Name: Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprende a detectar mutaciones indel generadas por CRISPR/Cas9 en Aedes aegypti mediante análisis de fusión de alta resolución. Este protocolo eficiente permite identificar mutantes en pocas horas y seleccionar líneas mutantes rápidamente.

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Todas las figuras fueron creadas con Biorender.com bajo una licencia de la Universidad de Texas A&M. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (AI137112 y AI115138 a Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research bajo el Programa de Subvenciones para Enfermedades Insectarias Vectorizadas, y el Proyecto Hatch del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA, 1018401.

1. Escaneo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), diseño de imprimación HRMA y validación de imprimación
<ol><li>Identificación de SNP en mosquitos colonias de laboratorio de tipo silvestre<ol><li>Seleccione el exón objetivo para interrumpir la traducción adecuada del polipéptido. NOTA: El objetivo debe estar cerca del codón de inicio o entre los residuos clave necesarios para la función de la proteína. Cuanto más corto sea el exón (por ejemplo, ≤200 bases), más difícil será apuntar y analizar. Evite editar cerca de los límites de un exón, ya que esto obliga a uno de los cebadores HRMA a cruzar un intrón o estar en un intrón. Esto es indeseable porque las tasas de SNP tienden a ser mucho mayores en esas regiones.</li>
		<li>Diseño de imprimación<ol>
<li>Vaya al sitio web de NCBI Blast - Primer Blast15, copie y pegue el exón elegido en el cuadro en la parte superior de la página | elija el tamaño del producto de PCR (asegúrese de que abarque la mayor parte del exón) | elegir el organismo.</li>
			<li>Haga clic en parámetros avanzados | Opte por (para PCR Product Tm) y agregue 60 (para una temperatura óptima de 60 ° C) | Obtén cartillas. Mantenga los otros parámetros como predeterminados.</li>
		</ol></li>
		<li>Obtener ADN genómico (gDNA) de la colonia de laboratorio de tipo salvaje. Aparta 10 mosquitos, anestesia con CO2 y colócalos en una placa de Petri sobre hielo para mantenerlos inactivos. Configure 10 tubos que contengan 0,5 μL del reactivo para la liberación de ADN del tejido y 20 μL de tampón de dilución, ambos proporcionados en el kit de liberación de ADN sugerido en la Tabla de Materiales.</li>
		<li>Retire una pata de un solo mosquito con fórceps y colóquela en un tubo correspondiente de una solución diluida del reactivo de liberación de ADN (a partir del paso 1.1.3), sumergiendo completamente la pata en la solución. Repita este paso con los mosquitos restantes, limpiando los fórceps con etanol al 70% antes de pasar al siguiente.</li>
		<li>Incubar la solución que contiene la pierna a temperatura ambiente durante 2-5 min, luego a 98 °C durante 2 min, y dejar que se enfríe mientras se configura la reacción de PCR. NOTA: Las placas que contienen el gDNA liberado se pueden almacenar a -20 °C, y el protocolo se puede pausar en este punto.</li>
		<li>Preparar 10 tubos que contengan 10 μL de 2x PCR Master Mix, cebadores a una concentración final de 0,5 μM y agua de grado molecular a un volumen final de 20 μL, y transferir 1 μL de la muestra diluida a cada tubo. Realizar PCR siguiendo estos parámetros de ciclo: 98 °C 5 min, 40 ciclos de 98 °C durante 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s por kb; extensión final de 72 °C durante 1 min.</li>
		<li>Purificar los productos de PCR con una enzima para degradar los cebadores de PCR residuales y desfosforilar el exceso de dNTP o cualquier kit de limpieza de columna. Proceda con la secuenciación de las muestras.</li>
		<li>Analice cada electroferograma para detectar la presencia de picos dobles / bases ambiguas, y ajuste las llamadas de base manualmente en cada secuencia utilizando el código base degenerado apropiado. NOTA: Este paso debe realizarse antes de la alineación de secuencia múltiple, ya que es común que el software de llamada base seleccione el pico más prominente como la llamada base "verdadera", dando la falsa impresión de una ausencia de SNP.</li>
		<li>Realice una alineación de secuencia múltiple utilizando el software de alineación, SeqMan Pro, que aparece en la Tabla de materiales u otro software de alineación de código abierto, como ClustalW16 o T-Coffee17.<ol>
<li>Abra el software de alineación | haga clic en Agregar secuencias | seleccione las secuencias deseadas y haga clic en Agregar | una vez elegidas todas las secuencias, haga clic en Listo.</li>
			<li>Haga clic en Ensamblar para realizar la alineación. Para abrir la alineación, haga clic en Contig 1 y analice la alineación e identifique los SNP (Figura 1). NOTA: Como alternativa a los pasos 1.1.3-1.1.6, la PCR se puede realizar a partir de ADN genómico aislado obtenido de muestras a granel (derivadas de >10 individuos). Los amplicones secuenciados se pueden analizar directamente para detectar la presencia de SNP que aparecen como picos dobles en el electroferograma, aunque los SNP raros serán más difíciles de detectar.</li>
		</ol></li>
		<li>Diseñar 3-5 RNAs de guía única (sgRNAs), evitando regiones que contengan cualquier SNP identificado anteriormente, siguiendo el protocolo descrito en18.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseño de imprimación HRMA<ol>
<li>Pruebe la secuencia de exones para la posible formación de estructuras secundarias durante la PCR utilizando mFold19.<ol>
<li>Vaya al servidor web unafold | haga clic en mFold | en el menú desplegable, haga clic en Aplicaciones | Forma de plegamiento del ADN.</li>
			<li>Introduzca el nombre de la secuencia en el cuadro y pegue el exón.</li>
			<li>Cambiar la temperatura de plegado a 60 °C; en las condiciones iónicas, cambie [Mg++] a 1.5 y en Unidades cambie a mM; haga clic en Doblar ADN.</li>
			<li>En Salida, debajo de la Estructura 1, haga clic en pdf para abrir las Gráficas de Estructura Circular.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vaya a NCBI Blast - Primer Blast15 para el diseño de imprimación.</li>
		<li>Copie y pegue la secuencia de exones seleccionada determinada por secuenciación en el paso 1.1 (la secuencia que contiene el número más bajo de SNP o ningún SNP) en el cuadro de la parte superior de la página.</li>
		<li>Utilice el símbolo < > para marcar y excluir secuencias que contengan SNP, el sitio de destino y regiones con posible formación de estructura secundaria.</li>
		<li>Seleccione el tamaño del producto de PCR para que esté entre 80 y 150 pb y elija el organismo. NOTA: Los tamaños de fragmento más grandes se pueden usar con éxito (~ 300 bp). Sin embargo, los amplicones más largos pueden disminuir la sensibilidad entre secuencias que difieren en uno o solo unos pocos pares de bases.</li>
		<li>Haga clic en Obtener cartillas. Seleccione 2-3 pares de cebadores para ser probados (idealmente, los sitios de imprimación están a ≥20-50 pb de distancia de cualquier sitio objetivo CRISPR).</li>
	</ol></li>
	<li>Validación de imprimación<ol>
<li>Realizar una PCR de gradiente utilizando gDNA de un solo individuo.<ol>
<li>Prepare una mezcla maestra y retire una muestra para el control sin plantilla (NTC) en un tubo separado. Agregue la plantilla a la mezcla maestra restante y alícuota en una placa de 96 pocillos.</li>
			<li>Siga los parámetros de ciclo: 98 °C 30 s, 34 ciclos de 98 °C durante 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; extensión final de 72 °C durante 10 min.</li>
			<li>Genere perfiles de fusión térmica siguiendo los parámetros: paso de desnaturalización 95 °C durante 1 min, recocido 60 °C durante 1 min, detección de curva de fusión entre 75 °C y 95 °C en incrementos de 0,2 °C, con un tiempo de retención de 10 s a cada temperatura. NOTA: Solo se deben utilizar temperaturas de recocido con un solo perfil de fusión térmica.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Proceder a generar las líneas mutantes con inyecciones embrionarias como se describe en12.</li>
</ol>2. Preparación de ADN genómico de patas de mosquito
<ol><li>Separe los mosquitos G1 por sexo en la etapa de pupa para que no se apareen antes del genotipado, y asegúrese de que los mosquitos de control de tipo silvestre de la misma edad estén disponibles para ser utilizados como referencias y retrocruces. Separarlos por sexo de la misma manera.</li>
	<li>Reúna los materiales necesarios (Figura 2A) y prepare una placa de PCR de 96 pocillos con 0,5 μL del reactivo de liberación de ADN y 20 μL de tampón de dilución (del kit de liberación de gDNA) por individuo a genotipar (Figura 2B) y déjelo en hielo. Reserve dos reacciones para NTC.</li>
	<li>Etiquete una bandeja para viales de mosquitos (viales de Drosophila ) para que cada pocillo en la placa 96 corresponda al vial de mosquito respectivo en la bandeja.</li>
	<li>Anestesiar los mosquitos G1 con CO2 y colocarlos en una placa de Petri de vidrio para mantenerlos sedados (Figura 2C, D). Anestesia y coloca 8 mosquitos de tipo salvaje en una segunda placa de Petri.</li>
	<li>Limpie un par de pinzas con etanol al 70% y retire una de las patas traseras del mosquito (Figura 2E, F).</li>
	<li>Sumerja la pierna en la solución de reactivo de liberación de ADN, coloque el mosquito en el vial correspondiente y ciérrelo con una esponja (Figura 2G,H).</li>
	<li>Limpie las pinzas nuevamente con etanol al 70% y proceda a quitar la pata del siguiente mosquito. Repita los pasos 2.5-2.7 hasta que se complete la placa de 96 pocillos. NOTA: Es importante limpiar las pinzas con etanol al 70%. Esto minimiza la contaminación cruzada de ADN.</li>
	<li>Selle la placa con un sello de placa de PCR óptica (Figura 2I) e incube la placa de 96 pocillos que contiene las patas a temperatura ambiente (RT) durante 2-5 min y luego a 98 °C durante 2 min. Deje que la placa se enfríe a RT mientras prepara la mezcla de PCR. NOTA: Todo el proceso suele durar de 3 a 4 h. Si los mosquitos deben mantenerse en los viales durante más tiempo del esperado (especialmente ≥1 día), coloque un pequeño trozo de pasa (o fuente de azúcar y agua) con cada mosquito para garantizar la supervivencia de los mosquitos durante las incubaciones prolongadas.</li>
</ol>3. HRMA
<ol><li>Realizar PCR.<ol>
<li>Prepare una mezcla maestra que contenga los siguientes componentes por cada reacción: 10 μL de tampón 2x (del kit de liberación de gDNA), 0.5 μM de cada imprimación, 1 μL de colorante EvaGreen, 0.4 μL de polimerasa (del kit de liberación de gDNA) y completa hasta 19 μL con agua de grado molecular.</li>
		<li>Usando una pipeta multicanal, transfiera 19 μL de la mezcla maestra a cada pozo. Transfiera 1 μL de la solución de liberación de ADN que contiene ADN de mosquito preparado en la sección 2 a la placa (Figura 3A). Selle la placa con un sello óptico de placa de PCR.</li>
		<li>Realizar la PCR siguiendo los parámetros de ciclo: 98 °C durante 5 min, 39 ciclos de 98 °C durante 10 s, la temperatura de recocido elegida (72 °C) durante 30 s; extensión final 72 °C durante 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genere perfiles de fusión térmica siguiendo los parámetros: paso de desnaturalización 95 °C durante 1 min, recocido 60 °C durante 1 min, detección de curva de fusión entre 75 °C y 95 °C en incrementos de 0,2 °C, con un tiempo de retención de 10 s a cada temperatura. Consulte el Material suplementario y la Figura suplementaria S1-S5 para obtener una descripción detallada de la configuración del software para la ejecución de HRMA utilizando el sistema en tiempo real CFX96.</li>
	<li>Examinar los perfiles de fusión (Figura 3B). Asigne un control de tipo comodín al clúster de referencia. NOTA: El software (consulte la Tabla de materiales) normaliza automáticamente los datos y designa grupos con colores para diferentes curvas de fusión.</li>
	<li>Marque los diferentes clústeres con los colores correspondientes en la plantilla de 96 pocillos (Figura 3C).</li>
	<li>Seleccione los individuos con curvas de interés, retírelos de los tubos y retrocruce (Figura 3D). Alimente con sangre a las hembras apareadas y recolecte huevos G2 .</li>
</ol>4. Verificación de secuencia por secuenciación de Sanger
<ol><li>Purificar el producto de PCR de los pocillos con mosquitos seleccionados (de la placa preparada en la sección 3.1), utilizando una enzima para degradar los cebadores de PCR residuales, y desfosforilar el exceso de dNTP. Alternativamente, use cualquier kit de limpieza de columnas y proceda a secuenciar las muestras. NOTA: La secuenciación directa puede ser más difícil cuando el tamaño del producto de PCR es pequeño (≤200 pb). En tales casos, diseñe cebadores para amplificar fragmentos más grandes que abarquen el sitio objetivo (≥250 pb) y amplificar mediante PCR utilizando el ADN en la placa de 96 pocillos (paso 2.2).</li>
	<li>Analice e identifique los indels utilizando el software de visor de seguimiento (Figura 4). Alternativamente, el software Poly Peak Parser20 puede ayudar a detectar la mutación en individuos heterocigotos.<ol>
<li>Vaya al sitio web de Poly Peak Parser, seleccione la secuencia de los individuos mutantes en el menú Examinar y copie y pegue la secuencia de referencia en el cuadro. NOTA: La alineación entre el alelo alternativo y la referencia aparecerá automáticamente en el lado derecho de la pantalla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El análisis de fusión de alta resolución ofrece una solución simple y rápida para la identificación de indels generados por la tecnología CRISPR/Cas9 en el mosquito vector Ae. aegypti. Proporciona flexibilidad, permitiendo el genotipado de mosquitos mutados para una amplia gama de genes, desde el músculo de vuelo hasta el metabolismo del hierro y más13,14. La HRMA se puede realizar en solo unas pocas horas desde la recolección de la muestra hasta los aná...

Como vectores de patógenos como los virus del dengue1, Zika2 y chikungunya3, así como de parásitos de la malaria4, los mosquitos representan una amenaza significativa para la salud pública de los seres humanos. Para todas estas enfermedades, hay un enfoque sustancial de la intervención de transmisión en el control de los mosquitos vectores. El estudio de los genes importantes en, por ejemplo, la permisividad a los patógenos, la aptitud de los mosquitos, la supervivencia, la reproducción y la resistencia a los insecticidas es clave para desarrollar nuevas estrategias de control de mosquitos. Para tales fines, la edición del genoma en mosquitos se está convirtiendo en una práctica común, especialmente con el desarrollo de tecnologías como HEs, ZFNs, TALENs y, más recientemente, CRISPR con Cas9. El establecimiento de cepas editadas genéticamente implica el retrocruce de individuos portadores de las mutaciones deseadas durante unas pocas generaciones para minimizar los efectos fuera del objetivo y fundadores (cuello de botella), seguido de cruzar individuos heterocigotos para generar líneas homocigotas o trans-heterocigotas. En ausencia de un marcador dominante, el genotipado molecular es necesario en este proceso porque, en muchos casos, no se pueden detectar rasgos fenotípicos claros para los mutantes heterocigotos.
Aunque la secuenciación es el estándar de oro para la caracterización genotípica, realizar esto en cientos, o posiblemente miles de individuos, plantea costos significativos, mano de obra y tiempo requerido para obtener resultados, lo cual es especialmente crítico para organismos con una vida útil corta, como los mosquitos. Las alternativas más utilizadas son el ensayo de nucleasa Surveyor5 (SNA), el ensayo T7E16 y el análisis de fusión de alta resolución (HRMA, revisado en7). Tanto SNA como T7E1 usan endonucleasas que cortan solo bases no coincidentes. Cuando se amplifica una región mutada del genoma mutante heterocigoto, los fragmentos de ADN de alelos mutantes y de tipo salvaje se recocen para hacer ADN de doble cadena (dsDNA) no coincidente. SNA detecta la presencia de desajustes a través de la digestión con una endonucleasa específica de desajuste y electroforesis simple en gel de agarosa. Alternativamente, HRMA utiliza las propiedades termodinámicas del dsDNA detectadas por los colorantes fluorescentes de unión al dsDNA, con la temperatura de disociación del colorante variando según la presencia y el tipo de mutación. La HRMA se ha utilizado para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)8, genotipado mutante de peces cebra9, aplicaciones microbiológicas10 e investigación fitogenética11, entre otras.
Este artículo describe HRMA, un método simple de genotipado molecular para mosquitos mutantes generados por la tecnología CRISPR / Cas9. Las ventajas de hrMA sobre las técnicas alternativas incluyen 1) flexibilidad, ya que se ha demostrado que es útil para varios genes, una amplia gama de tamaños indel, así como la distinción entre diferentes tamaños de indel y diferenciación heterocigota, homocigota y trans-heterocigota12,13,14, 2) costo, ya que se basa en reactivos de PCR de uso común, y 3) ahorro de tiempo, ya que se puede realizar en tan solo unas horas. Además, el protocolo utiliza una pequeña parte del cuerpo (una pata) como fuente de ADN, lo que permite que el mosquito sobreviva al proceso de genotipado, lo que permite el establecimiento y mantenimiento de líneas mutantes.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>al 70% Solución de etanol al 70% en agua</td></tr><tr><td>Placas de PCR de 96 pocillos y PCR en tiempo real</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td>Para la obtención de ADN genómico (de la pata del mosquito)</td></tr><tr><td>Plantillas</td><td></td><td></td> de placas de 96 pocillos <td>Impreso en casa, para el registro de genotipos</td></tr><tr><td>Bio Rad CFX96</td><td>Máquina de PCR Bio Rad</td><td></td><td>con gradiente y capacidades</td></tr> <tr><td>HRMADepósitos de reactivos biotecnológicos diversificados</td><td>VWR</td><td>490006-896</td><td></td></tr><tr><td>Exo-CIP Kit de limpieza rápida de PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>E1050S</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio</td><td>VWR</td><td>89001-246</td><td>150 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Placas de PCR rígidas de pared delgada de 96 pocillos</td><td>Bio-rad</td><td>HSP9665</td><td>para HRMA</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (P10)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4721</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (P300)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Cinta de sellado de acrilato de poliolefina, Thermo Scientific</td><td>VWR</td><td>37000-548</td><td>Para usar con el 96-pocillos&nbsp; Placas de PCR para la obtención de ADN genómico</td></tr><tr><td>Cinta de sellado óptico</td><td>Bio-rad</td><td>2239444</td><td>Para usar con las placas de PCR con faldón de 96 pocillos para HRMA</td></tr><tr><td>Kit de PCR directo de tejido animal Phire (sin herramientas de muestreo)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F140WH</td><td>Para la obtención de ADN genómico y la realización de PCR</td></tr><tr><td>Divisores de viales de moscas de plástico</td><td>Genesee</td><td>59-128W</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de fusión de precisión</td><td>Bio Rad</td><td>1845025</td><td>Se utiliza para el genotipado de las muestras de ADN de mosquitos y el análisis de las propiedades de desnaturalización térmica del ADN bicatenario (consulte el paso 3.3 del protocolo)</td></tr><tr>Software <td></td><td>SeqMan Pro</td><td>DNAstar Lasergene</td><td>Para la alineación de secuencias múltiples</td></tr><tr><td>Pipeta monocanal</td><td>Pinzas Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 11 cm</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de espuma blanca</td><td>VWR</td><td>60882-189</td><td></td></tr><tr><td>Viales anchos de Drosophila, poliestireno</td><td>Genesee</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja ancha para viales para moscas, azul</td><td>Genesee</td><td>59-164B</td><td></td></tr></tbody></table>

detección indel tras mutagénesis crispr/cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito aedes aegypti

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

La edición de genes de mosquitos se ha convertido en rutina en varios laboratorios con el establecimiento de sistemas como nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y endonucleasas de homing (HE). Más recientemente, la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) ha ofrecido una alternativa más fácil y barata para la ingeniería genómica de precisión. Después de la acción de la nucleasa, las vías de reparación del ADN arreglarán los extremos rotos del ADN, a menudo introduciendo indels. Estas mutaciones fuera de marco se utilizan para comprender la función génica en los organismos objetivo. Un inconveniente, sin embargo, es que los individuos mutantes no llevan un marcador dominante, lo que hace que la identificación y el seguimiento de los alelos mutantes sean un desafío, especialmente a escalas necesarias para muchos experimentos. 
El análisis de fusión de alta resolución (HRMA) es un método simple para identificar variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos y utiliza curvas de fusión por PCR para detectar tales variaciones. Este método de análisis post-PCR utiliza colorantes fluorescentes de doble cadena de unión al ADN con instrumentación que tiene capacidad de captura de datos de control de rampa de temperatura y se escala fácilmente a formatos de placa de 96 pocillos. Aquí se describe un flujo de trabajo simple utilizando HRMA para la detección rápida de indels inducidos por CRISPR / Cas9 y el establecimiento de líneas mutantes en el mosquito Ae. aegypti. Críticamente, todos los pasos se pueden realizar con una pequeña cantidad de tejido de la pierna y no requieren sacrificar el organismo, lo que permite que se realicen cruces genéticos o ensayos de fenotipado después del genotipado.

Los mosquitos que contenían mutaciones en los genes AaeZIP11 (supuesto transportador de hierro21) y myo-fem (un gen de miosina con sesgo femenino relacionado con los músculos de vuelo13) se obtuvieron utilizando la tecnología CRISPR/Cas9, genotipados con HRMA y verificados por secuencia (Figura 5). La Figura 5A y la Figura 5C muestran la intensidad de fluorescencia no...

Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.

Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

Este protocolo es una forma muy simple y eficiente de detectar mutantes generados por la tecnología CRISPR / Cas9 de numerosos individuos. Las dos principales ventajas de esta técnica son que se puede realizar en pocas horas y que es aplicable a multitud de organismos. El diseño de imprimación puede ser un desafío para ciertos genes y se pueden requerir múltiples rondas de diseño y verificación de imprimación para que HRMA sea eficiente.Para realizar una PCR de gradiente, comience por preparar una mezcla maestra. Luego retire 19 microlitros de la mezcla maestra para el control sin plantilla o NTC en una placa de 96 pocillos. A continuación, agregue la plantilla a la mezcla maestra restante.Alícuota 20 microlitros de la mezcla de muestra en la placa de 96 pocillos. Realizar PCR siguiendo los parámetros de ciclo y luego generar los perfiles de fusión térmica utilizando los parámetros mencionados en el manuscrito. Después de reunir todo el material requerido, prepare una mezcla maestra con 0,5 microlitros del reactivo de liberación de ADN y 20 microlitros de tampón de dilución por individuo a genotipar.Usando una pipeta multicanal, alícuota 20 microlitros de la mezcla en una placa de PCR y deje la placa de PCR en hielo. A continuación, coloque los mosquitos G1 anestesiados en una placa de Petri de vidrio para mantenerlos sedados y coloque ocho mosquitos de tipo silvestre en la segunda placa de Petri. Limpie un par de pinzas con etanol al 70% y use las pinzas desinfectadas para eliminar una de las patas traseras de los mosquitos.Luego, sumerja la pierna en la solución de reactivo de liberación de ADN. Coloque el mosquito en el vial correspondiente y cierre el vial con una esponja. Una vez hecho esto, limpie las pinzas con etanol al 70% antes de proceder a quitar la pata del siguiente mosquito hasta que se complete la placa de 96 pocillos.Más tarde, selle la placa con un sello de placa de PCR óptica e incube la placa de PCR que contiene las patas a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos, seguida de la incubación a 98 grados centígrados durante dos minutos. Deje que la placa se enfríe a temperatura ambiente. Para la PCR, prepare una mezcla maestra que contenga los componentes preferidos y luego use una pipeta multicanal para transferir 19 microlitros de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.Después de transferir un microlitro de la solución de liberación de ADN que contiene ADN de mosquito previamente preparado a la placa, selle la placa con un sello de placa de PCR óptica. Realice la PCR con los parámetros de ciclo apropiados para generar perfiles de fusión térmica siguiendo los parámetros descritos en el manuscrito, luego examine los perfiles de fusión asignando un control de tipo salvaje al clúster de referencia. Marque los diferentes clústeres con los colores correspondientes en la plantilla de 96 pocillos.A continuación, seleccione los individuos con curvas de interés y retire los individuos seleccionados de los tubos para cruzar hacia atrás. La alimentación de sangre lo hizo hembras, seguido de la recolección de G2A. En el análisis representativo, se muestra el análisis de secuencia del mutante ZIP11 del Aedes aegypti.El electroferograma de los mutantes heterocigotos Aedes aegypti ZIP11 indicó la posición del nucleótido donde se produjo el indel. El indel está representado por un cambio de picos simples a dobles, ya que las posiciones polimórficas muestran ambos nucleótidos concomitantemente. Al final de la ejecución, el número de pares de bases eliminados o insertados se calculó contando los picos individuales.Los mosquitos que contienen mutaciones en los genes Aedes aegypti ZIP11 y myo-fem fueron genotipados y secuenciados verificados utilizando el análisis de fusión de alta resolución de HRMA. Las señales fluorescentes de las muestras se normalizaron a valores relativos de uno a cero. Además, cada curva se restó de la referencia de tipo salvaje y denotó el aumento correspondiente.En los resultados representativos se muestra una asignación automática de clúster fallida, donde no se hizo una distinción adecuada entre los grupos. Además, cada muestra se analizó individualmente y se asignó a los grupos correctos en función de la similitud con las muestras de referencia de heterocigotos, homocigotos y transheterocigotos. Después de realizar HRMA, es necesario secuenciar el ADN de los individuos mutados para analizar los indels e identificar las otras mutaciones en la secuencia objetivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este video demuestra el papel de la reacción en cadena de la polimerasa por gota digital en la identificación de la mutación indel en una muestra de ADN. La alta precisión y sensibilidad de la ddPCR permite una detección precisa y consistente de mutaciones raras presentes en una muestra, incluso a niveles bajos. Puede identificar y cuantificar mutaciones de indel en diferentes regiones del genoma, proporcionando información valiosa sobre los mecanismos de mutación y las consecuencias...

Reacción en cadena de la polimerasa en gotas digitales para la detección de mutaciones de Indel en genes diana

Este video muestra la reacción en cadena de la polimerasa en gradiente para la optimización de la temperatura de recocido de los cebadores, que establece la temperatura de recocido en gradiente a lo largo de los pocillos. El efecto de las diferentes temperaturas de recocido está determinado por el rendimiento de los productos amplificados que ayuda a optimizar la condición de reacción.

Reacción en cadena de la polimerasa en gradiente para determinar la temperatura óptima de recocido

Este protocolo describe el flujo de trabajo de un gen CRISPR/Cas9 basado en sistema para la reparación de las mutaciones de punto en células de mamíferos. Aquí, utilizamos un enfoque combinatorio gene edición con una detallado seguimiento estrategia experimental para medir la formación de indel en el sitio de destino, en esencia, analizar in situ la mutagénesis.

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Este protocolo proporciona los pasos desde la extracción de ADN hasta la configuración experimental para la PCR digital de gotas (ddPCR), incluido el análisis para la identificación y cuantificación de eventos de unión final no homólogos (NHEJ) en sitios objetivo después de la escisión Cas9 inducida por gRNA y la reparación del ADN. Otros usos de este método incluyen aplicaciones como la detección de polimorfismo y la verificación de variantes de edición de genes.

PCR de gotas digitales para detectar mutaciones de Indels en poblaciones de mosquitos anofelinos modificados genéticamente

En este trabajo describimos un protocolo detallado para la edición del genoma mediante microinyección embrionaria en el mosquito A. aegypti utilizando la tecnología CRISPR-Cas9.

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

codificado genéticamente-histona-miniSOG induce mutaciones hereditarias en todo el genoma de una manera dependiente de la luz azul. Este método de mutagénesis es simple, rápido, libre de productos químicos tóxicos y muy adecuado para la detección genética hacia adelante y la integración del transgén.

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en<em&gt; C. elegans</em

Aprende a detectar mutaciones indel generadas por CRISPR/Cas9 en Aedes aegypti mediante análisis de fusión de alta resolución. Este protocolo eficiente permite identificar mutantes en pocas horas y seleccionar líneas mutantes rápidamente.

Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti

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