Approche génétique inverse pour identifier les régulateurs de pigmentation à l’aide du poisson zèbre
March 1st, 2022
Les régulateurs des fonctions mélanocytaires régissent les différences visibles dans le résultat de la pigmentation. Déchiffrer la fonction moléculaire du gène de pigmentation candidat pose un défi. Ici, nous démontrons l’utilisation d’un système modèle de poisson zèbre pour identifier les candidats et les classer en régulateurs de la teneur en mélanine et du nombre de mélanocytes.
Ce protocole est un amalgame de diverses techniques qui permettraient aux chercheurs de délimiter le rôle du gène candidat dans la biologie des mélanocytes. Il s’agit d’une approche holistique pour parvenir à une inférence logique. En combinant diverses méthodes, les facteurs de confusion peuvent être évités et cela peut aider les chercheurs à obtenir un résultat substantiel.
Pour commencer l’analyse, immobiliser les 48 embryons HPF avec 0,016% de tricaïne. Montez les embryons en utilisant quelques millilitres de 1,5 à 2% de méthylcellulose dans une boîte de Pétri. Prélevez les embryons avec une pipette Pasteur et placez-les dans de la méthylcellulose pour restreindre les mouvements pendant l’imagerie.
Pour une imagerie latérale ou dorsale optimale, ajustez leur position avec un grossissement de plus de 5X. Placez la boîte de Petri sous le microscope. À l’aide d’un manipulateur, ajustez le poisson de manière à ce que les cinq bandes embryonnaires mélanocytaires soient visibles simultanément.
À l’aide du logiciel d’acquisition, capturez les images. Si le poisson se réveille, placez-le dans de l’eau tricaïne jusqu’à ce qu’il se stabilise. À l’aide de l’outil d’ouverture du logiciel ImageJ, ouvrez l’image à quantifier.
Sélectionnez l’outil de forme à main levée pour délimiter la zone à analyser. Sélectionnez l’option Définir les mesures, cliquez sur la valeur de gris moyenne, puis sur la zone. Pour calculer la valeur de gris moyenne pour la zone sélectionnée, cliquez sur M ou allez à analyser et sélectionnez mesurer.
En fonction du stade d’intérêt, transférer les embryons dans une boîte de Petri contenant 0,6 milligramme par millilitre de Pronase. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les embryons déchorionnés dans une boîte de Petri contenant de l’eau embryonnaire ordinaire après cinq à 10 minutes. Avec une pipette Pasteur en verre, prélever et transférer environ 100 embryons dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.
Jeter le milieu et ajouter 200 microlitres de solution glacée de Ringers d’éjoliveur. Placez le tube sur de la glace et mélangez le contenu environ 20 fois avec une pipette pour dissoudre le joug. Centrifuger les tubes à 100 G pendant une minute à quatre degrés Celsius deux fois et jeter le surnageant.
Transférer les embryons éblifiés à l’aide d’une pipette d’un millilitre dans une boîte de Petri contenant 10 millilitres de solution de trypsine. Mélanger la solution une ou deux fois à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour diminuer l’agrégation. Passez la suspension trypsinisée à travers une passoire de 70 micromètres placée sur un tube conique de 50 millilitres pour recueillir une suspension unicellulaire.
Lavez les boîtes de Petri avec la suspension trypsinisée pour éliminer les cellules collées de la surface. Pour compter les cellules marquées par fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux, après avoir créé un nouveau dossier d’expérience, dessinez un diagramme de dispersion avant ou latéral. Faites un histogramme pour l’intensité de l’isothiocyanate de fluorescéine.
Chargez d’abord les cellules de type wild pour définir les portes de diffusion avant et latérale et le seuil FITC. Ensuite, chargez les cellules isolées des embryons transgéniques de la lignée FTYRP GFP pour compter les mélanocytes. Monter les embryons dans 1,5 à 2% de méthylcellulose dans une boîte de Pétri.
Placez-le sous le microscope et ajustez-le dans l’orientation souhaitée à l’aide d’une pointe de pipette. À l’aide du logiciel d’acquisition, acquérir les images. Pour les embryons de moins de 24 HPF, en utilisant un grossissement de 10X, capturez l’image entière, tandis que pour les embryons de plus de 24 HPF, acquérez plusieurs champs de balayage et les assemblez ensuite.
Après avoir effectué le test, l’imagerie en fond clair après 48 heures a révélé la présence des cinq bandes mélanophores pigmentées. Au stade 48 HPF, le nombre de mélanophores latéraux a été calculé et il a été constaté que les morphants h2afv de la variante histones présentaient un nombre réduit de mélanophores par rapport au témoin. La valeur moyenne de gris a été mesurée pour les morphants CA14 et h2afv, ce qui a révélé que les valeurs étaient plus élevées pour les variants que pour les morphants témoins.
En utilisant une méthode d’absorption spectrophotométrique à base d’hydroxyde de sodium, la teneur en mélanine a été quantifiée lorsque les morphants CA14 présentaient une teneur inférieure à celle des morphants témoins. L’imagerie par fluorescence a été réalisée pour évaluer l’altération à base de morpholino à différents stades du développement du mélanophore du poisson zèbre. Le nombre de mélanophores dans les morphants CA14 et h2afv a été analysé à l’aide de FACS.
Il a été observé que le nombre de mélanophores dans CA14 est resté inchangé, alors qu’ils ont été significativement réduits dans h2afv par rapport au morphant témoin. L’intensité moyenne de fluorescence par zone a également été calculée, démontrant que les morphants h2afv montrent une diminution considérable de la valeur par rapport aux morphants témoins. Tout en ajustant le poisson avant l’imagerie, assurez-vous de pouvoir visualiser les cinq bandes mélanophores .
Vous devez incliner un peu le poisson pour distinguer les deux bandes latérales. Après avoir établi le rôle d’un gène candidat dans le développement des mélanocytes, nous pouvons éliminer le gène d’une manière spécifique au tissu en utilisant la technologie CRISPR. Il s’agira d’une approche plus ciblée.
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Aperçu
Cette étude examine le rôle des gènes de pigmentation candidats dans la biologie des mélanocytes en utilisant un système modèle de poisson-zèbre. En utilisant diverses techniques d'imagerie et d'analyses, la recherche identifie les principaux régulateurs du contenu en mélanine et du nombre de mélanocytes.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Développement des mélanocytes
- Génétique de la pigmentation
- Poisson-zèbre comme organisme modèle
Contexte
- Comprendre la fonction moléculaire des gènes de pigmentation est essentiel pour déchiffrer les variations de couleur de la peau.
- Les facteurs de confusion dans la recherche peuvent entraver une évaluation précise des fonctions génétiques.
- Les embryons de poisson-zèbre fournissent un modèle efficace pour étudier les premiers processus de développement dans la pigmentation.
Méthodes utilisées
- Immobilisation des embryons et techniques d'imagerie
- Poisson-zèbre comme modèle biologique
- Cytométrie en flux pour le décompte des mélanocytes et analyses spectrophotométriques pour le contenu en mélanine
Principaux résultats
- Un nombre réduit de mélanophores a été observé chez les morphants h2afv par rapport aux témoins.
- Les morphants CA14 présentaient moins de contenu en mélanine que les morphants témoins.
- L'imagerie fluorescente a confirmé des différences développementales dans les mélanophores.
Conclusions
- Les résultats illustrent l'importance de gènes de pigmentation spécifiques dans le développement des mélanocytes.
- Cette recherche a des implications plus larges pour comprendre les influences génétiques sur la pigmentation.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic interrogation of genetic regulators in melanocyte development, supporting target validation in pigment-related disorders. By combining phenotypic imaging, flow cytometry, and biochemical assays, it provides quantitative readouts for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach enhances predictive confidence in distinguishing genes affecting melanocyte number versus melanin content per cell, informing portfolio prioritization for topical or systemic modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional dissection of candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators based on effects on cell number versus pigment synthesis.
- Operational Value: Uses morpholino knockdown in zebrafish larvae to rapidly assess phenotypic consequences on pigmentation pathways.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing by linking gene perturbation to measurable changes in melanophore count and melanin content.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs including mean gray value from brightfield imaging and melanin concentration via spectrophotometry.
- Operational Value: Integrates FACS-based melanocyte counting with imaging to enable high-content phenotypic screening of genetic modulators.
- Scientific Value: Facilitates assay reproducibility through defined staging (48 HPF), immobilization, and imaging parameters for longitudinal comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses transgenic GFP reporters (mitfa, tyrp1) to track melanocyte specification and differentiation stages relevant to human pigmentation biology.
- Operational Value: Enables segregation of hits into mechanistic classes (specifiers vs. differentiators) to guide downstream validation in mammalian models.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating genes implicated in piebaldism, albinism, or vitiligo pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are validated for effects on melanocyte biology before compound screening or mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports target validation by isolating gene-specific effects on melanocyte development through morpholino phenocopy and quantitative imaging.
- Screening: Enables assay-ready zebrafish models with fluorescent reporters for scalable evaluation of genetic or small-molecule modulators.
- Analytics: Delivers multiparametric readouts—melanophore number (FACS), melanin content (spectrophotometry), and spatial distribution (imaging)—to support data-driven hit triage.
- Translational Research: Uses conserved melanocyte markers (mitfa, tyrp1) to bridge zebrafish findings to human pigmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pigment genetics screening applicable across target families and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing genes that alter melanocyte specification from those affecting pigment production per cell.
- Operational Value: Standardizes embryo handling, imaging, and dissociation protocols to ensure reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic confidence in target mechanism before investing in medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic validation of melanocyte-specific phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology, microinjection, and morpholino design is required for accurate phenotypic assessment.
- Instrumentation includes fluorescence microscopes, flow cytometers, and spectrophotometers for multiparametric readout.
- Standardization across teams requires synchronized staging (HPF), immobilization protocols, and imaging settings to minimize variability.
- Adaptation to other models may require validation of conserved promoter-driven reporters and phenotypic endpoints.
- Limitations include morpholino off-target effects and transient knockdown, necessitating follow-up with CRISPR or mutant lines for target confirmation.
