Name: Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés dérivés de cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez la génération d'organoïdes cardiaques humains à partir de cellules souches pluripotentes. Cette méthode en trois étapes produit des tissus cardiaques complexes pour modéliser les maladies cardiovasculaires et le dépistage pharmacologique.

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Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous les numéros de prix K01HL135464 et R01HL151505 et par l’American Heart Association sous le numéro de prix 19IPLOI34660342. Nous tenons à remercier le noyau de microscopie avancée de MSU et le Dr William Jackson du département de pharmacologie et de toxicologie de MSU pour l’accès aux microscopes confocaux, au noyau de microscopie IQ et au noyau de génomique MSU pour les services de séquençage. Nous tenons également à remercier tous les membres du Laboratoire Aguirre pour leurs précieux commentaires et conseils.

1. Culture et maintenance des CSEh
REMARQUE: Les CSP d’origine humaine (hiPSC) ou les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) doivent être cultivées pendant au moins 2 passages consécutifs après décongélation avant d’être utilisées pour générer des EB en vue de leur différenciation ou d’une cryoconservation ultérieure. Les cSEh sont cultivés dans un milieu PSC (voir le Tableau des matériaux) sur des plaques de culture à 6 puits revêtues de matrice extracellulaire de membrane sous-basale (BM-ECM). Lorsque vous effectuez des changements de milieu sur des CSEh dans des plaques à 6 puits, ajoutez le milieu directement à l’intérieur du puits plutôt que directement sur les cellules pour éviter le détachement ou le stress indésirable des cellules. Les utilisateurs doivent se méfier des milieux PSC préchauffés qui ne doivent pas être réchauffés à 37 °C; tous les supports PSC utilisés dans ce protocole étaient thermostables.
<ol><li>Pour recouvrir les plaques de puits avec le BM-ECM, décongeler une aliquote du BM-ECM (stockée à -20 °C selon les instructions du fabricant) sur de la glace et mélanger 0,5 mg du BM-ECM avec 12 mL de milieu Eagle’s modifié du Dulbecco froid (DMEM)/F12 (stocké à 4 °C). Répartir 2 mL du mélange DMEM/F12-BM-ECM sur chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant au moins 2 h.</li>
	<li>Pour décongeler les cellules, tout d’abord, décongelez le criovial hPSC dans une perle ou un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 minutes jusqu’à ce que seule une petite quantité de glace soit visible. Transférer les cellules décongelées dans un tube de centrifugeuse et ajouter lentement 8 à 9 mL du milieu PSC complété par 2 μM de l’inhibiteur de ROCK, la thiazovivine (Thiaz), et centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu PSC complété par 2 μM de Thiaz. Répartir les cellules dans le milieu de culture dans 1-2 puits en fonction de la concentration de cellules cryoviales et de la culture à 37 °C, 5% de CO2 pendant 24 h avant de changer le milieu PSC.</li>
	<li>Changez le milieu sur les cellules à des intervalles de 48 heures. Effectuez des lavages et des changements de milieu à l’aide de DMEM/F12 (1 mL/puits) et du milieu PSC (2 mL/puits), respectivement. REMARQUE: Les lavages aident à éliminer les déchets cellulaires et les débris, tandis que les changements de milieux frais fournissent aux cellules une source renouvelée de nutriments.</li>
	<li>Passage des cellules sur sous-fluidité (60-80% confluent) en aspirant le milieu, puis en lavant chaque puits avec 1 mL de 1x solution tamponnée au phosphate de Dulbecco (pas de calcium, pas de magnésium; DPBS). Aspirer le DPBS et ajouter 1 mL du réactif de dissociation pour les hPSC (voir le tableau des matériaux), suivi de l’aspiration de tous les films du réactif sauf un film mince après 10 s.</li>
	<li>Incuber pendant 2 à 5 minutes avec le film mince du réactif de dissociation pour les CSEh jusqu’à ce que des espaces se forment entre les cellules. REMARQUE: Le temps d’arrêt de la dissociation dépend de la lignée cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 1 mL du milieu PSC complété par 2 μM de Thiaz (milieu PSC + Thiaz) au puits et tapoter doucement la plaque pour induire le détachement cellulaire. Pipeter les cellules détachées dans le milieu 1-2 fois pour briser les grandes colonies, et remettre en suspension les cellules dans le milieu PSC + Thiaz dans un rapport de puits 1: 6 (cellules de 1 puits remises en suspension dans 12 mL de milieu de culture). Replaquez les cellules sur des puits revêtus de BM-ECM.</li>
</ol>2. Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés en 3D
<ol><li>Formation du corps embryoïde (EB) : REMARQUE: Il est impératif de limiter les cellules différenciées observables avant la formation du corps embryoïde. Deux à trois puits d’une plaque de 6 puits à une confluence de 60 à 80% produiront suffisamment de cellules pour une seule plaque d’organoïdes de 96 puits. Tous les milieux doivent être alicités et réchauffés dans une perle ou un bain-marie à 37 °C avant tout changement de milieu afin de minimiser le choc thermique sur les EB ou les organoïdes (cela n’inclut pas les réactifs de dissociation cellulaire). Voir figure 1A,B.<ol>
<li>Jour -2<ol>
<li>Pour créer des EB, le jour -2, lavez les CSEh sous-confluents (60-80% confluents) avec du DPBS pendant au moins 10 s pour laver les débris cellulaires et aspirer le DPBS.</li>
			<li>Pour détacher les cellules et les libérer dans un état unicellulaire, ajoutez 1 mL de réactif de dissociation cellulaire à température ambiante (voir le tableau des matériaux) à chaque puits pendant 3 à 6 minutes. Tapotez doucement la plaque ~ 5 fois par minute pour induire un détachement tout en vérifiant au microscope. Ajouter 1 mL de milieu PSC + Thiaz pour arrêter la réaction.</li>
			<li>Pour collecter les cellules et briser les agrégats restants, pipettez le média de haut en bas dans le puits 2 à 3 fois pour générer une suspension à cellule unique. Transférer la suspension monocellulaire dans un tube de centrifugeuse et tourner pendant 5 min à 300 × g.</li>
			<li>Pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu PSC + Thiaz. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémocytomètre et diluez les cellules dans le milieu PSC + Thiaz à une concentration de 100 000 cellules / mL.</li>
			<li>Pour distribuer les cellules pour la formation d’EB, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 μL (10 000 cellules) à chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond rond ultra-faible. Centrifuger la plaque à 100 × g pendant 3 min et incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jour -1<ol>
<li>Retirer délicatement 50 μL de milieu de chaque puits et ajouter 200 μL de milieu frais de CSP réchauffé à 37 °C pour obtenir un volume final de 250 μL par puits. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2. REMARQUE: Retirer et ajouter soigneusement le milieu sur le côté du puits pour éviter de déranger les EB au fond du puits. En raison de la nature délicate des EB et de la culture en suspension, il est nécessaire de laisser un petit volume de liquide dans chaque puits lors du changement de milieu pour éviter de perturber les EB.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Différenciation des organoïdes cardiaques humains (hHO) : REMARQUE: Tous les supports doivent être réchauffés dans un bain-marie ou un bain-marie à 37 °C avant tout changement de support. Retirer et ajouter soigneusement le milieu sur le côté du puits pour éviter de perturber les organoïdes en développement au fond du puits. Les lavages ne sont pas nécessaires entre les changements de milieu pour minimiser l’agitation et permettre l’élimination progressive des inhibiteurs et des facteurs de croissance. RPMI avec supplément de B-27 à 2% (Table des matériaux) a été utilisé tout au long du protocole de différenciation. Le supplément de B-27 contient de l’insuline sauf indication contraire (sans insuline dans les jours 0-5). Voir la figure 1C.<ol>
<li>Jour 0<ol>
<li>Pour amorcer la différenciation vers une lignée mésodermique, retirer 166 μL de milieu de chaque puits (~2/3e du volume total du puits) et ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant un supplément de B-27 sans insuline, 6 μM CHIR99021, 1,875 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et 1,5 ng/mL d’activine A pour une concentration finale de puits de 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4 et 1 ng/mL d’Activine A. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jour 1<ol>
<li>Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais avec un supplément de B-27 sans insuline. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jour 2<ol>
<li>Pour induire la spécification du mésoderme cardiaque, retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant un supplément de B-27 sans insuline et 3 μM Wnt-C59 pour une concentration finale du puits de 2 μM Wnt-C59. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jour 4<ol>
<li>Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais avec un supplément de B-27 sans insuline. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jour 6<ol>
<li>Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 avec le supplément de B-27. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jour 7<ol>
<li>Pour induire une différenciation proépicardique, retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27 et 3 μM de CHIR99021 pour une concentration finale de puits de 2 μM CHIR99021. Incuber pendant 1 h à 37 °C, 5% de CO2.</li>
			<li>Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de CO2. REMARQUE: Une prudence supplémentaire est recommandée à ce deuxième changement de milieu le jour 7 car les organoïdes sont plus enclins au mouvement en raison des changements de média.</li>
			<li>À partir du jour 7 jusqu’à la collecte ou le transfert pour analyse ou expérimentation, effectuer des changements de milieu toutes les 48 h en retirant 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27. REMARQUE: Les organoïdes sont prêts pour les analyses et l’expérimentation au jour 15, sauf si des stades de développement plus précoces sont intéressants. Ils peuvent être cultivés au-delà du jour 15 pour des expériences de culture ou de maturation à long terme.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse organoïde
<ol><li>Transfert d’organoïdes entiers (vivants ou fixes) REMARQUE: Pour le transfert d’organoïdes vivants, assurez-vous que les embouts de pipette utilisés sont stériles.<ol>
<li>Coupez la pointe d’une pointe de pipette P200 à 5-10 mm de l’ouverture de la pointe, ce qui donne une large ouverture d’environ 2-3 mm de diamètre.</li>
		<li>Insérez la pointe directement dans le puits à fond rond contenant l’organoïde afin que la pipette soit complètement verticale (perpendiculaire à la plaque). Assurez-vous que le piston de la pipette est déjà enfoncé avant d’insérer la pointe dans le milieu.</li>
		<li>Relâchez lentement le piston de la pipette, en prenant suffisamment de milieu (100-200 μL) pour recueillir l’organoïde.</li>
		<li>Transférer l’organoïde dans le milieu vers la destination cible (p. ex., pour la fixation, l’imagerie en direct, l’enregistrement électrophysiologique, la nouvelle culture sur plaque).</li>
	</ol></li>
	<li>Fixation des organoïdes REMARQUE: La fixation et la coloration des organoïdes peuvent être effectuées soit dans la plaque de culture à 96 puits, soit dans des tubes de microcentrifugation. Le paraformaldéhyde (PFA) ne doit être manipulé que dans une hotte.<ol>
<li>Pour la fixation dans des tubes de microcentrifugation, transférez les organoïdes vivants dans des tubes séparés avec 1 à 8 organoïdes par tube. REMARQUE: Ne pas dépasser 8 organoïdes par tube.</li>
		<li>Retirez et jetez soigneusement autant de milieu que possible du tube sans toucher les organoïdes.</li>
		<li>Ajouter 4 % de PFA à chaque tube ou puits (300-400 μL par tube de microcentrifugation et 100-200 μL par puits d’une plaque de 96 puits). Incuber à température ambiante pendant 30-45 min. REMARQUE: Les temps d’incubation supérieurs à 1 h peuvent nécessiter des étapes de récupération de l’antigène et ne sont pas recommandés.</li>
		<li>Jetez le PFA en toute sécurité sans déranger les organoïdes. Effectuer 3 lavages avec du DPBS complété par 1,5 g/L de glycine (DPBS/Gly), en utilisant le même volume que celui utilisé pour le PFA à 4%, en attendant 5 min entre les lavages. Retirer le DPBS/Gly et procéder à des analyses immunocolorantes ou autres ou ajouter du DPBS et conserver à 4 °C pour une utilisation future jusqu’à 2 semaines. REMARQUE: Le stockage d’organoïdes fixes pendant plus de 2 semaines peut entraîner une dégradation et une contamination des tissus et n’est pas recommandé.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration immunofluorescente de montage entier<ol>
<li>Ajouter 100 μL de solution bloquante/perméabilisante (10 % de sérum d’âne normal + 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) à chaque puits ou tube contenant les organoïdes fixes. Incuber à température ambiante pendant la nuit sur un shaker. REMARQUE: Ne pas dépasser 8 organoïdes par tube.</li>
		<li>Retirez et jetez soigneusement autant de solution bloquante que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.</li>
		<li>Préparer la solution d’anticorps primaires (1 % de sérum d’âne normal + 0,5 % de BSA + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) avec les anticorps primaires souhaités aux concentrations recommandées. Incuber à 4 °C pendant 24 h sur un agitateur.</li>
		<li>Retirez et jetez soigneusement autant de solution d’anticorps que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.</li>
		<li>Préparer une solution d’anticorps secondaires (1 % de sérum d’âne normal + 0,5 % de BSA + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) avec les anticorps secondaires souhaités aux concentrations recommandées. Si les anticorps sont marqués par fluorescence, incuber à 4 °C dans l’obscurité (p. ex., recouvert de papier d’aluminium) pendant 24 h sur un agitateur.</li>
		<li>Retirez et jetez soigneusement autant de solution d’anticorps que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.</li>
		<li>Préparez les lames avec des perles (90-300 μm de diamètre) montées dans un support de montage (voir la Table des matériaux) près des bords de la diapositive où le couvercle avec les organoïdes sera placé. REMARQUE: Il est recommandé de laisser sécher le support de montage autour des perles avant de continuer; cela empêchera les perles de se déplacer. Voir la figure 2.</li>
		<li>Transférez les organoïdes colorés à l’aide d’une pointe de pipette coupée sur la glissière, entre les perles, en assurant l’espacement pour éviter tout contact entre les organoïdes une fois sur la lame. Utilisez le coin d’une lingette de laboratoire enroulée pour éliminer soigneusement l’excès de liquide autour de l’organoïde.</li>
		<li>Couvrir les organoïdes avec un milieu de montage-dégagement (la solution de nettoyage du fructose-glycérol est de 60% (vol/vol) de glycérol et de 2,5 M de fructose)37 en utilisant 120-150 μL du milieu de montage-dégagement par lame. REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser une pointe de pipette coupée lorsque vous travaillez avec le support de montage-dégagement car il est très visqueux.</li>
		<li>Passez le curseur de couverture sur la glissière avec les organoïdes recouverts d’une solution de montage-dégagement et appuyez lentement sur le couvercle sur la glissière, en vous assurant que les organoïdes sont entre les perles montées.</li>
		<li>Scellez le périmètre du couvercle sur la glissière à l’aide d’un vernis à ongles de couche supérieure. Laisser sécher la lame dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 h. Conserver à 4 °C dans l’obscurité pour un stockage à long terme.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagerie transitoire du calcium dans les organoïdes cardiaques vivants NOTE: Selon les instructions du fabricant, Fluo4-AM a été reconstitué en sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à une concentration finale en solution mère de 0,5 mM. Fluo4-AM a été ajouté directement au puits organoïde dans la plaque de 96 puits.<ol>
<li>Effectuez 2 lavages sur les organoïdes à l’aide du milieu RPMI 1640.<ol>
<li>Retirer 166 μL du milieu usé du puits.</li>
			<li>Ajouter 166 μL de milieu RPMI 1640 réchauffé, retirer 166 μL de milieu et ajouter 166 μL de milieu RPMI 1640 frais. REMARQUE: Les lavages sont effectués pour éliminer les déchets et les débris cellulaires. Les deux tiers du milieu sont retirés des puits pendant les lavages pour éviter de perturber les organoïdes au fond du puits avant le test fonctionnel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ajouter le milieu Fluo4-AM aux organoïdes.<ol>
<li>Ajouter Fluo4-AM reconstitué dans du DMSO au RPMI 1640 contenant du supplément de B-27 pour préparer une solution de 1,5 μM.</li>
			<li>Retirer 166 μL de milieu du puits.</li>
			<li>Ajouter 166 μL de Fluo4-AM de 1,5 μM dans rpmI 1640 contenant du supplément de B-27 pour une concentration finale du puits de 1 μM. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Effectuez 2 lavages comme à l’étape 3.4.1.</li>
		<li>Ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant du supplément de B-27 au puits.</li>
		<li>À l’aide d’une pointe coupée d’une pointe de pipette P200, transférez l’organoïde dans une boîte de Petri à fond de verre (par exemple, verre de couverture chambré à 8 puits avec verre de couverture haute performance n ° 1,5) avec 100 à 200 μL de milieu. REMARQUE: Voir la section 3.1 sur le transfert d’organoïdes entiers.</li>
		<li>Imagez les organoïdes vivant sous un microscope avec une chambre à température et CO2 contrôlée à 37 °C, 5% co2.</li>
		<li>Enregistrez plusieurs vidéos de 10 à 20 s à divers endroits de l’organoïde, montrant l’augmentation et la diminution des niveaux d’intensité de fluorescence à mesure que le calcium entre et sort des cellules. REMARQUE: Pour les enregistrements haute résolution, il est recommandé d’enregistrer à une vitesse de 10 ips ou plus; 50 fps est recommandé.</li>
		<li>Analysez les vidéos à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (par exemple, ImageJ) en sélectionnant les régions d’intérêt et en mesurant les niveaux d’intensité au fil du temps.</li>
		<li>Normalisez les enregistrements d’intensité en utilisant ΔF/F0 par rapport au temps en millisecondes et tracez.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les progrès récents dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines et d’autres cellules d’origine cardiaque ont été utilisés pour modéliser le développement cardiaque humain22,24,25 et la maladie26,27,28 et comme outils pour dépister les agents thérapeutiques29,30 ...

Les malformations cardiaques congénitales (CHD) sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme et affectent environ 1% de toutes les naissances vivantes1,2,3. Dans la plupart des cas, les raisons des maladies coronariennes demeurent inconnues. La capacité de créer des modèles cardiaques humains en laboratoire qui ressemblent étroitement au cœur humain en développement constitue un pas en avant important pour étudier directement les causes sous-jacentes des maladies coronariennes chez l’homme plutôt que dans des modèles animaux de substitution.
La quintessence des modèles tissulaires cultivés en laboratoire sont les organoïdes, des constructions cellulaires 3D qui ressemblent à un organe d’intérêt pour la composition cellulaire et la fonction physiologique. Les organoïdes sont souvent dérivés de cellules souches ou de cellules progénitrices et ont été utilisés avec succès pour modéliser de nombreux organes tels que le cerveau4,5, le rein6,7, l’intestin8,9, le poumon10,11, le foie12,13 et le pancréas14,15 , pour n’en nommer que quelques-uns. Des études récentes ont émergé démontrant la faisabilité de créer des organoïdes cardiaques auto-assemblés pour étudier le développement cardiaque in vitro. Ces modèles comprennent l’utilisation de cellules souches embryonnaires (CSM) de souris pour modéliser le développement cardiaque précoce16,17 jusqu’à la spécification auriculo-ventriculaire18 et de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) pour générer des organoïdes cardio-endodermiques multi-germinaux19 et des cardioïdes chambrés20 avec une composition cellulaire très complexe.
Cet article présente un nouveau protocole de modulation WNT en 3 étapes pour générer des hHO très complexes de manière efficace et rentable. Les organoïdes sont générés dans des plaques de 96 puits, ce qui donne un système évolutif à haut débit qui peut être facilement automatisé. Cette méthode repose sur la création d’agrégats hPSC et le déclenchement des étapes de développement de la cardiogenèse, y compris la formation du mésoderme et du mésoderme cardiaque, la spécification du premier et du deuxième champ cardiaque, la formation d’organes proépicardiques et la spécification auriculo-ventriculaire. Après 15 jours de différenciation, les hHO contiennent toutes les principales lignées cellulaires présentes dans le cœur, des chambres internes bien définies, des chambres auriculaires et ventriculaires et un réseau vasculaire dans tout l’organoïde. Ce système organoïde cardiaque hautement sophistiqué et reproductible se prête à l’étude d’analyses structurelles, fonctionnelles, moléculaires et transcriptomiques dans l’étude du développement cardiaque, des maladies et du dépistage pharmacologique.

<table><tbody><tr><td>Anticorps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Âne anti-souris</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Âne anti-lapin</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Âne anti-souris</td><td>Invitrogen</td><td>A-21203</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Âne anti-lapin</td><td>Invitrogen</td><td>A-21207</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Âne anti-chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>A32849</td><td>1:200</td></tr><tr><td>HAND1</td><td>Abcam</td><td>ab196622</td><td>Lapin ; 1:200</td></tr><tr><td>HAND2</td><td>Abcam</td><td>ab200040</td><td>Lapin ; 1:200</td></tr><tr><td>NFAT2</td><td>Abcam</td><td>ab25916</td><td>Lapin ; 1:100</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>DSHB</td><td>P2B1</td><td>Lapin ; 1:50</td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td>Souris ; 1:200</td></tr><tr><td>THY1</td><td>Abcam</td><td>ab133350</td><td>Lapin ; 1:200</td></tr><tr><td>TJP1</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-19090</td><td>Chèvre ; 1:250</td></tr><tr><td>VIM</td><td>Abcam</td><td>ab11256</td><td>Chèvre ; 1:250</td></tr><tr><td>WT1</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>Lapin ; 1:200</td></tr><tr><td>Milieux et réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>NC9464543</td><td>réactif de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338AC010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément (moins l’insuline)</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td>supplément de culture cellulaire sans insuline</td></tr><tr><td>B-27 Supplément</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Supplément de culture cellulaire</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Bioworld</td><td>50253966</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck</td><td>442310</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Fructose</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>milieu de cellules souches pluripotentes (PSC) contenant 1 % pénicilline-streptomycine</td></tr><tr><td>Fluo4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Millipore Sigma</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>Corning</td><td>CB40230</td><td>Matrice extracellulaire à membrane basale (BM-ECM)</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Millipore Sigma</td><td>S30-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>MP Biomedicals</td><td>IC15014601</td><td>Poudre dissoute dans un tampon PBS utiliser à 4 %</td></tr> de <tr><td>pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate</td> Buffer Solution <td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>73155</td><td>90 et micro ; m</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>NC0729236</td><td>réactif de dissociation pour hPSC</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1045</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Montage Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H170010</td><td></td></tr><tr><td>WNT-C59</td><td>Selleck</td><td>NC0710557</td><td></td></tr><tr><td>Autres</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes à microcentrifuger de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02682002</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques de 2 mL</td><td>Corning</td><td>13-700-500</td><td></td></tr><tr><td>Réservoirs de réactifs de 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13681502</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à fond plat à 6 puits</td><td>Corning</td><td>0720083</td><td></td></tr><tr><td>Verre à 8 puits avec verre de protection haute performance #1.5</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Microplaques transparentes à très faible fixation à 96 puits</td><td>Costar</td><td>07201680</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image logiciel de traitement</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666</td><td>lingettes de laboratoire</td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>24 x 50 mm n° 1.5</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Cell Counter</td><td>Orflo Technologies</td><td>&nbsp ; MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de comptage cellulaire Moxi Z &ndash ; Type M</td><td>Orflo&nbsp ; Technologies</td><td>MXC001</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes multicanaux</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE1200300</td><td>30-300 & micro ; L</td></tr><tr><td>Olympus cellVivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>Pour l’imagerie du caclium, l’analyse avec Imagej</td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 Centrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004261</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur thermique</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-687-717</td><td></td></tr><tr><td>Top Coat Nail Varish</td><td>Seche Vite</td><td></td><td>Peut acheter dans n’importe quel supermarché</td></tr></tbody></table>

génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés dérivés de cellules souches pluripotentes

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

La capacité d’étudier le développement cardiaque humain dans la santé et la maladie est fortement limitée par la capacité de modéliser la complexité du cœur humain in vitro. Le développement de plateformes plus efficaces semblables à des organes capables de modéliser des phénotypes in vivo complexes, tels que des organoïdes et des organes sur puce, améliorera la capacité d’étudier le développement cardiaque humain et les maladies. Cet article décrit un protocole pour générer des organoïdes cardiaques humains (hHO) très complexes par auto-organisation à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines et activation progressive de la voie de développement à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules. Les corps embryoïdes (EB) sont générés dans une plaque de 96 puits avec des puits à fond rond et à fixation ultra-basse, facilitant la culture en suspension de constructions individualisées.
Les EB subissent une différenciation en hHO par une stratégie de modulation de signalisation Wnt en trois étapes, qui implique une activation initiale de la voie Wnt pour induire le destin du mésoderme cardiaque, une deuxième étape d’inhibition Wnt pour créer des lignées cardiaques définitives et une troisième étape d’activation Wnt pour induire des tissus d’organes proépicardiques. Ces étapes, réalisées dans un format de 96 puits, sont très efficaces, reproductibles et produisent de grandes quantités d’organoïdes par course. L’analyse par imagerie par immunofluorescence du jour 3 au jour 11 de la différenciation révèle les première et deuxième spécifications du champ cardiaque et les tissus très complexes à l’intérieur des hHO au jour 15, y compris le tissu myocardique avec des régions de cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires, ainsi que des chambres internes tapissées de tissu endocardique. Les organoïdes présentent également un réseau vasculaire complexe dans toute la structure et une paroi externe du tissu épicardique. D’un point de vue fonctionnel, les hHO battent de manière robuste et présentent une activité calcique normale déterminée par l’imagerie en direct Fluo-4. Dans l’ensemble, ce protocole constitue une plate-forme solide pour les études in vitro dans les tissus cardiaques humains ressemblant à des organes.

Pour obtenir un hHO auto-organisé in vitro, nous avons modifié et combiné les protocoles de différenciation précédemment décrits pour la différenciation monocouche 2D des cardiomyocytes21 et des cellules épicardiques22 à l’aide de modulateurs de la voie Wnt et pour les organoïdes précardiaques 3D16 en utilisant les facteurs de croissance BMP4 et Activin A. En utilisant le protocole de différenciation EB et hHO à 96 puits décrit ici et illust...

Ici, nous décrivons un protocole pour créer des organoïdes cardiaques humains (hHO) pertinents pour le développement en utilisant efficacement des cellules souches pluripotentes humaines par auto-organisation. Le protocole repose sur l’activation séquentielle des signaux de développement et produit des tissus cardiaques humains très complexes et fonctionnellement pertinents.

Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés dérivés de cellules souches pluripotentes

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Ce protocole nous permet de créer une structure 3D complexe qui ressemble beaucoup au cœur humain en développement d’une manière simple et rentable, reproductible à travers les lignées cellulaires. Il se compose d’un seul protocole avec trois étapes de différenciation, qui donne naissance à tous les types de cellules du cœur, y compris les chambres et un réseau vasculaire. Cette technique nous permet de modéliser un large éventail de maladies cardiovasculaires humaines et de dépister des traitements pharmacologiques efficaces.Grâce à la nature à haut débit de sa conception. Cette méthode est utile pour étudier le cœur humain en développement ainsi que les maladies qui lui sont couramment associées. L’un d’eux étant les malformations cardiaques congénitales.Ce protocole nécessite des compétences de base en culture cellulaire. Nous recommandons un pipetage attentif et délicat ainsi qu’une manipulation douce des organoïdes. Commencez par créer des corps embryoïdes ou EB deux jours avant la différenciation.Lavez les HPSC sous-confluents avec DBPS pendant au moins 10 secondes. Ensuite, aspirez le DPBS. Ajouter un millilitre d’ACUTA à température ambiante et tapoter doucement la plaque environ cinq fois par minute pendant trois à cinq minutes pour induire un détachement, tout en vérifiant au microscope.Ajoutez ensuite un millilitre de milieu PSC et Thias Avin ou Thias pour arrêter la réaction. Pipeter le milieu de haut en bas dans le puits, deux à trois fois pour générer une suspension à cellule unique et recueillir les cellules. Ensuite, transférez la suspension à cellule unique dans un tube de centrifugeuse et faites tourner pendant cinq minutes à 300 fois G.Aspirez le surnageant et ré-dépensez les cellules dans un millilitre de milieu PSC et de Thias.Diluer les cellules dans DPBS. Compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémo-cystomètre et diluer les cellules dans un milieu PSC avec Thias à une concentration de 100 000 cellules par millilitre. Ajouter 100 microlitres de suspension de cellules diluées à chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond rond ultra basse.Centrifuger la plaque à 100 fois G pendant trois minutes et incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, retirez soigneusement 50 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 200 portées de noyau de milieu PSC frais, chaud à 37 degrés Celsius pour un volume de 250 microlitres par puits. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Retirez 166 microlitres ou deux tiers de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 contenant un supplément de B27 sans insuline, six 990211 de cheer micromolaires, 0,875 nanogramme par millilitre de protéine morphogénétique osseuse quatre et 1,5 nanogrammes par millilitre d’Activin A.Incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, retirez 166 microlitres de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais avec un supplément de B27 sans insuline. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Pour induire la spécification du mésoderme cardiaque le deuxième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640, contenant un supplément de B27 sans insuline et trois Wnt-C59 micromolaires et poursuivez l’incubation pendant 48 heures. Le quatrième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais avec un supplément de B27 sans insuline, puis incubez encore 48 heures. Le sixième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 avec un supplément de B27.Pour cela et tous les changements de milieu ultérieurs, utilisez un supplément de B27 avec de l’insuline, incubez pendant 24 heures supplémentaires. Le septième jour, la culture cellulaire est prête pour la différenciation pro épicardique. Retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B27 et trois cheer micromolaires 99021.Ensuite, en incubant pendant une heure, après une heure, retirez la plaque de l’incubateur, retirez 166 microlitres de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B27, continuez l’incubation pendant encore 48 heures. Répétez ce processus toutes les 48 heures jusqu’à la collecte. Les organoïdes sont prêts pour les analyses et l’expérimentation le jour 15 Pour transférer les organoïdes entiers, coupez l’extrémité d’une pipette P200, à cinq à 10 millimètres de l’ouverture d’un diamètre d’environ deux à trois millimètres.Appuyez sur le piston de la pipette et insérez la pointe verticalement dans le puits inférieur rond avec l’organoïde. Prenez environ 100 à 200 microlitres de milieu suffisamment pour recueillir les organoïdes et les transférer à la destination cible. Avant que les EBS de différenciation n’apparaissent sous forme de masses sphériques noires, le processus de différenciation commence le jour zéro avec une activation de la voie Wnt et un ajout de facteur de croissance pendant exactement 24 heures.En outre, l’édition de Wnt C59 le deuxième jour entraîne l’élargissement de l’organoïde d’environ 200 micromètres à un maximum d’un millimètre. Les organoïdes du cœur humain ont commencé à battre dès le sixième jour et 100% des organoïdes ont montré des battements visibles au jour 10. Les images à fort grossissement de l’organoïde du septième jour ont révélé que la plupart des cellules exprimant la main un étaient d’origine cardiomyocytaire et la main deux étaient des cellules non myosites du deuxième Heartfield, des cellules progénitrices.Les transcriptions d’ARN pour la première main et la deuxième main ont été exprimées à partir du troisième jour dans les données de séquençage de l’ARN. Les marqueurs FHF ont été fortement exprimés pendant les jours trois et 11 tandis que le marqueur SF a été exprimé plus fortement après le jour 13. La coloration par immunofluorescence a révélé la présence de diverses lignées de type de cellules cardiaques humaines qui composent le cœur humain.Tels que le tissu myocardique et épicardique, les cellules endocardiques, les cellules endothéliales et les fibroblastes cardiaques. Les marqueurs exprimant les lignées cellulaires ci-dessus ont également été observés dans les profils d’expression génique de l’ARN SAC. L’imagerie calcique vivante de cellules individuelles dans des organoïdes entiers a été utilisée pour mesurer la fonction électrophysiologique des organoïdes.L’intensité de la fluorescence Fluo-4 a varié au fil du temps en raison de l’entrée de calcium hors de la cellule révélant des potentiels d’action réguliers. Les cartes thermiques montrant les intensités de calcium sur une région de grossissement élevé de l’organoïde montrent une intensité accrue due aux transitoires de calcium et aux cellules individuelles. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que les EB et les organoïdes suivants ne sont pas attachés au bas de la plaque, et nous nous déplacerons avec le retrait en plus des supports nécessitant des changements de support attentifs.Les organoïdes peuvent être cultivés pendant de plus longues périodes de temps introduites dans les techniques de maturation, ou même exposés à des stimuli externes, tels que le conditionnement mécanique ou électrique, et même à des facteurs de stress tels que les toxines. Cette technique permet d’accéder à des stades du développement cardiaque fœtal humain qui sont autrement inaccessibles dans la recherche, ouvrant la voie à de nouvelles connaissances sur le développement cardiaque et l’étiologie des maladies.

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