Classification de l’état d’activation des cellules souches neurales in vitro à l’aide de l’autofluorescence
April 12th, 2024
Ce protocole décrit des stratégies d’identification et d’enrichissement de l’état cellulaire dans des cultures de cellules souches neurales neurales de souris adultes primaires par imagerie par autofluorescence à l’aide i) d’un microscope confocal, ii) d’un trieur de cellules activées par fluorescence pour effectuer l’imagerie d’intensité, ou iii) d’un microscope multiphotonique pour effectuer l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence.
Ce protocole fournit une nouvelle approche pour classer l’état d’activation des cellules souches neurales avec une cohorte d’avantages techniques. En utilisant ce protocole, nous pouvons réaliser une analyse de résolution de cellule unique sans marquage de cellules vivantes de l’état d’activation des cellules souches neurales. Ce protocole peut être utilisé pour faire la lumière sur les mécanismes régulant la neurogenèse adulte.
L’autofluorescence est beaucoup plus faible que celle de nombreux fluorophores avec lesquels les chercheurs ont l’habitude de travailler. Soyez confiant dans l’utilisation de puissances laser plus élevées pour collecter vos données. Chris Morrow, un ancien étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par configurer le microscope confocal pour l’imagerie par autofluorescence. Cliquez sur Laser 405 et tapez dans la fenêtre d’émission sous le menu Laser 405. Cliquez sur TD pour collecter une image en lumière transmise et réglez la valeur HV pour visualiser l’échantillon.
Réglez la puissance du laser à 3,5 % et réglez le gain sur 75. Réglez le zoom sur deux. Pour les paramètres de balayage confocal, réglez la durée d’attente des pixels sur 0,5 et la résolution sur 2048 par 2048 pixels.
À l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 60X sous fond clair, faites la mise au point sur les cellules. Cliquez sur Eye Port pour passer en mode de balayage confocal. Assurez-vous que le chemin de la lumière est dirigé vers la tête de balayage et vérifiez qu’aucun cube de filtre n’obstrue le chemin de la lumière.
Cliquez sur Scanner, puis concentrez-vous sur l’image, puis cliquez sur Capturer pour acquérir des images d’autofluorescence dans les cellules souches neurales quiescentes et les cellules souches neurales actives. Assurez-vous de collecter des images à plan unique avec le cytoplasme des cellules au point pour une coupe efficace représentative de chaque cellule. Commencez à imager avec de faibles puissances laser et augmentez progressivement la puissance jusqu’à ce que le signal d’autofluorescence soit détectable sans provoquer de saturation.
Analysez les cellules souches neurales quiescentes et les cellules souches neurales actives à l’aide d’un cytomètre en flux à l’aide d’une buse de 130 micromètres. Appliquez des conditions optiques selon les capacités de l’instrument et détectez l’autofluorescence ponctuée. Collectez au moins 10 000 qNSC et aNSC singulet dans un fichier de données.
Utilisez ces données pour concevoir des portes de collecte d’une population enrichie de qNSC ou d’aNSC. Ensuite, triez les cellules singulet dans des puits recouverts de laminine PLO remplis d’un milieu aNSC. Après FACS, laissez les cellules souches neurales incuber pendant trois heures.
Pour fixer les cellules, ajoutez 4 % de paraformaldéhyde, en veillant à ce qu’il soit suffisant pour couvrir le fond de la boîte et incuber. Après 15 minutes, perméabilisez les cellules avec 0,25% de Triton dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, traitez les cellules avec une solution de coloration EdU à température ambiante pendant 30 minutes.
Ensuite, lavez les échantillons trois fois pendant 10 minutes chacun avec du PBS. Commencez par utiliser les oculaires pour localiser un champ de vision approprié et ajustez le chemin de la lumière vers l’échantillon sur le microscope pour permettre l’imagerie dans l’obscurité avec le multiphoton. Configuration pour la collecte de l’image du premier canal.
Accédez à l’onglet Gain de puissance et réglez le gain sur le PMT sur 800. Cliquez sur l’onglet Laser 2P et sélectionnez 750 nanomètres pour la longueur d’onde laser et assurez-vous que le bon cube de filtre est utilisé. Pour collecter l’image du canal un, cliquez sur l’onglet Gain de puissance et réglez les Pockels sur 30.
Passez ensuite à la section de balayage de l’écran et cliquez sur Analyse en direct pour démarrer le mode de prévisualisation. Augmentez progressivement les Pockels pour obtenir un champ de vision approprié à faible puissance laser. Une fois qu’un champ de vision approprié a été identifié, ajustez la puissance du laser à 3,6 milliwatts.
Passez ensuite à la section de balayage et cliquez sur balayage unique pour capturer une image de canal un sur 60 secondes. Pour collecter une image de canal deux, cliquez sur l’onglet Laser 2P et sélectionnez 890 nanomètres pour le laser. Remplacez le cube de filtre par le cube d’émission du canal deux.
Lancez le mode de prévisualisation. Augmentez les Pockels jusqu’à ce que le capteur de puissance indique environ sept milliwatts et que le nombre de CFD soit compris entre 10 000 et 100 000. Cliquez sur un seul balayage et capturez une image de canal deux sur une durée de 60 secondes.
L’imagerie confocale par autofluorescence a été utilisée pour différencier les cellules souches neurales quiescentes des cellules souches neurales activées. Il a été constaté que les qNSC présentent un nombre plus élevé de PAF que les aNSC, démontrant l’utilisation de l’autofluorescence comme marqueur pour l’identification de l’état cellulaire. À l’aide de FACS, les états des cellules NSC ont été enrichis en fonction de l’autofluorescence.
Les cellules triées à partir de la porte à autofluorescence élevée ont montré un taux de prolifération plus faible par rapport à l’échantillon mixte, tandis que celles provenant de la porte à faible autofluorescence étaient plus prolifératives, confirmant l’enrichissement des états d’activation des NSC. De plus, FLIM a été utilisé pour évaluer l’autofluorescence des NSC et discerner l’état d’activation des NSC. Notamment, les qNSC ont montré une durée de vie moyenne de fluorescence plus élevée dans le canal un, mais une proportion plus faible du composant de fluorescence alpha un par rapport aux aNSC.
Un modèle de régression logistique intégrant les données des deux canaux a produit une capacité prédictive presque parfaite pour les états d’activation des NSC, comme l’indique une courbe caractéristique de l’opérateur récepteur soulignant le potentiel de FLIM dans la classification des états NSC. Après cette procédure, il serait bon de valider les résultats en utilisant d’autres approches pour mesurer l’état d’activation des cellules souches neurales.
Aperçu
Ce protocole présente des techniques pour identifier et enrichir les états cellulaires dans des cultures de cellules souches neurales de souris adultes primaires en utilisant l'imagerie par autofluorescence. L'étude utilise la microscopie confocale, le tri de cellules activées par fluorescence (FACS) et la microscopie multiphotonique pour analyser les états d'activation des cellules souches neurales, améliorant la compréhension de la neurogenèse adulte.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Biologie cellulaire
- Technologie d'imagerie
Contexte
- Les cellules souches neurales (NSC) jouent un rôle crucial dans la neurogenèse et la réparation cérébrale.
- Comprendre les états d'activation des NSC peut fournir des informations sur leurs rôles dans le fonctionnement du cerveau.
- Les méthodes actuelles manquaient de techniques précises pour évaluer les états des NSC à la résolution d'une cellule unique.
- L'imagerie par autofluorescence offre une nouvelle approche pour analyser les cellules vivantes sans marquage.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour l'analyse de cellules vivantes, sans marquage, des états d'activation des cellules souches neurales.
- Enrichir les cellules souches neurales quiescentes et activées en utilisant l'autofluorescence comme marqueur.
- Explorer les mécanismes régulant la neurogenèse adulte grâce à des techniques d'imagerie améliorées.
Méthodes utilisées
- L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un microscope confocal et d'un microscope multiphotonique.
- Des cultures de cellules souches neurales de souris adultes primaires ont été utilisées comme modèle biologique.
- Aucune analyse multiomique ou métabolique n'a été réalisée dans cette étude.
- Le protocole impliquait des étapes pour la configuration confocale, le FACS pour le tri cellulaire et l'analyse de l'autofluorescence.
- Les étapes critiques comprenaient l'optimisation des paramètres de puissance du laser et le tri des populations cellulaires basé sur l'intensité de l'autofluorescence.
Résultats principaux
- L'imagerie par autofluorescence a réussi à différencier les NSC quiescentes et activées en fonction de l'intensité du signal.
- Le FACS a permis l'enrichissement des NSC, démontrant des différences dans les taux de prolifération entre les populations triées.
- L'imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM) a révélé des différences significatives dans le temps de vie de fluorescence et les composantes entre les qNSC et les aNSC.
- Un modèle de régression logistique a indiqué une forte capacité prédictive pour identifier les états d'activation des NSC.
Conclusions
- Cette étude permet une identification et une analyse avancées des états d'activation des cellules souches neurales, ce qui est crucial pour comprendre la neurogenèse.
- L'utilisation de l'autofluorescence et du FACS est prometteuse pour la recherche future en neuroplasticité et en biologie des cellules souches.
- Les informations obtenues peuvent éclairer les stratégies thérapeutiques dans les affections neurodégénératives.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This protocol provides a label-free, single-cell resolution method to classify neural stem cell activation states using autofluorescence, enabling mechanistic de-risking in target validation for neurogenesis-related pathways. By distinguishing quiescent and activated states without exogenous labels, it supports predictive confidence in early discovery and reduces biological ambiguity in stem cell-based therapeutic strategies. The approach enhances translational continuity from discovery through preclinical research by offering a reusable, scalable tool for assessing cell state dynamics in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by classifying NSC activation states based on endogenous autofluorescence markers.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, live-cell analysis that preserves native cell function during state discrimination.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by quantifying differences in proliferation and fluorescence lifetime between qNSCs and aNSCs using FACS and FLIM.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enriching qNSC or aNSC populations via FACS gating on autofluorescence intensity.
- Reproducibility: Standardizes activation state assessment through quantitative autofluorescence intensity and fluorescence lifetime measurements.
- Scalability: Enables platform reuse across studies by establishing a label-free method compatible with confocal, FACS, and multiphoton imaging.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with adult neurogenesis mechanisms, offering a translational biomarker-compatible system for studying NSC quiescence exit in preclinical models.
- Predictive De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking autofluorescence signatures to functional outcomes like proliferation rate and cell cycle re-entry.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a consistent, label-free readout across imaging and sorting modalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting assay development and analytics with quantitative, label-free outputs that inform go/no-go decisions in stem cell-targeted programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time classification of NSC activation states without perturbing native signaling.
- Screening: Delivers assay readiness through FACS-based enrichment of pure qNSC or aNSC populations for compound screening applications.
- Analytics: Provides quantitative readouts including autofluorescence intensity, fluorescence lifetime, and component analysis to compare activation states across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing longitudinal tracking of quiescent exit dynamics using FLIM in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects due to its label-free nature and compatibility with standard microscopy and flow cytometry infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in NSC state transitions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through instrument-agnostic autofluorescence metrics applicable across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of ineffective modulators of NSC activation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that reliably modulate qNSC-to-aNSC transition with measurable fluorescence signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, flow cytometry, and multiphoton FLIM for accurate signal detection and interpretation.
- Dependent on laser tuning and detector sensitivity due to the inherently low signal strength of endogenous autofluorescence.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters (laser power, gain, wavelength) to ensure reproducible activation state classification.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different NSC sources or culture conditions affecting autofluorescence background.
- Limited by the need for careful optimization to avoid photodamage while achieving sufficient signal-to-noise ratio for state discrimination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Introduction
0:39
Imaging Autofluorescence in Live qNSCs and aNSCs Using Confocal Microscope
2:13
Autofluorescence Based FACS Enrichment for NSC Activation State in Cultured NSCs
3:36
Using Multiphoton Microscope to Perform Fluorescence Lifetime Imaging on NSCs In Vitro
5:20
Results: Deciphering Neural Stem Cell Activation States Through Advanced Fluorescence Imaging Techniques
6:45
Conclusion
