Name: Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Découvrez l'hybridation in situ multiplex pour visualiser l'expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagaux de souris. Cette méthode permet de cartographier les profils transcriptionnels avec une haute sensibilité.

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Ce travail a été soutenu par le Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financé par la subvention des NIH #5P01DK119130-02. Les auteurs tiennent à remercier l’UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (dirigé par le Dr Phelps) et son personnel (Abhijit Bugde et Marcel Mettlen), soutenus en partie par la subvention des NIH #1S10OD021684-01, une ressource partagée du Harold C. Simmons Cancer Center, soutenue en partie par une subvention de soutien du NCI Cancer Center, P30 CA142543.

REMARQUE: Les souris utilisées dans cette étude étaient des mâles de type sauvage sur un fond pur C57BL / 6J. Au total, 4 souris ont été utilisées pour le multiplex ISH. Toutes les souris avaient environ 8 semaines au moment du sacrifice. Une souris mâle (âgée d’environ un an) a également été utilisée pour démontrer une fluorescence endogène associée au vieillissement. Les animaux étaient logés dans des cages ventilées à l’intérieur d’une installation de barrière avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical UT Southwestern a examiné et approuvé les procédures décrites ci-dessous. Des détails sur les réactifs et les outils peuvent être trouvés dans le tableau des matériaux.
1. Prélèvement d’échantillons
<ol><li>Le jour du sacrifice, administrer une surdose d’hydrate de chloral (500 mg / kg, i.p.) aux souris. Perfuser les souris profondément anesthésiées de manière transcardique à l’aide d’une pompe péristaltique avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de 50 mL de formol à 10% à température ambiante. REMARQUE: Ceci est fait dans une hotte pour empêcher l’inhalation de formol.</li>
	<li>Comme les ganglions nodoses, pétrosaux et jugulaires sont fusionnés pour former une seule masse ganglionnaire chez la souris15,collectez soigneusement toute la masse ganglionnaire vagale de chaque côté (gauche et droite) à l’aide d’une lunette de dissection et de fines ciseaux et pinces à ressort (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Lorsque vous décapitez la souris avec une paire de gros ciseaux (voir la Table des matériaux),évitez d’écraser le tronc cérébral.</li>
	<li>Suite à une approche de dissection décrite précédemment chez le rat40,retirer les muscles sternohyoïdes et omohyoïdes latéralement à la trachée avec de petites pinces (Table des matériaux) pour exposer l’os occipital. Nettoyez toute la région du muscle, du tissu adipeux et du tissu conjonctif jusqu’à ce que l’artère carotide, le nerf vague, le nerf hypoglosse et le foramen magnum soient visibles. Couper tout le nerf hypoglosse avec de petits ciseaux à ressort (Table des matériaux).</li>
	<li>Recherchez le ganglion nodosé comme une masse translucide proche du foramen magnum15. À l’aide de petits ciseaux (Table des matériaux), cassez soigneusement l’os occipital pour exposer davantage le ganglion jugulaire. Recherchez les mélanocytes noirs à la surface de la jugulaire comme point de repère visuel.</li>
	<li>Couper les attaches nerveuses entre la masse ganglionnaire vagale et extraire toute la masse ganglionnaire en tirant doucement sur l’extrémité périphérique du nerf vague tout en coupant simultanément le ganglion jugulaire vers le tronc cérébral avec de petits ciseaux à ressort (Table des matériaux).</li>
	<li>Enlevez le tissu conjonctif et la graisse collant au nerf vague et à la masse ganglionnaire autant que possible.</li>
	<li>Comme il est facile de perdre un ganglion lors du transfert d’un tube à l’autre, gardez ~ 0,5 cm du nerf vague pour faciliter la manipulation et la localisation des échantillons.</li>
	<li>Placer les ganglions à l’aide de pinces fines dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et incuber à 4 °C dans du formol pendant 24 h et avec 30 % de saccharose pendant encore 24 h.</li>
	<li>Positionnez les ganglions à l’intérieur d’une petite goutte (~4 mm Ø) de température de coupe optimale (OCT) sur un morceau de papier d’aluminium. Ensuite, congelez l’échantillon sur un lit de glace carbonique.</li>
	<li>Découpez les échantillons avec un cryostat à -20 °C en sections de 14 μm d’épaisseur et collectez sur des lames de microscope en verre à 3 séries espacées de 42 μm. REMARQUE : Évitez de placer des sections près des bords de la diapositive. Pour économiser les réactifs, gardez les sections de tissu aussi serrées que possible, mais sans chevauchement.</li>
	<li>Conservez les échantillons dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires pour l’ISH pendant au moins 6 mois. REMARQUE : Reportez-vous à la Figure 1 pour le dépannage de la fluorescence endogène.</li>
</ol>2. Prétraitement et ISH
<ol><li>Avant le jour des expériences, la verrerie de laboratoire en autoclave à utiliser pour l’ISH, y compris la coloration de la vaisselle et le lavage des pots tampons. REMARQUE: Bien que travailler dans des conditions sans RNase ne soit pas critique, portez des gants en tout temps. Gardez les flacons de solution de décontamination de la RNase (Table des matériaux) à portée de main en cas de suspicion de contamination.</li>
	<li>Le premier jour, amenez les toboggans à température ambiante sur un banc spécifiquement dédié à l’ISH. Rincez les lames dans 1x PBS et faites-les cuire pendant 30 minutes à 60 °C dans un four à pâtisserie(Table des matériaux).</li>
	<li>Post-fixer les lames dans du formol à 4% pendant 15 min à 4 °C.</li>
	<li>Amenez les réactifs dans le kit multiplex(Table des matériaux)à température ambiante.</li>
	<li>Déshydratez les lames en 50%, 70% et 100% d’éthanol pendant 5 min chacune. Appliquer la solution H2O2 sur les échantillons pendant 10 min, puis rincer à l’eau double distillée (ddH2O).</li>
	<li>Traiter les échantillons avec le réactif de récupération cible pendant 5 min, rincer dans du ddH2O suivi d’éthanol à 100 % et sécher à l’air. À l’aide d’un stylo hydrophobe, créez une barrière autour des échantillons. REMARQUE: N’appliquez pas la barrière hydrophobe trop près des sections de tissu.</li>
	<li>Appliquer la protéase pendant 30 min à 40 °C dans un four d’hybridation (Table des matériaux).</li>
	<li>En attendant, préchauffer les sondes à 40 °C et les refroidir à température ambiante avant utilisation. Incuber les lames avec la combinaison souhaitée de sondes cibles (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; ou Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) pendant 2 h à 40 °C dans un four d’hybridation.</li>
	<li>Incuber le tissu témoin négatif avec la sonde C1 cible de la dihydrodipicolinate réductase (DapB) pendant 2 h à 40 °C dans un four d’hybridation.</li>
	<li>Rincez les lames dans un tampon de lavage et conservez-les pendant la nuit dans 5x le citrate de sodium salin (SSC) à température ambiante. Pour plus de commodité, divisez l’expérience en deux jours. Le lendemain, rincez les lames avec un tampon de lavage et incuvrez-les avec des réactifs d’amplification énumérés ci-dessous (voir le manuel d’utilisation dans le tableau des matériaux).</li>
	<li>Appliquer AMP1 (30 min à 40 °C), AMP2 (30 min à 40 °C) et AMP 3 (15 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.</li>
	<li>Dissoudre chaque colorant opale(Table des matériaux)dans du sulfoxyde de diméthyle et conserver les solutions à 4 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.</li>
	<li>Pour le canal 1, incuber les lames avec HRP-C1 (15 min à 40 °C) et Opal 520 (couleur verte ; dilution 1/1 500 ; 30 minutes à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.</li>
	<li>Pour le canal 2, incuber les lames avec HRP-C2 (15 min à 40 °C) et Opal 570 (couleur jaune ; dilution 1/1 500 ; pendant 30 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.</li>
	<li>Pour le canal 3, incuber les lames avec HRP-C3 (15 min à 40 °C) et Opal 690 (couleur rouge foncé ; dilution 1/1 500 ; pendant 30 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.</li>
	<li>Lavez les lames et exposez-les au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 30 s.</li>
	<li>Appliquez immédiatement le support de montage sur chaque lame et placez un couvercle sur la section de tissu.</li>
	<li>Gardez les tissus à l’horizontale dans un porte-lames à 4 °C jusqu’à l’imagerie.</li>
</ol>3. Microscopie et analyse de données
REMARQUE: Les données ISH multiplex peuvent être imagées avec une large gamme d’instruments avec les filtres appropriés. Cependant, une méthode d’imagerie préférée est la microscopie confocale avec des objectifs 20x et 63x (huile); se référer à la discussion pour les raisons. Reportez-vous à la Figure 2 pour déterminer le rapport signal/bruit optimal.
<ol><li>Utilisez un microscope confocal équipé de lignes laser de 488, 561 et 633 nm. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants (voir tableau 1): Opale 690 (HeNe 633 nm, plage de détection 668-696 nm, puissance 2,0, gain 724) ; Opal 570 (laser DPSS 561 nm, plage de détection 579-627 nm, puissance < 15,0, <gain 450); Opal 520 (laser argon 488 nm, plage de détection 499-535 nm, puissance < 6.0, <gain 830); DAPI (laser à diode 405, plage de détection 415-502 nm, <puissance 12.0, <gain 532).</li>
	<li>Pour améliorer la qualité des images, acquérez avec une moyenne de ligne de 4 et une taille de pixel d’au moins 1024 x 1024. REMARQUE: Les paramètres ci-dessus ne sont fournis qu’à titre d’exemple, et des modifications sont recommandées en fonction d’un instrument, du grossissement (20x ou 63x), des niveaux d’expression et des niveaux endogènes de fluorescence pour un tissu donné.</li>
	<li>Une fois satisfait des paramètres d’acquisition, collectez les images en utilisant les mêmes paramètres. Attribuez de fausses couleurs à chaque canal pour faciliter la visualisation. REMARQUE: Par exemple, rouge (Phox2b ou Prdm12), cyan (Cck1r), jaune (Ghsr) et gris (DAPI).</li>
	<li>Effectuez le comptage cellulaire à l’aide des images numériques en identifiant le contour des profils RNAscope-positif avec un noyau légèrement coloré avec DAPI. Calculer le pourcentage de profils RNAscope-positifs exprimant chaque transcription [Figure 3A-C].</li>
	<li>Pour améliorer la rigueur et la précision des estimations, comptez au moins 2 000 profils neuronaux d’au moins 4 animaux différents. Effectuez le comptage des ganglions gauche et droit séparément.</li>
	<li>Entrez les données dans un graphique à secteurs avec le nombre total de profils comptés.</li>
	<li>Utilisez un logiciel d’imagerie pour acquérir des images et assembler des images 20x. Utilisez ImageJ-Fiji et un autre logiciel de photo et de conception pour générer les plaques finales. Appliquez des réglages de contraste et de luminosité uniformément à toutes les images.</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La technique de l’ISH a été inventée à la fin des années 196042. Cependant, ce n’est qu’au milieu des années 1980 qu’il a été appliqué pour la détection des ARNm dans les systèmes nerveux central et périphérique43,44. Compte tenu de l’hétérogénéité du système nerveux et des problèmes récurrents avec les anticorps, la localisation d’un transcrit particulier au niveau cellulaire reste un outil inestimable. Néanmoins, les méthodes ish traditi...

Les corps cellulaires des afférences vagales sont contenus dans les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses1,2,3. Leurs axones voyagent ensemble via plusieurs branches du nerf vague vers les territoires craniocervicaux, thoraciques et abdominaux4,5,6,7. À partir de leurs terminaisons viscérales, les afférences vagales peuvent répondre à un large éventail de stimuli physiologiques et nocifs8,9,10. Cependant, la distribution des molécules de signalisation et des récepteurs impliqués dans la détection vagale reste mal caractérisée. C’est en partie parce que les ganglions vagales, malgré leur petite taille, expriment un large spectre de récepteurs, y compris un grand nombre de RCPG8,11,12,13. De plus, les neurones afférents vagals sont intrinsèquement hétérogènes et présentent des profils moléculaires distincts14. Pour compliquer la question, les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses sont attachés dans la souris, formant ainsi une seule masse ganglionnaire. Enfin, chez un sous-ensemble d’animaux, le ganglion nodosé est attaché au ganglion cervical supérieur sympathique15.
Dans le passé, les chercheurs se sont tournés vers l’immunohistochimie pour étudier la composition neurochimique des neurones afférentsvagals 16,17,18. Bien que l’immunohistochimie utilisant des anticorps validés soit utile, les résultats des études immunohistochimiques doivent être interprétés avec prudence. Par exemple, de nombreux efforts pour identifier des anticorps spécifiques contre les RCPG ont échoué19,20,21,22,23,24,25, ce qui a conduit les chercheurs à conclure que la majorité des anticorps contre les RCPG ne sont pas fiables. Pour contourner ces problèmes, la PCR quantitative (qPCR) a été largement utilisée pour évaluer l’expression des gènes dans la masse ganglionnaire vagale du rongeur26,27,28,29. Cependant, l’examen de l’expression des gènes à l’aide de la qPCR se fait au prix d’une perte d’information spatiale. En particulier, il est impossible de prédire combien de cellules ou quel(s) type(s) cellulaire(s) expriment un gène particulier d’intérêt (p. ex., nodose vs cellules jugulaires). Les problèmes récurrents comprennent également la contamination par les tissus adjacents et l’inclusion de longueurs variables du nerf vague, des ganglions cervicaux supérieurs et jugulaires pendant la dissection15. En raison des difficultés ci-dessus, la controverse entoure l’expression et la distribution de plusieurs RCPG dans les neurones afférents vagals. Un exemple particulièrement déroutant concerne le récepteur de la ghréline (Ghsr). Alors que certaines études ont trouvé une expression répandue de ce récepteur dans les neurones afférents vagaux30,31,32, d’autres ont trouvé que l’ARNm Ghsr était presque indétectable dans le ganglion nodosé11,14. Une cartographie détaillée de l’ARNm Ghsr dans la masse ganglionnaire vagale est donc justifiée.
L’hybridation in situ (ISH) a également été utilisée pour évaluer les modèles d’expression génique dans la masse ganglionnaire vagale7,11,12,33,34,35. Parce que les techniques à base d’ARN restent plus fiables et spécifiques que les techniques à base d’anticorps dans la plupart des circonstances36,37, les études ISH se sont avérées précieuses pour une meilleure compréhension du codage neurochimique des neurones afférents vagal. Néanmoins, les techniques ISH traditionnelles elles-mêmes ne sont pas sans réserves. L’ISH radioactif est sensible mais génère un fond et reste encombrant38. L’ISH non radioactif est moins compliqué mais aussi moins sensible38. En revanche, la méthode RNAscope ISH récemment développée est très sensible et génère un arrière-plan minimal39. La présente étude a appliqué un ARN fluorescent multiplex à la détection de RCPG dans les neurones afférents vagaux de la souris. Nous nous sommes concentrés sur la cartographie de la distribution de Ghsr et avons comparé sa distribution à celle du récepteur de la cholécystokinine (Cck1r), un autre RCPG bien connu pour être exprimé dans le ganglion nodostique34. Enfin, les deux facteurs de transcription, l’homéobox 2b de type apparié (Phox2b) et la protéine de doigt de zinc du domaine PR 12 (Prdm12), ont été utilisés comme marqueurs sélectifs pour les neurones nodose et afférent jugulaire, respectivement14. Sans visualiser Phox2b ou Prdm12, il serait difficile d’identifier avec certitude les afférences jugulaires par rapport aux nodoses. Les pièges techniques potentiels sont également discutés tout au long de l’article.

<table><tbody><tr><td>10x</td><td>PBS Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763-80</td><td></td></tr><tr><td>&deg ; C congélateur</td><td>PHCBI</td><td>MDF-DU901VHA-PA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 2021</td><td>Logiciel de photo et de conception</td><td>Adobe</td><td></td></tr><tr><td>Four de cuisson</td><td>Thermo Scientific</td><td>Modèle :658</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM880 Airyscan</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>2460-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince</td><td>F.S.T.</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecomount</td><td>Biocare Medical</td><td>EM 897L</td><td>support de montage</td></tr><tr><td>HybEZ four</td><td></td><td></td><td>d’hybridation four</td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grands ciseaux</td><td>Henry Schein</td><td>100-7561</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubes à centrifuger</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>Minipump débit variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Opal 520</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1487001KT</td><td>Biomarqueur fluorescent</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1488001KT</td><td>Biomarqueur fluorescent</td></tr><tr><td>Opal 690</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1497001KT</td><td>Biomarqueur fluorescent</td></tr><tr><td>ProLong Gold Support de</td><td></td><td></td> montage anti-effusion <td>pour cellules marquées par fluorescence</td></tr><tr><td>RNAscope Kit de réactifs fluorescents multiplex v2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>323100</td><td>Kit multiplex</td></tr><tr><td>Sonde RNAscope Souris Cck1r-C3</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>313751-C3</td><td></td></tr><tr><td>Sonde RNAscope Souris DapB</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>310043</td><td></td></tr><tr><td>Sonde RNAscope Souris Ghsr</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td></td><td></td>426141</tr><tr><td>Sonde RNAscope Souris Phox2b-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>407861-C2</td><td></td></tr><tr><td>Sonde RNAscope Souris Prdm12-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>524371-C2</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Rnase solution décontaminante</td></tr><tr><td>Petits ciseaux de dissection</td><td>Lames Millipore Sigma</td><td>Z265977</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek OCT medium</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Mode d’emploi</td><td>ACD</td><td>323100 USM</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Ciseaux à ressort</td><td>Roboz</td><td>RS 5620</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Logiciel d’imagerie</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines g dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Cette étude décrit un protocole pour l’hybridation multiplex in situ (ISH) des ganglions jugulaires-noduoses de souris, avec un accent particulier sur la détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les ganglions jugulaires-noduoses fixés au formol ont été traités avec la technologie RNAscope pour détecter simultanément l’expression de deux RCPG représentatifs (récepteurs de la cholécystokinine et de la ghréline) en combinaison avec un gène marqueur de nodose (homéobox appariée 2b, Phox2b) ou de neurones afférents jugulaires (protéine de doigt de zinc du domaine PR 12, Prdm12). Les ganglions marqués ont été imagés à l’aide de la microscopie confocale pour déterminer la distribution et les modèles d’expression des transcriptions susmentionnées. En bref, les neurones afférents de Phox2b ont été trouvés pour exprimer abondamment le récepteur de la cholécystokinine (Cck1r) mais pas le récepteur de la ghréline (Ghsr). Un petit sous-ensemble de neurones afférents Prdm12 a également été trouvé pour exprimer Ghsr et / ou Cck1r. Les mises en garde techniques potentielles dans la conception, le traitement et l’interprétation du multiplex ISH sont discutées. L’approche décrite dans cet article peut aider les scientifiques à générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.

Bien que RNAScope puisse être appliqué à des animaux de tout âge, sexe ou bagage génétique, il est conseillé de travailler avec de jeunes adultes (&lt;3 mois). En effet, les artefacts fluorescents (par exemple, la lipofuscine) sont des résultats courants dans les neurones d’animaux plus âgés41. Les ganglions fixés au formol de souris plus âgées contiennent souvent une fluorescence endogène étonnamment intense qui peut facilement être confondue avec une véritable coloration(Fig...

L’hybridation multiplex in situ (ISH) a été utilisée pour visualiser simultanément les transcriptions de deux récepteurs couplés à la protéine G et d’un facteur de transcription dans l’ensemble du complexe ganglionnaire vagal de la souris adulte. Ce protocole pourrait être utilisé pour générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.

Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Cette procédure est très sensible et permet une visualisation de plusieurs transcriptions avec un minimum d’arrière-plan. Cette méthode permet de générer des cartes précises du profil transcriptionnel de types cellulaires très hétérogènes. La démonstration de la procédure sera faite par moi et Johnson Bob-manuel, un technicien de recherche au laboratoire.Commencez par collecter toute la masse ganglionnaire vagale de la souris âgée de huit semaines de chaque côté, à l’aide d’une lunette de dissection et d’instruments chirurgicaux. Après la décapitation de la souris, utilisez une petite pince pour enlever les muscles sternohyoïdes et omohyoïdes latéralement à la trachée pour exposer l’os occipital. Nettoyez toute la région des muscles et des tissus jusqu’à ce que l’artère carotide, le nerf vague et hypoglosse et le foramen magnum soient visibles.Ensuite, coupez tout le nerf hypoglosse avec de petits ciseaux à ressort. Localiser pour le ganglion nodosé comme une masse translucide près du foramen magnum. À l’aide de petits ciseaux, cassez soigneusement l’os occipital.Pour exposer davantage le ganglion jugulaire, localisez les mélanocytes noirs à la surface de la jugulaire comme point de repère visuel. Lorsque les ganglions sont trouvés, coupez les attaches nerveuses entre la masse ganglionnaire vagale et tirez doucement sur l’extrémité périphérique du nerf vague tout en coupant simultanément le ganglion jugulaire vers le tronc cérébral avec de petits ciseaux à ressort pour l’extraction de toute la masse ganglionnaire. Enlevez le tissu conjonctif, la masse ganglionnaire et la graisse qui adhèrent au nerf vague.Garder environ un demi-centimètre du nerf vague pour faciliter la manipulation et la localisation des échantillons. Placez le retrait sur les ganglions à l’aide de pinces fines dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millimètre. Et incuber à quatre degrés Celsius dans le formol pendant 24 heures.Et puis avec 30% de saccharose pendant 24 heures. Après l’incubation, placez les ganglions à l’intérieur d’une goutte de quatre millimètres de diamètre de milieu de température de coupe optimale sur un morceau de papier d’aluminium. Et formulez l’échantillon sur un lit de glace carbonique.Coupez les échantillons congelés avec un cryostat en sections de 14 micromètres d’épaisseur à moins 20 degrés Celsius et collectez les sections coupées sur les lames de microscope en verre à trois séries espacées de 42 micromètres. Rincez les lames avec des coupes de tissu dans PBS. Et cuire au four pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius dans un four à pâtisserie.Ensuite, postfixez les lames dans du formol à 4% pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Déshydratez en série les lames dans 50% 70% et 100% d’éthanol pendant cinq minutes chacune. Et appliquer une solution de peroxyde d’hydrogène sur les échantillons pendant 10 minutes avant de rincer dans de l’eau distillée double.Pour l’hybridation in situ, ou ISH, traiter les échantillons avec le réactif de récupération cible pendant cinq minutes. Ensuite, rincez séquentiellement les échantillons dans de l’eau distillée double et de l’éthanol à 100%, puis séchez à l’air. À l’aide d’un stylo hydrophobe, créez une barrière autour des échantillons.Pendant que les échantillons sont traités avec de la protéase pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius et un four d’hybridation, préchauffer les sondes à 40 degrés Celsius et les refroidir à température ambiante avant utilisation. Après être sorti du four, incuber les lames avec la combinaison souhaitée de sondes cibles pendant deux heures à 40 degrés Celsius dans un four d’hybridation. Incuber le tissu témoin négatif avec la dihydrodipicolinate réductase ou DapB, sonde cible C1 pendant deux heures à 40 degrés Celsius.Rincez les lames dans un tampon de lavage et conservez-les dans cinq fois le citrate de sodium salin à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, rincez les lames avec un tampon de lavage avant l’incubation avec des réactifs d’amplification. Et traitez avec des réactifs spécifiques au canal comme décrit dans le manuscrit.Lavez les lames suivies d’un traitement avec DapB pendant 30 secondes. Ensuite, appliquez immédiatement le support de montage sur chaque glissière et placez un glissement de couverture sur la section de tissu. Gardez les tissus horizontaux dans un porte-lames à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie.Préparez un microscope confocal pour l’imagerie en définissant les paramètres requis. Acquérir les images avec une moyenne de ligne de quatre et une taille de pixel d’au moins 1024 par 1024 pour améliorer la qualité des images. Une fois satisfait des paramètres d’acquisition, commencez à acquérir les images en utilisant les mêmes paramètres.Attribuez de fausses couleurs à chaque canal pour faciliter la visualisation. À l’aide des images numériques, effectuez le comptage cellulaire en identifiant le contour des profils positifs de portée de l’ARN avec un noyau légèrement coloré avec DapB. Calculez le pourcentage de profils positifs de portée de l’ARN exprimant chaque transcription.Les paramètres d’acquisition optimaux ont été choisis pour chaque laser en fonction de la fluorescence non spécifique obtenue dans le tissu témoin négatif. La fluorescence endogène dans le ganglion de nodose d’une souris jeune adulte est minime. Et l’incubation avec une sonde DapB, cela n’a pas donné de signaux.À une puissance accrue du laser et du gain avec le laser de 488 nanomètres, un arrière-plan indésirable et des points fluorescents aléatoires apparaissent. La technique de portée de l’ARN a été appliquée pour détecter trois gènes dans des sections tissulaires de la masse ganglionnaire vagale. Le profil tissulaire était positif pour le GHSR et le CCK1R.Le profil comprenait à la fois des transcriptions Phox2b et CCK1R dans la partie rostrale du ganglion nodosé. À la suite de l’ISH multiplex dans les neurones afférents nodosés, les signaux Phox2b se sont spécifiquement accumulés dans les neurones afférents, situés dans le ganglion nodose. Les signaux CCK1R ont intensément marqué de nombreux neurones dans le ganglion nodosé.À faible grossissement, les cellules exprimant de faibles signaux CCK1R ou GSHR ne pouvaient pas être observées facilement. DapB a aidé à visualiser le tissu et à identifier les neurones afférents vagals avec un noyau grand et légèrement coloré. À fort grossissement, les profils positifs de Phox2b sont évidents.Les profils deux et trois sont des cellules Phox2b avec des signaux CCK1R élevés et modérés. Le profil quatre exprimait à la fois le GHSR et le CCK1R. En raison de l’ISH multiplex des neurones afférents jugulaires, le transcrit PRDM12 a pu être vu spécifiquement accumulé dans les neurones afférents situés dans le ganglion jugulaire.À fort grossissement, des signaux modérés pour CCK1R ont été détectés dans les profils un et deux. Le profil trois est un représentant des cellules PRDM12 négatives pour CCK1R ou GHSR. La cohérence de la dissection est un facteur important.Il est tout aussi important de vérifier que les paramètres d’acquisition d’imagerie ne génèrent pas de signaux d’arrière-plan indésirables. L’hybridation multiplex in situ est devenue la référence en matière moléculaire établie, en particulier dans le domaine de la neuroanatomie. Cette méthode peut être facilement combinée avec l’immunohistochimie.

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Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l'organe voméronasal (VNO). Ici, une préparation tissulaire aiguë tranche de VNO pour effectuer l'imagerie calcique est décrite. Cette approche permet des observations physiologiques des sous-populations et / ou des neurones individuels dans un tissu vivant et est commode pour récepteur-ligand d'identification.

Imagerie phéromones détection dans une souris Vomeronasal tissus Préparation Trancher aiguë

L'organe voméronasal (VNO) détecte des signaux chimiques intraspécifiques qui transmettent des informations sociales et reproductives. Nous avons réalisé des expériences d'imagerie Ca2+ en utilisant des souris transgéniques exprimant G-CaMP2 dans le tissu du VNO. Cette approche nous permet d'analyser les schémas complexes de réponse des neurones voméronasaux à un grand nombre de stimuli de phéromones.

Réponses d&#39;imagerie neuronale dans les préparations d&#39;organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

Source : Baleriola, J., et. al., Détection d’ARNm localisés axonalement dans des sections de cerveau à l’aide de l’hybridation in situ à haute résolution.  J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre la détection de l’ARNm dans les axones cholinergiques dans des tranches d’hippocampe de souris fixes à l’aide de l’hybridation fluorescente in situ et de la coloration par anticorps. La microscopie à fluorescence révèle la localisation spatiale des ARNm marqués par sonde et de la choline...

Immunomarquage de neurones dans des tranches de cerveau de souris suite à une hybridation in situ par fluorescence

La localisation de l’expression génique sur des types de cellules spécifiques peut être difficile en raison de l’absence d’anticorps spécifiques. Nous décrivons ici un protocole de triple détection simultanée de l’expression génique en combinant l’hybridation in situ d’ARN à double fluorescence avec l’immunomarquage.

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Ici, nous décrivons une approche physiologique qui permet l’identification et l’analyse approfondie d’une population définie de neurones sensoriels dans des coupes aiguës de tissu coronal de l’organe voméronasal de souris à l’aide d’enregistrements patch-clamp de cellules entières.

En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de l&#39;Vomeronasal Organ Souris

Ce protocole décrit la détection de la microscopie confocale de l'internalisation du récepteur (GPCR) couplé à la protéine G dans les cellules de mammifères. Il comprend la culture de cellules de base, la transfection et la procédure de microscopie confocale et fournit une méthode efficace et facilement interprétable pour détecter la localisation subcellulaire et intériorisation des GPCR de fusion exprimée.

La détection de G Protein-Coupled Receptor Internalisation activé de ligand par microscopie confocale

Ce protocole décrit les étapes critiques et les précautions nécessaires afin d’effectuer seule cellule transcription réverse multiplex PCR après patch clamp. Cette technique est une méthode simple et efficace pour analyser le profil d’expression d’un ensemble prédéterminé de gènes d’une cellule unique, caractérisé par des enregistrements de patch clamp.

Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.

Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Découvrez l'hybridation in situ multiplex pour visualiser l'expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagaux de souris. Cette méthode permet de cartographier les profils transcriptionnels avec une haute sensibilité.

Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex (Vidéo) | JoVE Journal

Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex

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