Immunofluorescence, clairance et microscopie multiphotonique des ovaires entiers pour l’analyse 3D quantitative de la réserve ovarienne en développement chez la souris

Cette méthode peut aider à répondre à l’une des questions clés dans le domaine de la reproduction, à savoir comment et quand les processus génétiquement régulés influencent la taille de la réserve ovarienne dont nous savons qu’ils ont un impact sur les femelles, la longévité reproductive Ce protocole peut être adopté pour des études à grande échelle en utilisant les mêmes techniques pour les ovaires intacts de différents stades de développement. Il génère des données productibles en fournissant une quantification efficace des cellules germinales. Cette méthode appliquée à des animaux génétiquement divers de la même espèce peut fournir un aperçu des facteurs génétiques directement sur le développement des cellules germinales et des ovaires et d’autres organes de développement.

Nathaniel Boechat, un stagiaire de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure Pour commencer par la place de l’étape de profusion et sécuriser la souris femelle pubère anesthésiée sur son dos en épinglant doucement toutes les jambes à travers les coussinets de pattes dans une position détendue sur une planche. Pour ouvrir la cavité thoracique de la souris, coupez soigneusement les côtes des deux côtés du sternum juste en dessous de l’omoplate, en évitant de percer les poumons, attrapez la peau ou les lambeaux de côtes avec la pince et épinglez les lambeaux pour exposer les organes internes utilisez des ciseaux à dissection pour couper l’oreillette droite du cœur et libérer le sang du système. Ensuite, en tenant le cœur avec une pince, insérez une aiguille de perfusion dans le ventricule gauche et pompez 10 millilitres de PBS avec une pression douce et constante.

Lorsque les tissus tels que les reins du foie et l’appareil reproducteur sont passés du rose au blanc, remplacez le PBS par du paraformaldéhyde ou du PFA à 1% fraîchement préparé et poursuivez la perfusion avec environ 10 millilitres de PFA. Ensuite, localisez le coussinet adipeux avec les ovaires sous le rein et disséquez doucement l’ensemble de l’appareil reproducteur, y compris les ovaires du coussinet adipeux et les cornes utérines pour le placer dans un flacon contenant 4% de PFA. Fixez les ovaires à température ambiante pendant 16 à 24 heures avant de remplacer le PFA à 4% par de l’éthanol à 70%.

Le jour de la coloration, coupez les ovaires avant de procéder à la coloration immunologique. Le premier jour du protocole de coloration immunologique, pipettez un millilitre de PBS par puits dans le nombre souhaité de puits dans une plaque propre de 24 puits. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1000 microlitres pour faire une large ouverture et utilisez la pointe large pour transférer doucement les ovaires pubertaires des flacons contenant 70% d’éthanol dans les puits, puis remplacez le PBS dans le puits par 0,8 millilitre de PBS le lendemain, aspirez le PBS des puits pour le remplacer par 0,8 millilitre du tampon de perméation par puits.

Après avoir incubé les plaques sur le shaker à température ambiante pendant quatre heures, remplacez le tampon de perméation par un tampon bloquant Le troisième jour, préparez les anticorps primaires par dilution dans le tampon bloquant. Pour visualiser les ovocytes, incuber les ovaires prénatals et prépubères avec les marqueurs d’ovocytes. Le huitième jour, lavez les échantillons avec un tampon de lavage frais pendant deux heures, puis remplacez le tampon de lavage par 0,5 millilitre de mélanges d’anticorps secondaires dilués dans un tampon bloquant.

Scellez la plaque avec un parafilm pour éviter l’évaporation et incuber les échantillons à température ambiante dans l’obscurité pendant trois jours. Le jour 11 après le lavage de coloration immunologique, aspirez le tampon de lavage et incubez les échantillons avec 0,8 millilitre de la solution cubique à 37 degrés Celsius pendant trois jours dans l’obscurité. Changer l’échelle cubique une solution par jour.

Le jour 15, lavez les échantillons trois fois pendant 10 minutes et 0,8 millilitre de PBS à température ambiante en secouant doucement. Remplacez ensuite le PBS par 0,8 millilitre de saccharose dégazé à 20% fraîchement préparé par du PBS, suivi d’une secousse douce à température ambiante. Après une heure, remplacez la solution de saccharose à 20% pour traiter les échantillons avec 0,8 millilitre de la solution cubique à deux degrés pendant quatre à cinq jours, comme expliqué précédemment.

Pour préparer une mise en place d’échantillon, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres avec la coupure de la pointe pour transférer les ovaires pubertaires avec 15 à 20 microlitres de solution cubique à l’échelle deux au milieu du puits adhésif. Une fois que les ovaires sont transférés dans le puits individuel avec une goutte de solution de nettoyage, placez doucement un verre de couverture sur le puits adhésif et appuyez pour créer un joint prenant en sandwich les échantillons et la solution de nettoyage entre deux glissements de couverture. Pour le lieu d’imagerie, le couvercle est pris en sandwich dans une lame d’adaptateur de microscope imprimée en 3D.

Configurez les paramètres d’acquisition d’images en fonction des noyaux de microscopie ou des spécifications du fabricant. Si disponible, utilisez l’acquisition d’image bidirectionnelle pour réduire le temps de numérisation et améliorer l’efficacité. Ajustez la moyenne des lignes, la moyenne des images et l’accumulation des images dans le logiciel.

Configurez la pile Z en identifiant la position de début et de fin, puis sélectionnez une taille de pas Z de deux micromètres pour les ovaires prépubères et de cinq micromètres pour les ovaires pubertaires. Ensuite, activez la fonction de compensation Z et le gain d’excitation. Réglez la compensation Z pour le bas et le haut de l’échantillon en sélectionnant une intensité laser pour les deux.

Utilisez le mode mosaïque pour les échantillons plus volumineux qui ne peuvent pas être capturés dans un seul champ de vision. Activez le navigateur d’images et indiquez le nombre de tuiles nécessaires pour capturer l’échantillon entier à l’aide de l’outil de marquage rectangulaire. Une fois le réglage terminé, commencez par l’acquisition d’images pour les images avec plusieurs vignettes, commencez l’acquisition d’images avec le navigateur pour capturer toutes les tuiles.

Après l’acquisition de l’image, enregistrez toutes les images. Et si plusieurs mosaïques ont été acquises, exécutez l’outil de fusion de mosaïque pour fusionner les mosaïques en une seule image. Pour déterminer la taille des ovocytes, ouvrez l’image et sélectionnez l’option de tranche pour ouvrir l’image de la pile Zs.

Sélectionnez l’option de ligne et le panneau de mesure et mesurez la distance en traçant une ligne d’un bord d’un ovocyte ou d’un marqueur à l’autre bord au point le plus large pour déterminer le diamètre X Y de l’ovocyte. Déplacez-vous dans la pile et obtenez la gamme de diamètres pour plusieurs ovocytes du même type. Utilisez la longueur la plus courte comme critère de sélection de la taille pour le nombre d’ovocytes.

Ensuite, dans l’option de vue 3D, sélectionnez la fonction spots. Dans le panneau de scène, activez la fonction Ajouter de nouveaux spots pour ouvrir le panneau d’algorithme. Ensuite, désélectionnez tous les paramètres de l’algorithme comme filtre de sélection de taille avec la taille des ovocytes obtenue précédemment.

Cliquez sur la flèche de transfert du canal pour accéder au canal source. Sélectionnez ensuite le canal avec le marqueur préféré et tapez le diamètre acquis dans le diamètre estimé X, Y. Après la sélection de la taille, activez l’allongement PSF du modèle et la soustraction d’arrière-plan qui sont automatiquement déterminés.

Ensuite, choisissez la flèche unique vers l’avant pour accéder au panneau des points de filtre et ajoutez le filtre de qualité pour déterminer un seuil. Pour assurer l’estimation précise du nombre d’ovocytes, agrandissez l’image. Plus tard, cliquez sur la double flèche pour terminer les comptages automatisés.

Utilisez l’onglet Modifier pour sélectionner manuellement les ovocytes manqués ou désélectionner les particules de non-ovocytes sélectionnées par le seuil automatique. Lorsque vous avez terminé, enregistrez les données dans l’onglet Statistiques sous l’onglet Global pour une analyse plus approfondie. Pour estimer le nombre total d’ovocytes et les ovaires endommagés, ouvrez des images des ovaires intacts avec MRS et sélectionnez la fonction de cadre.

Sous les paramètres du cadre, cochez la case grille et accédez aux étiquettes. Dans l’onglet position XYZ, sélectionnez 200 microme pour générer des graduations avec des espaces de 200 micromètres dans toutes les positions XYZ. En utilisant les marques de tiques de 200 micromètres, sélectionnez les ovocytes qui tombent à moins de 50% du volume de chaque ovaire.

Cliquez sur la fonction spots et sélectionnez les étiquettes d’édition pour classer les ovocytes qui se situent dans la région 50% par couleur. Dans les images multiphotoniques représentatives en niveaux de gris des ovaires non perfusés et perfusés, les petits ovocytes dans les follicules primordiaux avec la fine couche de coloration cytoplasmique DDX4 ont pu être vus. De plus, les plus gros ovocytes dans les follicules en croissance ont été repérés.

Les rendus 3D des images multiphotoniques des ovaires prénatals et postnatals ont été étudiés. Au jour postnatal 28, l’ovaire de la femelle témoin non irradiée contenait une grande population de petits ovocytes dans les follicules primordiaux. En revanche, les ovaires de la femelle irradiée avec 0,5 gris du rayonnement gamma étaient complètement dépourvus de petits ovocytes dans les follicules primaires.

Mais des ovocytes plus gros étaient toujours présents. Pour la quantification des ovocytes, les images multiphotoniques 3D ont été traitées dans le logiciel MRS à l’aide du filtre goucien et les ovocytes de petites et grandes tailles ont été identifiés et quantifiés à l’aide de la fonction spot. Ensuite, le pourcentage moyen d’ovocytes a été calculé à chaque étape par rapport au nombre moyen présent au stade le plus précoce E 15,5 le nombre d’ovocytes a fortement diminué entre E 15,5 et E 18,5 les ovocytes fœtaux E 15,5 et E 18,5 exprimés ligne un ou un P comme on le voit dans les images multiphotoniques.

L’analyse d’intensité a montré des expressions plus élevées de la ligne un ou d’un P par ovocytes à E 18,5 qu’à E 15,5. Les ovaires avec de petits dommages peuvent être utilisés pour l’analyse. Le nombre total d’ovocytes est déterminé à l’aide d’une correction informatique.

Le modèle représentatif montre des ovocytes G CNA positifs dans l’ovaire E 15,5 avec cinq régions de 10% mises en évidence dans un ovaire intact. De même, un ovaire simulé avec des régions incrémentielles de 10% manquant jusqu’à 50% de l’ovaire a été généré. Le nombre total d’ovocytes et les ovaires simulés ont été comparés aux ovaires intacts d’origine.

Et la différence a été présentée comme l’écart en pourcentage Une bonne perfusion entraîne une bonne qualité d’image. Assurez-vous donc que tous les tissus sont nettoyés avec du PBS avant de passer au PFA. Assurez-vous que les ovaires sont complètement exposés en coupant le tissu supplémentaire.

Le protocole permet une analyse efficace d’un grand nombre d’échantillons, les données quantitatives obtenues à partir de populations génétiques de référence telles que la production collaborative croisée ou de diversité aideront à identifier les modificateurs génétiques du développement des ovocytes et le nombre d’ovocytes.