Génération d’unités motrices humaines avec des jonctions neuromusculaires fonctionnelles dans des dispositifs microfluidiques

Cette méthode relativement simple peut aider la recherche axée sur les motoneurones et les jonctions neuromusculaires dans la santé et la maladie. Ce protocole utilise la technologie standard des cellules souches et des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce qui augmentent la reproductibilité. La déconnexion des motoneurones et des cellules musculaires est un phénomène précoce dans plusieurs maladies neuromusculaires.

Un simple modèle humanisé pourrait aider à développer des stratégies pour contrer ce phénomène. Nous utilisons ce modèle pour étudier le trouble du motoneurone, la sclérose latérale amyotrophique, cependant, ce modèle peut également être utilisé pour d’autres troubles dans lesquels l’unité motrice est essentielle. Commencez par transférer l’appareil à l’aide de la pince du conteneur d’expédition à la boîte de Pétri contenant 10 millilitres d’éthanol à 70% à 100% pour la stérilisation pendant 10 secondes.

Transférez l’appareil avec une pince sur un morceau de papier pour qu’il sèche à l’air libre dans le flux laminaire pendant environ 30 minutes. Une fois qu’un appareil est séché, utilisez des pinces pour déplacer chaque appareil vers une boîte de Petri individuelle de 10 centimètres. Pour recouvrir l’appareil de Poly-L-ornithine ou de PLO, ajoutez 100 microlitres de solution de PLO au puits supérieur et observez le fluide passant du puits supérieur à travers le canal vers le puits inférieur.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de PLO au puits inférieur et répétez de l’autre côté des micro-rainures. Terminez en ajoutant 100 microlitres de solution PLO d’un côté pour créer un gradient de volume entre les deux côtés en miroir de l’appareil pour recouvrir les micro rainures. Incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Après trois heures, lavez l’appareil trois fois pendant cinq minutes avec DPBS. Enduisez l’appareil de 20 microgrammes par millilitre de laminine et de milieu neurobasal en suivant la procédure similaire au revêtement PLO. Incuber l’appareil pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Le lendemain, utilisez une pipette de 200 microlitres et placez la pointe dans le puits opposé à l’ouverture du canal pour enlever le revêtement de laminine des puits. Après avoir ajouté du DPBS à tous les puits, laissez les appareils avec du DPBS dans le flux laminaire à température ambiante pour l’ensemencement des cellules. Coupez les feuilles SCM à la taille de l’appareil tout en laissant quelques millimètres de chaque côté.

Après avoir stérilisé les appareils et les feuilles SCM dans une boîte de Petri contenant 10 millilitres de 70% à 100% d’éthanol pendant 10 secondes, transférez les appareils avec pinces sur une plaque à six puits et les feuilles SCM dans une boîte de Petri de 10 centimètres pour un séchage à l’air dans le flux laminaire. Positionnez l’appareil sur le bord pour permettre à tous les côtés de sécher pendant environ 30 minutes. Enduire les appareils en ajoutant un millilitre de solution de PLO par puits à chaque appareil dans la plaque de six puits.

Assurez-vous que l’appareil flotte sur le dessus de la solution PLO avec le canal et le côté micro-rainure orientés vers le bas dans le liquide. Enduire les feuilles de SCM en ajoutant 10 millilitres de solution de PLO à la boîte de Petri de 10 centimètres, et utiliser les pinces pour pousser les feuilles de SCM dans le liquide. Incuber des dispositifs et des feuilles SCM pendant trois heures, comme démontré précédemment.

Après trois heures, lavez les appareils et les feuilles SCM deux fois pendant cinq minutes avec DPBS, puis un autre lavage pendant cinq minutes avec de l’eau stérile. Ensuite, transférez chaque feuille de SCM dans une boîte de Petri individuelle de 10 centimètres pour sécher à l’air. Lorsque vous travaillez au microscope dans le flux laminaire, utilisez une pince pour monter le dispositif en silicone avec le canal et la micro-rainure vers le bas à un angle de 90 degrés sur la feuille SCM en veillant à ce que tous les côtés soient alignés.

Appuyez légèrement sur l’appareil pour vous assurer de sceller non seulement les bords extérieurs, mais aussi autour des puits, des canaux et des micro-rainures. Pour recouvrir l’appareil de laminine, à l’intérieur du flux laminaire et au microscope, ajoutez 100 microlitres de 20 microgrammes par millilitre de solution de laminine dans le puits supérieur à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Observez le fluide passer du puits supérieur à travers le canal vers le puits inférieur sans aucune fuite autour du puits et du canal.

Par la suite, ajoutez 100 microlitres de solution de laminine au puits inférieur, répétez de l’autre côté des micro rainures et terminez avec 100 microlitres supplémentaires de laminine d’un côté pour créer un gradient de volume entre les deux côtés en miroir de l’appareil pour recouvrir les micro rainures, puis incubé l’appareil pendant la nuit. Le lendemain, retirez le revêtement des puits avec la pipette de 200 microlitres en positionnant la pointe dans le puits en face de l’ouverture du canal, après avoir ajouté du DPBS à tous les puits, laissez les appareils avec DPBS dans le flux laminaire à température ambiante pour l’ensemencement cellulaire. Pour plaquer les cellules de progéniteurs neuronaux ou les PNJ dans le dispositif microfluidique, retirez le DPBS de deux puits d’un côté des micro-rainures de l’appareil à l’aide d’une pipette de 200 microlitres.

Pour ensemencer un total de 250 000 PNJ et 60 à 100 microlitres du jour 10 du milieu motoneurone par appareil, en haut à droite, ensemencez la moitié de la suspension cellulaire près de l’ouverture du canal à un angle de 45 degrés. Faites une pause de quelques secondes pour permettre à la suspension cellulaire de circuler dans le canal avant d’ajouter la moitié restante de la suspension cellulaire dans le puits inférieur. Utilisez un stylo pour marquer le côté ensemencé comme PNJ ou équivalent, pour faciliter l’orientation de l’appareil sans microscope, et incubez pendant cinq minutes pour la fixation de la cellule.

Ensuite, rechargez lentement les deux puits ensemencés par NPC avec un milieu de motoneurone supplémentaire de jour 10 jusqu’à un volume total de 200 microlitres par puits. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirer le DPBS des deux puits de l’autre côté des micro-rainures opposées aux PNJ fraîchement ensemencés. Ajouter 200 microlitres de milieu de motoneurone du jour 10 par puits aux puits non ensemencés.

Ajoutez ensuite six millilitres de DPBS par plat de 10 centimètres autour de l’appareil pour éviter l’évaporation du milieu pendant l’incubation. Pour changer le milieu, retirez lentement le support dans les deux puits avec des PNJ en positionnant la pointe de la pipette de 200 microlitres sur le bord inférieur de la paroi du puits en face de l’ouverture du canal. Pour éviter qu’un fort écoulement de milieu n’endommage les cellules sur le canal, ajoutez lentement 50 à 100 microlitres de milieu de motoneurone frais à chaque puits en changeant continuellement entre le puits supérieur et le puits inférieur.

Répétez le processus jusqu’à ce que chaque puits contienne 200 microlitres de milieu. Le jour 17 de la différenciation des motoneurones, retirez le milieu du motoneurone du côté non ensemencé des micro rainures de l’appareil avec une pipette de 200 microlitres et lavez les puits avec du DPBS. Ensemencez un total de 200 000 mésoangioblastes primaires humains ou MAB, dans 60 à 100 microlitres de milieu de croissance par dispositif en ensemençant la moitié de la suspension cellulaire dans le puits supérieur.

Faites une pause de quelques secondes pour permettre à la suspension cellulaire de circuler dans le canal avant d’ensemencer la moitié restante de la suspension cellulaire dans le puits inférieur, comme démontré précédemment pour le placage des PNJ. Incubez le dispositif pendant cinq minutes pour la fixation de la cellule. Ensuite, complétez les deux puits fraîchement ensemencés maB avec un milieu de croissance supplémentaire et incubez à nouveau comme démontré.

Pour initier la tactique de chimio et le gradient volumétrique le 21e jour de la différenciation des motoneurones, ajoutez 200 microlitres par puits de milieu neurobasal de motoneurone contenant des facteurs de croissance au compartiment myotube, puis ajoutez 100 microlitres par puits de milieu basal de motoneurone sans facteurs de croissance au compartiment de motoneurone. Il est important d’évaluer le potentiel de différenciation des lignées cellulaires avant de les co-cultiver dans des dispositifs microfluidiques. L’indice de fusion des MAB a été déterminé, et environ 8 % ont été estimés suffisants pour la co-culture.

Les cultures de motoneurones générées étaient positives de 85 à 95 % pour les marqueurs de motoneurones. Pour caractériser et quantifier la quantité de jonctions neuromusculaires ou NMJ, le nombre de colocalisations entre le motoneurone et les marqueurs pré-synaptiques de la chaîne lourde du neurofilament et de la synaptophysine et du marqueur du récepteur de l’acétylène postsynaptique alpha bungarotoxine, a été compté dans chaque pile de maladie et a été normalisé à un certain nombre de myotubes marqués à chaîne lourde de myosine présents dans la pile Z. Les NMJ sont apparus comme des NMJ à point de contact unique où la neurite a touché un groupe d’un récepteur subtil de la choline à un point d’interaction.

Ou en tant que NMJ à points de contact multiples où une neurite s’est répandue et s’est engagée avec un groupe subtil de récepteurs de choline sur une plus grande surface. Quantification du pourcentage de neurones moteurs innovés Les myotubes ont indiqué que tous les myotubes ne contenaient pas de NMJ. Lors de l’activation des motoneurones avec du chlorure de potassium, un afflux de calcium a été observé dans les myotubes marqués Fluo-4, ce qui a confirmé une connexion fonctionnelle à la neurite du motoneurone dans le myotube, l’ajout de d-tubocurarine, bloqueur NMJ, ou DTC au compartiment Myotube a entraîné une inhibition de l’afflux de calcium.

Pour avoir le plus grand succès avec ce modèle, il est extrêmement important d’effectuer un contrôle de la qualité de la lignée cellulaire et d’éviter la formation de bulles d’air dans les canaux de l’appareil. La combinaison de la jonction neuromusculaire dans une boîte avec d’autres types de cellules directes IPC imite encore mieux la situation in vitro, ce qui permet également d’étudier le rôle de ces types de cellules.