Name: Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimum Bilgiyi Karşılamak için Yeniden Üretilebilirliğin Geliştirilmesi 2018 Nanopartikül İzleme Analizinde Kılavuzlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Öğrenin, ekstraselüler vezikül araştırmalarında nanopartikül izleme analizi yöntemiyle tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için NanoSight LM10 protokolünü. Bu yöntem, kullanıcı deneyiminden bağımsız olarak doğru partikül boyutu ve konsantrasyon analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, Kansas eyaleti tarafından Midwest Karşılaştırmalı Kök Hücre Biyolojisi Enstitüsü'ne (MICSCB), Johnson Kanser Araştırma Merkezi'nden MLW'ye ve NIH R21AG066488'den LKC'ye desteklendi. OLS, MICSCB'den GRA desteği aldı. Yazarlar, bu projede kullanılan lipozomları sağladığı için Dr. Santosh Aryal'a ve yararlı konuşmalar ve geri bildirimler için Weiss ve Christenson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyor. Dr. Hong He'ye teknik destek için teşekkür edilir. MLW, Betti Goren Weiss'a desteği ve danışmanlığı için teşekkür eder.

<ol><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Consortium, E. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).</li>
<li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li>
<li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57(2018).</li>
<li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271(2017).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li>
<li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101(2013).</li>
<li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoSight+LM10+Operating+Manual-P550H%22">NanoSight LM10 Operating Manual-P550H</a>. , (2013).</li>
<li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639(2019).</li>
<li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li>
<li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy%2C+flow+cytometry%2C+nanoparticle+tracking+analysis%2C+and+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinde çıkar çatışması yoktur.

Nanopartiküllerin boyutunu ve konsantrasyonunu tahmin etmek için çeşitli yöntemler vardır11. Bunlar, dinamik ışık saçılması (DLS), santrifüjlü çökeltme ve tek parçacık seviyesi analizi-elektron mikroskobu, NTA, atomik kuvvet mikroskobu ve ayarlanabilir dirençli darbe algılama dahil olmak üzere bir popülasyondan boyut tahmini üreten topluluk yöntemlerini içerir. Bunlardan DLS ve NTA, ideal bir ortamda Brownian hareketine dayanan tahribatsız boyut ve konsantrasyon ölçüm yöntemleridir. DLS, ışığın sa...

EV'lerin ve diğer nanometre ölçekli parçacıkların doğru ve tekrarlanabilir analizi, araştırma ve endüstri genelinde çok sayıda zorluk ortaya koymaktadır. EV araştırmasının çoğaltılması, kısmen, veri toplama ile ilişkili gerekli parametrelerin raporlanmasında tekdüzelik olmaması nedeniyle zor olmuştur. Bu eksiklikleri gidermek için ISEV, EV araştırmacıları için asgari bir biyokimyasal, biyofiziksel ve fonksiyonel standartlar kümesi olarak endüstri kılavuzları önerdi ve bunları genellikle MISEV20141 olarak adlandırılan bir pozisyon beyanı olarak yayınladı. EV araştırmasının hızlanan hızı, güncellenmiş bir kılavuz gerektiriyordu ve "MISEV2018: ISEV'in bir pozisyon beyanı", MISEV2014 kılavuzlarınıgenişletti 2. MISEV2018 makalesi, tablolar, önerilen protokollerin ana hatları ve belirli EV ile ilişkili karakterizasyonu belgelemek için izlenecek adımları içeriyordu. Deneylerin yorumlanmasını ve çoğaltılmasını kolaylaştırmak için bir başka önlem olarak, EV-TRACK, EV biyolojisinin ve yayınlanan sonuçlar için kullanılan metodolojinin daha şeffaf bir şekilde raporlanmasını sağlamak için kitle kaynaklı bir bilgi tabanı (http://evtrack.org) olarak geliştirilmiştir3. Yöntemlerin standartlaştırılmış raporlaması için bu önerilere rağmen, alan yayınlanan sonuçların çoğaltılması ve doğrulanması konusunda acı çekmeye devam etmektedir.
Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Bilim Vakfı'nın kalite değerlendirme araçlarına yönelik çabalarına uyan bu makale, ISEV'in veri değerlendirme araçlarının laboratuvarlar arasında sonuçların çoğaltılması amacıyla uygulanabilmesi için yöntemlerin ve ayrıntıların standartlaştırılmış bir şekilde raporlanmasını gerektirdiğini göstermektedir. Hücre kaynaklarının raporlanması, hücre kültürü prosedürleri ve EV izolasyon yöntemleri, EV popülasyonunun niteliklerini tanımlamak için önemli faktörlerdir. NTA cihazları arasında, algılama ayarları, taşıyıcı sıvının kırılma indisi, polidispersiteye katkıda bulunan heterojen parçacık popülasyonları, standartlaştırılmış raporlama gereksinimlerinin eksikliği ve gözlemciler arası ve gözlemciler arası ölçüm sonuçlarının bulunmaması gibi faktörler, laboratuvarlar arasında NTA karşılaştırmasını zorlaştırır veya imkansız hale getirir.
2006'dan beri kullanımda olan NTA, şu anda EV araştırmacılarının yaklaşık% 80'i tarafından kullanılan nanopartikül boyutu ve konsantrasyon tayini için popüler bir yöntemdir4. MISEV2018 Kılavuzları, NTA'nın popüler seçeneklerden biri olduğu iki tür tek vezikül analizi gerektirir. NTA, geniş erişilebilirliği, numune başına düşük maliyeti ve basit kurucu teorisi (Stokes-Einstein denklemi) nedeniyle EV karakterizasyonu için ortak kullanımda olmaya devam etmektedir. NTA tarafından yapılan EV değerlendirmesi, lazer ışık saçılması ve Brownian hareket analizi kullanılarak bir partikül boyutu dağılımı ve konsantrasyon tahmini oluşturur ve alt algılama sınırı EV'nin kırılma indisi tarafından belirlenir. Bilinen viskozite ve sıcaklığa sahip akışkan bir numune kullanıldığında, EV'lerin yörüngeleri, ortalama kare yer değiştirmelerini iki boyutta belirlemek için izlenir. Bu, parçacık difüzyon katsayısının hesaplanmasını ve modifiye edilmiş bir Stokes-Einstein denklemi 5,6,7 ile küreye eşdeğer bir hidrodinamik çapa dönüştürülmesini sağlar. NTA'nın parçacık-parçacık analizi, heterojen bir EV popülasyonundaki aglomeralar veya daha büyük parçacıklar tarafından diğer karakterizasyon yöntemlerinden daha az girişime sahiptir7. Birkaç büyük parçacık boyutlandırma doğruluğu üzerinde minimum etkiye sahip olsa da, küçük miktarlarda büyük, yüksek ışık saçan parçacıkların varlığı, azaltılmış yazılım EV algılama ve izleme8 nedeniyle daha küçük parçacıkların algılanmasında kayda değer bir azalmaya neden olur. Bir ölçüm tekniği olarak, NTA'nın genellikle daha büyük parçacıklara veya parçacık agregalarına karşı önyargılı olmadığı düşünülür, ancak bireysel parçacık analizi9 yoluyla çok boyutlu popülasyonları çözebilir. Parçacıklar tarafından ışık saçılmasının kullanılması nedeniyle, NTA analizinin sınırlamalarından biri, EV'lere kıyasla benzer kırılma ve boyut özelliklerine sahip toz, plastik veya toz gibi herhangi bir partikülün bu karakterizasyon yöntemiyle gerçek EV'lerden ayırt edilememesidir.
NanoSight LM10 (nanopartikül boyutu analizörü) ve LM14 (lazer modülü) 2006'dan beri satılmaktadır ve bu cihazın daha yeni modelleri geliştirilmiş olmasına rağmen, bu özel model birçok temel tesiste bulunur ve güvenilir bir iş gücü olarak kabul edilir. Boyut ve konsantrasyonun yüksek çözünürlüklü ölçümleri için NTA ayarlarını uygun şekilde optimize etmek için eğitim gereklidir. Optimum video kayıtları için gereken iki önemli ayar (1) kamera seviyesi ve (2) algılama eşiğidir. Bunlar, numunenin özelliklerine göre operatör tarafından ayarlanmalıdır. NTA analizinin en önemli kısıtlamalarından biri, 107 ila 109 partikül / mL arasındaki numune konsantrasyonlarının önerilmesidir, bu numune seyreltmesini sağlamak içingerekli olabilir 10. Fosfat tamponlu salin, 0,15 M salin veya ultra saf su gibi seyreltme için kullanılan çözeltiler, NTA ölçümlerini etkileyebilecek 220 μm'den küçük parçacıklardan nadiren arındırılmıştır. Seyreltme için kullanılan çözeltilerin NTA karakterizasyonu, analiz edilen nanopartikül örnekleri ile aynı kamera seviyesinde ve algılama eşiğinde yapılmalıdır. EV numune seyreltmeleri için kullanılan seyrelticilerde bulunan nanopartiküllerin büyüklüğü ve konsantrasyonu, EV'lerin NTA analizini içeren yayınlara nadiren dahil edilir.
Bu protokol, kamera seviyesinin, algılama eşiğinin veya örnek filtrasyonunun NTA veri kümesi üzerindeki sistematik etkilerini analiz etmek için seçilen kamera seviyeleri, algılama eşikleri ve numunelerin mekanik filtrelenmesi kullanılarak değerlendirilen sentetik EV benzeri lipozomların NTA analizini kullanır. Lipozomlar Ek Dosya S1'de açıklandığı gibi sentezlendi. Bu deneyde sentetik lipozomlar, boyut homojenlikleri, fiziksel özellikleri ve 4 ° C'de depolamadaki stabiliteleri nedeniyle kullanılmıştır. EV'lerin gerçek örnekleri kullanılmış olsa da, EV'lerin depolama sırasındaki heterojenliği ve stabilitesi bu çalışmayı ve yorumlanmasını zorlaştırmış olabilir. (A) lipozomlardan ve (B) EV'lerden NTA raporlarındaki benzerlikler, bu makalede lipozomlar için ortaya konan sistematik etkilerin muhtemelen EV karakterizasyonu için de geçerli olacağını göstermektedir (Şekil 1). Bu bulgular birlikte, kritik yazılım ayarlarının tam raporlanmasının ve seyreltici, seyreltme ve filtreleme gibi örnek işlemenin tanımının NTA verilerinin tekrarlanabilirliğini etkilediği fikrini desteklemektedir.
Bu makalenin amacı, NTA ayarlarının (sıcaklık, kamera seviyesi ve algılama eşiği) ve numune hazırlamanın değiştirilmesinin toplanan sonuçları değiştirdiğini göstermektir: sistematik, boyut ve konsantrasyonda önemli farklılıklar elde edilmiştir. NTA, MISEV2018 karakterizasyon spesifikasyonunu yerine getirmek için popüler seçeneklerden biri olduğundan, bu sonuçlar tekrarlanabilirliği sağlamak için numune hazırlama ve NTA ayarlarının raporlanmasının önemini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Şekil 1: Temsilci NTA, lipozomları EV'lerle karşılaştırmak için rapor verir. (A) Lipozomlar: 12 Mart 2020'de NTA'da karakterize edilen filtrelenmemiş numune. (B) EV'ler: 26 Ağustos 2021 tarihinde NTA'da karakterize edilen filtrelenmemiş numune. Kısaltmalar: NTA = Nanopartikül izleme analizi; EV'ler = hücre dışı veziküller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>Otomatik Pipetleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri, Konik, Nunc 15 mL</td><td>Thermo Sci.</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lens Temizleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lens Kağıdı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM-10</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM-14 Lazer Modülü</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NTA Yazılımı Ver. 3.2</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kağıt Havlu Pipet Uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1-200 & L, Filtreli, Steril, Düşük Bağlayıcı BioExpress</td><td></td><td>P -3243-200X</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları, 50-1.000 ve mikro; L, Filtreli, Steril BioExpress</td><td></td><td>P-3243-1250</td><td></td></tr><tr><td>Tuzlu, Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu (Ca veya Mg Yok)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Standartları, Lateks Transfer- 100 nm (3 mL)</td><td>Malvern</td><td>NTA4088</td><td></td></tr><tr><td>Standartları, Lateks Transfer- 50 nm&nbsp; (3 mL)</td><td>Malvern</td><td>NTA4087</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi, 33 mm, .22 & m, MCE, Steril</td><td>Fisher marka</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, TB, 1 mL, kayma ucu</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Atık sıvı kabı</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hücre dışı vezikül Çalışmaları için minimum bilgiyi karşılamak için yeniden Üretilebilirliğin geliştirilmesi 2018 nanopartikül İzleme analizinde kılavuzlar

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanopartikül izleme analizi (NTA), 2006 yılından bu yana hücre dışı vezikül (EV) araştırmaları için kullanılan çeşitli karakterizasyon yöntemlerinden biri olmuştur. Birçoğu, NTA cihazlarının ve yazılım paketlerinin minimum eğitimin ardından kolayca kullanılabileceğini ve boyut kalibrasyonunun şirket içinde mümkün olduğunu düşünmektedir. Hem NTA edinimi hem de yazılım analizi EV karakterizasyonunu oluşturduğundan, Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018'de (MISEV2018) ele alınmıştır. Ek olarak, EV deneylerinin sağlamlığını artırmak için Şeffaf Raporlama ve Hücre Dışı Vezikül Araştırmalarında Merkezi Bilgi (EV-TRACK) tarafından izlenmiştir (örneğin, kontrolsüz faktörler nedeniyle deneysel varyasyonu en aza indirmek).
Yöntemlerin ve kontrollerin raporlanmasını teşvik etme çabalarına rağmen, yayınlanan birçok araştırma makalesi, orijinal NTA gözlemlerini çoğaltmak için gereken kritik ayarları rapor etmede başarısız olmaktadır. Çok az sayıda makale, negatif kontrollerin veya seyrelticilerin NTA karakterizasyonunu, fosfat tamponlu salin veya ultra saf damıtılmış su gibi ticari olarak temin edilebilen ürünlerin partikülsüz olduğunu varsayarak açıkça bildirmektedir. Benzer şekilde, pozitif kontroller veya boyut standartları, parçacık boyutlandırmasını doğrulamak için araştırmacılar tarafından nadiren rapor edilir. Stokes-Einstein denklemi, parçacık yer değiştirmesini belirlemek için numune viskozitesini ve sıcaklık değişkenlerini içerir. Bu nedenle, tüm numune video toplama işlemi sırasında kararlı lazer odası sıcaklığının raporlanması, doğru replikasyon için önemli bir kontrol ölçüsüdür. Numunelerin veya seyrelticilerin filtrasyonu da rutin olarak rapor edilmez ve eğer öyleyse, filtrenin özellikleri (üretici, membran malzemesi, gözenek boyutu) ve depolama koşulları nadiren dahil edilir. Uluslararası Hücre Dışı Vezikül Derneği'nin (ISEV) kabul edilebilir deneysel ayrıntıların asgari standartları, EV'lerin karakterizasyonu için iyi belgelenmiş bir NTA protokolü içermelidir. Aşağıdaki deney, bireysel araştırmacı tarafından bir NTA analiz protokolünün oluşturulması gerektiğine ve tek vezikül karakterizasyonu için MISEV2018 gereksinimlerini yerine getirme seçeneklerinden biri olarak NTA karakterizasyonunu kullanan yayın yöntemlerine dahil edilmesi gerektiğine dair kanıtlar sunmaktadır.

Tablo 1 , lipozom örnekleri (18 filtrelenmiş ve 18 filtrelenmemiş) ve temsili bir DPBS seyreltici için NTA videolarının sonuçlarını içermektedir. Bu yazıda kamera seviyesi veya algılama eşiğinden bağımsız olarak iki grup arasındaki karşılaştırmalar tamamlanmıştır. Filtrelenmiş numunelerin ortalama parçacık çapı 108.5 nm, parçacık modu 86.2 nm ve konsantrasyonu 7.4 × 108 parçacık/mL idi. Buna karşılık, filtrelenmemiş numunelerin ortalama parçacık çapı 159.1 nm, parçacık modu 105.7 nm ve 7.6 × 1...

Nanopartikül izleme analizi (NTA), hücre dışı vezikülleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu makale, NTA deneysel parametrelerini ve kontrollerini ve ayrıca MISEV2018 ve EV-TRACK tarafından laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik için önerilen kılavuzları desteklemek için gerekli numunelerin ve seyrelticilerin tek tip bir analiz ve karakterizasyon yöntemini vurgulamaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimum Bilgiyi Karşılamak için Yeniden Üretilebilirliğin Geliştirilmesi 2018 Nanopartikül İzleme Analizinde Kılavuzlar

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Bu protokol, NanoSight LM10'un acemi operatörleri için geliştirilmiştir. Adım adım talimatları izleyerek, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilebilir. Bu teknik, kullanıcının beceri düzeyinden bağımsız olarak birden fazla deneme çalıştırmasında tutarlı sonuçlar elde edilmesine yardımcı olur.Nanopartikül karakterizasyonu, özellikle nicelleştirme, hücre dışı vezikül araştırma alanında bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu protokol, süspansiyondaki nanopartiküllerin tutarlı bir boyut ve konsantrasyon analizine izin verir. Lazer Modül'ün cam yüzeylerini kaliteli bir lens temizleyici ve lens kağıdı ile temizleyerek başlayın.Modülün montajından önce, O-ring contasının akış hücresi kapağının oluğuna düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun. Ardından, akış hücresi kapağını lazer modülünün üzerine yerleştirin ve elektrik kontaklarının doğru yönde olduğundan emin olun. Ardından, dört yaylı başparmak vidasını akış hücresi plakasından geçirin ve lazer modülünün dişlerini ayrı ayrı sıkmadan takın.Akış hücresi kapağına eşit basınç uygularken, başparmak vidalarını sıkışana kadar alternatif çapraz bir şekilde düzgün bir şekilde sıkın. İki adet bir mililitrelik tüberkülin şırıngasını bir mililitre DPBS ile üç kez kayar kilit adaptörleriyle yıkayın. Şırıngayı boş bir seyreltici veya numune rezervuarı olarak hizmet etmek üzere kalan porta yerleştirmeden önce pistonu ilk tüberkülin şırıngasından çıkarın ve atın.Ardından ikinci şırıngayı bir mililitre DPBS ile doldurun ve akış hücresi kapağının giriş portuna takın. DPBS lazer modülüne yavaşça enjekte edilirken havanın odadan temizlenmesini sağlamak için lazer modülünü çıkış şırınga portu yükseltilmiş olarak eğin önünde tutun. Giriş bağlantı noktasına bir mililitre hava enjekte ederek kalan DPBS'leri lazer modülden yıkayın.Kızarma işlemini iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, lazer modülünü mümkün olduğunca tamamen boşaltın ve odaklama ve konumlandırma için modülü yükleyin. Yazılımı açın.Sol üst köşedeki kutudaki yakalama sekmesinin altında, kamerayı başlat'ı tıklatın. Kamera beş dakika sonra otomatik olarak kapanırsa, yeniden başlatmak için kamerayı başlat'ı tıklatın. Aynı sekmede, lazer çizgisini aydınlatmak ve parçacık tanımlamayı ve odaklamayı basitleştirmek için kamera seviyesini 14 ila 16 olarak ayarlayın.Kafa parçasının sol tarafındaki üst kaydırıcıyı içeri veya dışarı hareket ettirerek, görüntüyü kameradan göz merceklerine yönlendirin. Görüş alanında, parmak izi ve merkez olarak adlandırılan artan yoğunluk alanını bulun ve parmak izini dikey olarak odaklayın. Görüş alanında, lazer çizgisini ortalayın, ardından ışığı bilgisayar ekranında gözlemlendiği gibi kameraya yönlendirmek için üst kaydırıcıyı hareket ettirin.Bilgisayar ekranındaki görüntü, mikroskop göz merceklerindeki görünümden bir ayna görüntüsüdür. Netleme düğmesiyle ekrandaki tek tek hareket eden parçacıkların görüntüsünü keskinleştirmek için odağı ayarlayın. Numuneleri yüklemek için, numunenin bir mililitresini durulanmış bir mililitre tüberkülin şırıngasına çekin ve şırıngayı akış hücresi kapağının giriş portuna takın.Çıkış portuna bağlı açık şırıngada sıvı belirginleşene kadar pistonu ilerletmeye devam edin. Modül, lazer modülünden havanın temizlenmesini sağlamak için eğilmelidir. Kamera görünümünde, odağı lazer çizgisinin sağında, eşit sayıda parçacıktan oluşan bir alana taşıyın.Yatay ışık bantlarını ortalamak için dikey yönü ayarlayın ve en yüksek sayıda parçacık görünene kadar yeniden odaklanın. Sonraki tüm önlemler için odağın konumunu tutarlı tuttuğunuzdan emin olun. Kamera seviyesini, karanlık bilgi sembolünün kamera görünümünün sağ üst köşesinde aralıklı olarak yanıp söneceği şekilde ayarlayın.Nanopartikül izleme analizi veya NTA için, süreyi 30 veya 60 saniyeye ve video sayısını beş olarak ayarlayın. Varolan temel dosya adını değiştirmek için, yeni bir dosya adıyla oluşturulan veriler için yeni bir depolama sitesinin sekmesini tıklatın. Ardından, istenen sıcaklığı girmek için hedef sıcaklık kutusunu işaretleyin ve standart ölçümü yeniden kullanmak için komut dosyası oluştur'a tıklayın.Örnek yüklendikten ve deneme çalışmaya hazır olduğunda, komut dosyası oluştur ve çalıştır'ı tıklayın. Rapor ayrıntılarını ayarla açılır ekranında, alanları işleç, numune ve seyreltici hakkında gerekli bilgilerle doldurun. İstenen tüm alanlar doldurulduğunda, komut dosyasını başlatmak için ayarlar Tamam'ı tıklatın.Her video çekiminden önce, pistonu manuel olarak ilerletmek için bir istem arayın. Numunenin yaklaşık 0.05 mililitresini lazer odasına enjekte edin. Parçacıklar dinlenmeye başladığında, Tamam'ı tıklatın. Beşinci video çekimini tamamladıktan sonra, işlem kutusuyla birlikte bir ayar onay kutusu görünecektir.Kareler video ekranının altından manuel olarak ilerletildiğinden, ekranda parçacık oluşturan mavi haçların sayısına dikkat edin ve numunenin işlenmesi için algılama eşiğini ayarlayın. Tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildirimi görüntülenmeden önce videoların sonuçların histogramında otomatik olarak işlenmesini bekleyin, ardından Tamam'a basın. Dışa aktarma ayarları kutusu göründükten sonra, dışa aktar'ı tıklatarak sonuçları kaydedin. Geçerli denemede listelenen yakalama videolarının beşini de vurgulayın.Ardından, seçilen dosyaları işle'yi tıklayın ve algılama eşiğini değiştirmek için işlem kutusunda ayar onay kutusunun yanıp sönmesini bekleyin, ardından algılama eşiğini istediğiniz düzeye ayarlayın ve ayara gidin ve Tamam'ı tıklayın. Videolar, sonuçların histogramında otomatik olarak işlenecek ve tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildirimi görüntülenecektir. Temsili analiz, lipozom örnekleri için nanoizleme analizinin sonuçları veya NTA ve temsili bir DPBS seyrelticisi OK.In tıklayın. Filtrelenmiş numunelerin ortalama parçacık çapı 108 nanometre ve mililitre başına sekizinci parçacıklara 7.4 kat 10 konsantrasyonu vardı.Buna karşılık, filtrelenmemiş numunelerin ortalama parçacık çapı 159 nanometre ve mililitre başına sekizinci parçacıklara 7.6 çarpı 10 konsantrasyonu vardı. Birleşik kamera seviyelerinde, algılama eşiği ikiden beşe çıkarıldıkça, ortalama ve mod partikül boyutu, filtrelenmiş numunelerin partikül boyutlarında önemli bir düşüş gösterdi. Algılama eşiği artırıldıkça birleşik kamera seviyelerindeki parçacık konsantrasyonları azaltıldı.Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler arasında partikül konsantrasyonlarında anlamlı bir fark tespit edilmemiştir. Kombine algılama eşiklerinde, kamera seviyesi 12'den 14'e yükseldikçe, filtrelenmiş numunelerin ortalama ve mod parçacık boyutunda bir azalma kaydedildi. Kombine algılama eşiklerindeki parçacık konsantrasyonları, kamera seviyeleri 12'den 14'e yükseldikçe arttı.Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş örnekler arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Doğru görüntüleme alanını bulmak için 4.1 ile 5.2 arasındaki adımlar önemlidir. Birden fazla deneme çalıştırmasında tutarlı sonuçlar elde etmek, bu tekrarlanabilir beceriye bağlıdır.Dinamik ışık saçılması genellikle nanopartikül izleme analizine eşlik etmek için öncelikle parçacıkların yüzey yükü olan zeta potansiyelini elde etmek için kullanılır. Nanopartikül analizi için NTA, hücre dışı vezikül araştırmaları için yararlı olan parçacıkların nicelleştirilmesinde çok değerli bir yöntem olmaya devam etmektedir.

improving-reproducibility-to-meet-minimal-information-for-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Bu makalede eksozomların tam kandan izolasyonu ve yarı otomatik bir alet kullanılarak nanopartikül izleme ile daha fazla analiz için bir yöntem sunulmaktadır. Sunulan teknoloji, sıvı süspansiyondaki partikülleri görselleştirmek ve analiz etmek için son derece hassas bir yöntem sağlar.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Hücre dışı veziküller koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser ilaç uygulaması veya rejeneratif tıpta potansiyel terapötik maddeler dahil olmak üzere, fizyolojik ve patalojik sürece, önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokol ayarlanabilir direnç darbe algılama kullanarak çeşitli sıvıların izole ve izole olmayan hücre dışı veziküllerin miktar ve boyut karakterizasyonu için yöntemler sunar.

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Hastalıklı ve malign hücreler için dış türev biomarkerlerin klinik çevirisi, hızlı ve doğru ölçme yöntemlerinin olmaması ile engellenmiştir. Bu raporda, küçük hacimli serum veya plazma örneklerindeki belirli dış alt türleri ölçmek için düşük büyütme koyu alan mikroskop görüntülerinin kullanımı açıklanmaktadır.

Tümör türevi Exosomes ölçmek için Nanoplasmon-gelişmiş saçılma ve düşük büyütme mikroskop görüntüleme kullanma

Burada açıklanan protokol, nanopartikül izleme analizi (NTA) ile sulu ortamda küresel nanopartiküllerin, daha spesifik olarak altın nanopartiküllerin hidrodinamik çapını ölçmeyi amaçlamaktadır. İkincisi, Brownian hareketi nedeniyle parçacıkların hareketini izlemeyi ve hidrodinamik çapı elde etmek için Stokes-Einstein denklemini uygulamayı içerir.

Laboratuvarlar Arası Karşılaştırma yoluyla Sulu Medyada Altın Nanopartiküllerin Nanopartikül Takip Analizi

Fare perigonadal yağ dokusundan ve insan plazmasından izole edilmiş hücre dışı veznelerin boyut dağılımını ve toplam partikül konsantrasyonu tahmin etmek için yeni bir nanopartikül izleme analiz aracının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

En yeni nesil EV karakterizasyon araçları, aynı anda birden fazla parametre arasında tek EV analizi yapabilir. Nano-akış sitometrisi, etiketleme yapmadan 45 nm'den büyük tüm biyolojik parçacıkları ölçer ve çeşitli floresan etiketleme teknikleriyle alt popülasyonların spesifik özelliklerini tanımlar.

Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Öğrenin, ekstraselüler vezikül araştırmalarında nanopartikül izleme analizi yöntemiyle tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için NanoSight LM10 protokolünü. Bu yöntem, kullanıcı deneyiminden bağımsız olarak doğru partikül boyutu ve konsantrasyon analizi sağlar.

Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimum Bilgiyi Karşılamak için Yeniden Üretilebilirliğin Geliştirilmesi 2018 Nanopartikül İzleme Analizinde Kılavuzlar (Video) | JoVE Journal

Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimum Bilgiyi Karşılamak için Yeniden Üretilebilirliğin Geliştirilmesi 2018 Nanopartikül İzleme Analizinde Kılavuzlar

Daha fazla video keşfet