles des deux signaux se chevauchaient largement.En revanche, à 72 heures, le pic du signal opTDP-43h a été trouvé dans la région où le signal EGFP-TDP-43z était faible, indiquant la relocalisation cytoplasmique de l’opTDP-43h. Pour quantifier les signaux opTDP-43h et EGFP-TDP-43z avant et après la stimulation de la lumière bleue, des images de projection en tranches pour chaque canal des mêmes images de la série Z ont été produites à 48. et 72 heures après la fécondation.Sur les quatre cellules mnr2b+ étudiées, la cellule 1 présentait notamment un signal EGFP-TDP-43z saturé. Les quantités relatives d’opTDP-43h à EGFP-TDP-43z ont été calculées en divisant la valeur de la demande de propositions par la valeur de la BPF. Les cellules 2 à 4 affichaient des niveaux d’opTDP-43h décroissants après éclairage de lumière bleue.Il est important de minimiser le temps pendant lequel les poissons sont incrustés dans l’agarose pour les garder en bonne santé. En ajustant l’intensité et la durée de l’éclairage LED, nous contrôlons la transition de phase TDP-43 de manière régulée temporaire, ce qui peut aider à disséquer la progression de la transition de phase pathologique TDP-43 dans le motoneurone.

optogenetic-phase-transition-tdp-43-spinal-motor-neurons-zebrafish

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Cette vidéo décrit des techniques optogénétiques en activant des neurones somatosensoriels génétiquement modifiés et en enregistrant la réponse comportementale provoquée à l’aide d’une caméra vidéo à haute vitesse.

Optogénétique du poisson-zèbre : activation des neurones somatosensoriels génétiquement modifiés pour étudier les réponses comportementales des larves

Dans cette vidéo, nous décrivons un test de séparation de phase, dans lequel des protéines intracellulaires comprenant des régions intrinsèquement désordonnées fusionnées à un domaine d’oligomérisation photosensible sont induites par l’exposition à la lumière bleue à s’auto-associer en condensats liquides sans membrane.

Essai de séparation de phase des protéines : une méthode optogénétique pour la séparation de phase des protéines de liaison à l’ARN mutant dans les motoneurones spinaux des larves de poisson-zèbre

Cette vidéo présente un test non invasif pour étudier l’électrophysiologie des motoneurones chez des embryons de poisson-zèbre. Lors de la mesure de l’enroulement de la queue chez les embryons à la suite d’une dépolarisation spontanée des motoneurones de la moelle épinière, un bloqueur des canaux sodiques est appliqué pour réduire la fréquence d’enroulement. Ensuite, les embryons sont immobilisés dans de l’agarose et placés sous un microscope à fluorescence. Les motoneurones génétiquement...

Une approche non invasive pour étudier l’électrophysiologie des motoneurones chez les embryons de poisson-zèbre

Optogenetic techniques ont permis d'étudier la contribution des neurones spécifiques de comportement. Nous décrivons une méthode larvaire chez le poisson zèbre pour l'activation de simples neurones somatosensoriels exprimant une variante channelrhodopsin (Chef) avec un pompé par diode à l'état solide (DPSS) laser et d'enregistrer les comportements suscité avec une caméra vidéo à grande vitesse.

L&#39;activation des neurones somatosensoriels optogenetic poisson zèbre en utilisant Chef-tdTomato

Les protocoles décrits ici permettent d’étudier les propriétés électriques des cellules excitables dans les conditions physiologiques les moins invasives en utilisant des embryons de poisson-zèbre dans un système in vivo associés à un indicateur de tension génétiquement codé (GEVI) basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) exprimé sélectivement dans le type de cellule d’intérêt.

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

Ce manuscrit décrit les méthodes pour les enregistrements électrophysiologiques de neurones spinaux des embryons de poisson zèbre et les larves. La préparation maintient les neurones in situ et implique souvent la dissection minimum. Ces méthodes permettent l'étude électrophysiologique d'une variété de neurones de la colonne vertébrale, de l'acquisition de l'excitabilité électrique initiale dans les premiers stades larvaires.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

L’optogénétique est un outil puissant avec de nombreuses applications. Ce protocole montre comment obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue.

Expression de GFP induite par la lumière dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide du système optogénétique TAEL/C120

La manipulation optogénétique des voies de signalisation peut être une stratégie puissante pour étudier comment la signalisation est décodée dans le développement, la régénération, l’homéostasie et la maladie. Ce protocole fournit des directives pratiques pour l’utilisation d’activateurs de signalisation nodaux et de protéines morphogéniques osseuses (BMP) basés sur le domaine de détection lumière-oxygène-tension dans l’embryon précoce du poisson-zèbre.

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Ce protocole établit un paradigme de phénotypage comportemental chez les larves de poisson-zèbre traitées par MPTP afin d’évaluer les déficits moteurs et non moteurs similaires à la maladie de Parkinson.

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Découvrez comment induire des transitions de phase optogénétiques de TDP-43 dans les motoneurones spinaux de larves de poisson zèbre. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de dégénérescence motoneuronale liés à la SLA.

Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre

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