Modèle de saignement par transsection veineuse de la queue chez des souris hémophiliques A entièrement anesthésiées

Les modèles de saignement de queue peuvent être des outils importants pour évaluer les effets pharmacologiques des composés hémostatiques in vivo afin d’assurer la reproductibilité entre les expériences. Comparé à d’autres modèles de saignement sensibles, notre modèle utilise la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation au lieu de la survie. En outre, le modèle est réalisé sous anesthésie, réduisant ainsi la douleur et la détresse des animaux.

Cette technique est particulièrement utile pour l’étude préclinique de l’hémophilie et d’autres troubles de la coagulation, car elle mesure la capacité du sang à coaguler et à arrêter un saignement après une blessure. Nous avons largement utilisé ce modèle, testant des composés procoagulants dans notre travail pour développer de nouvelles thérapies contre l’hémophilie en utilisant des souris hémophiliques A. Cependant, d’autres souches de souris hémophiles, ou des souris chez lesquelles l’hémophilie est induite par un anticorps anti-facteur VIII, peuvent également être utilisées.

Sarah et Dennis, qui sont des techniciens experts dans mon laboratoire, feront la démonstration de l’expérience. Après avoir anesthésié la souris, placez-la sur une plaque chauffante et assurez-vous que le nez est dans le cône du nez. Appliquez une pommade oculaire appropriée pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.

Marquez la queue à un diamètre de 2,5 millimètres à l’aide du bloc de marque de queue, en prenant soin de ne pas forcer la queue dans la fente et en veillant à ce qu’elle s’adapte parfaitement. Ensuite, placez la queue dans le tube salin pendant au moins cinq minutes pour assurer une veine caudale chaude optimale pour le dosage intraveineux. Si nécessaire, une dose intraveineuse peut être effectuée après cinq minutes.

Ensuite, placez un couvercle en plastique sur la souris pour réduire les pertes de chaleur. Laissez les queues immergées pendant cinq minutes après le dosage de la solution d’essai, puis effectuez la transsection de la veine caudale en plaçant la queue dans le bloc de coupe et en la tournant à 90 degrés pour exposer la veine. Faites la coupe du côté opposé à l’endroit où la solution d’essai a été dosée.

Dessinez la lame de scalpel numéro 11 à travers la fente du bloc de coupe, en tenant la queue, pour créer un saignement. Ensuite, retournez immédiatement la queue à la solution saline et réinitialisez le chronomètre. Les saignements doivent être visibles immédiatement.

L’immersion de la queue dans une solution saline est importante pour un saignement constant, car elle s’arrêterait rapidement à l’air libre. Observez le saignement et annotez le début et l’arrêt du saignement pendant 40 minutes sur le papier de notation du flux sanguin. Disqualifiez et remplacez la souris si le saignement primaire ne s’arrête pas dans les trois minutes suivant la coupure, ce qui peut indiquer que la coupure est trop profonde ou que la souris est déficiente en hémostase primaire.

Défiez la coupe de la queue s’il n’y a pas de saignement, 10, 20 et 30 minutes après la blessure. À l’aide d’un tampon de gaze imbibé d’une solution saline chaude, soulevez la queue de la solution saline et essuyez-la doucement mais fermement deux fois avec la gaze humide dans une direction distale sur la queue coupée. Resubmergez immédiatement la queue dans le tube salin après chaque défi.

Lorsque l’expérience est terminée, retirez la queue de la solution saline, prélevez des échantillons de sang si vous le souhaitez et euthanasiez les souris sous anesthésie complète. Centrifuger les tubes de prélèvement sanguin de 15 millilitres avec une solution saline à 4 000 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant des tubes.

Remettre en suspension la pastille dans deux millilitres de solution de lysage érythrocytaire. Ensuite, diluez-le avec jusqu’à 12 millilitres supplémentaires de solution de lysage jusqu’à ce qu’il atteigne une couleur de café claire. Notez le volume total et transférez deux millilitres de la dilution dans un tube d’hémoglobine.

Réfrigérez-le jusqu’à l’analyse de l’hémoglobine. Une réduction significative de la perte de sang pour les groupes de traitement au facteur VIII de coagulation recombinant a été observée à l’aide du protocole optimisé. Une dose de 20 unités internationales par kilogramme a complètement normalisé le saignement, et 10 UI par kilogramme ont provoqué un effet significatif, réduisant la perte de sang presque à la limite supérieure de la gamme de type sauvage.

Des résultats similaires ont été observés pour le temps de saignement. Une réduction a été observée dans les groupes de 5, 10 et 20 UI par kilogramme, étant complètement normalisée dans le groupe de 20 UI par kilogramme. Chez les souris de type sauvage, la perte de sang totale variait de 200 à 840 nanomoles d’hémoglobine et chez les souris véhicules, de 5 300 à 7 100 nanomoles d’hémoglobine.

Le saignement moyen était de 5 200 nanomoles chez les souris traitées par véhicule et de 720 nanomoles dans le groupe de 20 UI par kilogramme. Le temps de saignement des souris de type sauvage variait de une à neuf minutes et des doses de 10 et 20 UI par kilogramme réduisaient le temps de saignement à l’intérieur de cette plage. Une forte corrélation entre la perte de sang et le temps de saignement a été observée dans les données combinées.

Tous les épisodes de saignement enregistrés ont été tracés pour fournir une visualisation de la longueur et du nombre de saignements subis pour chaque souris. Notez que dans le groupe de véhicules, après le deuxième défi, la plupart des animaux continuent de saigner jusqu’à la fin de l’expérience. La mesure de la concentration plasmatique de facteur VIII a confirmé que l’effet observé dans la réduction de la perte de sang et du temps de saignement était recombinant facteur VIII dépendant de la concentration.

La numération plaquettaire n’a pas été sensiblement affectée et les taux d’hématocrite étaient dans la plage normale chez les animaux recevant des doses modérées et plus élevées de facteur VIII recombinant, mais significativement plus faibles chez les animaux qui saignaient abondamment, comme dans le véhicule et un UI par groupe de kilogrammes. Chez les animaux présentant des saignements abondants, un impact mineur sur la numération globulaire, en particulier l’hémoglobine totale ou l’hématocrite, peut survenir. Pour évaluer l’effet du genre dans ce modèle optimisé, les résultats de perte de sang et de temps de saignement ont été soumis à une analyse bidirectionnelle de l’ANOVA, avec le sexe et la dose comme facteurs.

Ces résultats ont indiqué que la réponse au traitement ne différait pas d’un sexe à l’autre. Le marquage correct de la queue et la création de la coupe sont des étapes essentielles pour assurer la fiabilité et la reproductibilité de la technique, tout comme le défi s’il n’y a pas de saignement. En outre, une bonne induction de l’anesthésie et le maintien de la température corporelle de l’animal sont particulièrement pertinents.

Nous avons également utilisé ce modèle pour étudier l’arrêt des saignements établis dans un contexte plus semblable à celui de la demande en traitant avec le facteur VIIA 10 minutes après avoir induit un saignement.