Collecte, expansion et différenciation de modèles de cellules épithéliales nasales nasales humaines primaires pour la quantification de la fréquence des battements de cils

Nous décrivons la collecte de cellules souches des voies respiratoires de la muqueuse nasale. Ces cellules sont dilatées et différenciées en un épithélium pseudostratifié en laboratoire. Il s’agit d’une expansion et d’une différenciation in vitro, qui sont similaires à nos voies respiratoires in vivo, ce qui signifie qu’il existe des cellules spécialisées, telles que les cellules ciliées, qui peuvent être utilisées pour quantifier la fréquence des battements de cils.

Pour permettre une quantification cohérente et reproductible de la fréquence des battements de cils entre différents individus et en réponse à différents médicaments, nous standardisons les conditions de culture et l’acquisition d’images. Les mesures de la fréquence des battements de cils sont utilisées comme outils cliniques dans des maladies telles que la dyskinésie ciliaire primitive. Nous espérons établir cela comme un marqueur clinique de la fibrose kystique.

Katelin Allan et Laura Fawcett, doctorantes de mon laboratoire, et la Dre Sharon Wong, postdoctorante de mon laboratoire, font la démonstration de la procédure. Commencez par demander au participant de respirer par la bouche. Ensuite, en prenant une brosse cytologique dans la main dominante et en posant le cinquième doigt sur le menton du participant pour ancrer la main, insérez la brosse cytologique dans le passage nasal du participant à un angle de 45 degrés par rapport au visage du participant et passez-la à travers le méat nasal.

Après avoir fait pivoter la brosse vers le haut, de sorte qu’elle soit perpendiculaire au visage du participant, avancez la brosse doucement, mais fermement, contre la paroi latérale du nez sous le cornet inférieur jusqu’à ce qu’elle soit à la partie moyenne à postérieure du turbiné inférieur. Faites pivoter la brosse de 360 degrés jusqu’à trois fois. Ensuite, retirez-le doucement, en inversant la manœuvre d’insertion, afin que les cellules ne soient pas délogées de la brosse.

Placez la brosse dans le tube de collecte préparé avec le milieu de collecte de cellules nasales et placez le tube de collecte sur de la glace. Après un léger vortex pour déloger les cellules de la brosse, transférez le tube de collecte sur la glace dans l’enceinte de biosécurité. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer le média du tube de prélèvement vers un nouveau tube, en laissant derrière lui les brosses cytologiques.

Ensuite, centrifuger l’échantillon. Après centrifugation, remettre en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de milieu cellulaire de reprogrammation conditionnelle. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, passez les cellules à travers un tamis cellulaire placé sur un tube de 50 millilitres dans un mouvement circulaire.

Pour obtenir une suspension à une seule cellule, récupérez la suspension au fond du tube et passez-la plusieurs fois à travers le tamis. Ensuite, jetez le tamis cellulaire. Pour ensemencer les cellules épithéliales des voies respiratoires sur les inserts de support perméables préparés, mélangez bien les cellules sans créer de bulles, en veillant à ce qu’elles soient homogènes et en suspension.

Ajoutez ensuite 150 microlitres de la suspension cellulaire à la face apicale des inserts de support perméables préparés. Pour différencier les cellules épithéliales des voies respiratoires à l’interface air-liquide, cultivez-les en différenciation, ou milieu ALI pendant deux jours. Ensuite, aspirez le média et ajoutez 750 microlitres de média ALI uniquement dans le compartiment basal pour créer une interface air-liquide.

Pour ensemencer les cellules épithéliales des voies respiratoires dans les dômes ECM, remettre en suspension les cellules épithéliales dissociées des voies respiratoires avec le volume approprié de 90% ECM. Ensuite, en tenant la pipette verticalement à un angle de 90 degrés aussi près que possible du fond du puits, distribuez 50 microlitres de la suspension de cellules ECM au centre du puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes jusqu’à ce que l’ECM se solidifie.

Pendant que l’ECM se solidifie, réchauffer le milieu d’ensemencement organoïde des voies respiratoires, ou AOSM, à température ambiante pour l’empêcher de provoquer une reliquéfaction et une désintégration du dôme ECM lors de l’ajout. Après l’incubation, ajoutez 500 microlitres d’AOSM chauffés à chaque puits en distribuant le long de la paroi du puits. Ne pipette pas le média directement sur le dôme ECM.

Changez le support tous les deux jours pendant quatre à sept jours. Pour aspirer le média, inclinez la plaque à un angle de 45 degrés et aspirez à partir du bord inférieur du puits, loin du dôme ECM. Après quatre à sept jours, initier la différenciation organoïde en ajoutant 500 microlitres de milieux de différenciation organoïdes des voies respiratoires chauffés, ou AODM, à chaque puits, et changer de milieu tous les deux jours pendant sept jours.

Placez la plaque de culture contenant les modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires dans l’insert de la plaque de microscope et fermez la chambre environnementale du microscope. Laisser l’échantillon s’équilibrer dans la chambre de microscope préchauffée à 37 degrés Celsius et remplie à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. À l’oculaire du microscope, concentrez-vous sur le modèle cellulaire.

Ensuite, à l’aide du logiciel d’acquisition, cliquez sur L100 pour basculer le chemin de la lumière vers le port où la caméra est montée. Cliquez sur le bouton vert Lecture pour visualiser le champ de vision du microscope via le logiciel. Vérifiez que les cils sont au point et ajustez-les si nécessaire.

Pour acquérir des images time-lapse à partir du menu, cliquez sur Acquérir, puis sur Fast TimeLapse. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez un emplacement d’enregistrement et un nom de fichier, acquérir 1 000 images. Pour prévisualiser les cils dans le champ de vision du microscope, cliquez sur Appliquer, puis sur le bouton vert Lecture.

Ajustez la mise au point Z si nécessaire. Cliquez ensuite sur Exécuter maintenant pour capturer le Fast TimeLapse. Après avoir installé les logiciels et les boîtes à outils nécessaires, copiez les scripts d’analyse personnalisés appropriés et le dossier des scripts de support sur le lecteur local de l’ordinateur.

Ensuite, sur le logiciel informatique, cliquez sur l’onglet Accueil, puis sur Set Path (Définir le chemin). Dans la fenêtre pop-up, cliquez sur Ajouter avec des sous-dossiers. Sous le chemin de recherche MATLAB, sélectionnez le dossier affiché.

Cliquez ensuite sur Enregistrer et fermer. Vérifiez que les scripts d’analyse sont liés au logiciel informatique en vérifiant qu’ils apparaissent dans le panneau de gauche. Ensuite, transférez les exemples de fichiers image bruts acquis sur le lecteur local de l’ordinateur.

Cliquez ensuite sur le BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m fichier de script d’analyse dans le logiciel informatique. Pour exécuter le script, cliquez sur l’onglet Éditeur, suivi du bouton vert Lecture.

Dans la fenêtre d’invite qui s’affiche, sélectionnez les fichiers image bruts à analyser. Entrez le temps d’exposition pour le temps d’acquisition par image. Cliquez ensuite sur OK. Exécutez GetFirstAmplitude.

m sur le dossier qui contient les fichiers AveSpectrum. Attendez que le script génère le FirstAmplitudeStacked. XLSX, qui contient la fréquence d’amplitude la plus élevée et se situe dans la plage physiologique des battements des cils épithéliaux des voies respiratoires.

Copiez les valeurs de fréquence de FirstAmplitudeStacked. XLSX et tracez-les à l’aide d’un logiciel d’analyse scientifique. Les résultats de la fréquence des battements de cils mesurée dans des modèles d’ALI de cellules épithéliales des voies respiratoires dérivés de trois participants atteints de mucoviscidose et de trois participants témoins sains sont présentés.

Au jour 14 de la différenciation culturelle, des cils battus étaient présents. À partir du jour 14, jour 21 de la différenciation des cultures, aucune augmentation statistiquement significative de la fréquence des battements de cils n’a été observée entre les cohortes. Au jour 21 de la différenciation de la culture, la fréquence moyenne des battements de cils chez les participants témoins en bonne santé était significativement plus élevée que celle des participants atteints de mucoviscidose.

De plus, lorsque la fréquence des battements de cils a été imagée dans les mêmes modèles cellulaires après l’élimination du mucus, il y avait une augmentation statistiquement significative de la fréquence des battements de cils lorsque le mucus était éliminé dans les modèles d’ALI des personnes en bonne santé et des personnes atteintes de fibrose kystique. L’environnement d’imagerie doit être strictement réglementé, car la fonction des cils est extrêmement sensible aux changements des facteurs environnementaux. Cette plateforme a le potentiel d’être établie pour le dépistage de médicaments spécifiques aux patients afin de pouvoir identifier les médicaments qui modulent la fonction CFTR.