Modelage de micro-organismes et de microparticules par assemblage séquentiel assisté par capillarité

Cette méthode permet de produire des modèles de micro-organismes définis par l’utilisateur dans un canal microfluidique. Une fois modelés, les micro-organismes peuvent être surveillés pour évaluer leur physiologie à long terme et leur interaction avec un débit élevé. L’utilisation de forces capillaires permet une voie non spécifique pour le modelage, qui est applicable à différentes classes de matériaux.

Par exemple, les particules colloïdales et les bactéries. De plus, il permet de produire de grands réseaux avec un contrôle exquis de la disposition spatiale du matériau d’intérêt. À ce jour, nous avons testé et appliqué la méthode sur des particules colloïdales et des cellules microbiennes.

En conséquence, il peut trouver des applications dans l’ingénierie des matériaux et les domaines nécessitant une analyse quantitative unicellulaire comme le dépistage de médicaments. Pour commencer, préparez un mélange PDMS en mélangeant l’élastomère avec son agent de réticulation. Remuez ensuite vigoureusement le mélange pour mélanger les deux composants uniformément jusqu’à ce que des bulles d’air se forment et que le mélange PDMS ait l’air opaque.

Maintenant, dégazez le mélange dans un dessiccateur sous vide jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées et que le mélange ait à nouveau l’air transparent. Pour obtenir un plancher de gabarit de 400 micromètres d’épaisseur de la puce microfluidique, versez trois grammes du mélange sur le maître de silicium et placez le maître de silicium sur un enduit de spin pour faire tourner le manteau à 21 fois G pendant cinq secondes et 54 fois G pendant 10 secondes. Dégazez à nouveau pour éliminer les bulles d’air piégées comme décrit précédemment.

Versez 20 grammes du mélange PDMS dans le moule imprimé en 3D pour fabriquer le microcanal qui servira de toit à la puce microfluidique et dégazez-le pendant 30 minutes comme décrit précédemment. Cuire la plaquette de silicium et le moule imprimé en 3D à 70 degrés Celsius pendant au moins deux heures, puis couper le PDMS le long du contour du moule imprimé en 3D et le décoller. Coupez le PDMS avec une lame autour des microcanaux et percez les trous qui serviront d’entrée et de sortie du canal microfluidique.

Maintenant, coupez le PDMS et décollez-le du maître de silicium et coupez la couche PDMS en morceaux plus petits avec les mêmes dimensions des canaux microfluidiques qui seront collés sur les gabarits. Frottez doucement les gabarits et les microcanaux à l’aide d’une solution détergente à 1% pendant cinq minutes, puis rincez à l’eau désionisée. Ensuite, rincez les gabarits et les microcanaux avec de l’isopropanol, avant de les rincer à l’eau désionisée.

Maintenant, séchez les gabarits et les microcanaux à température ambiante pendant une minute avec de l’air comprimé à une barre. Placez les gabarits et les microcanaux dans un nettoyeur plasma avec les surfaces de collage tournées vers le haut. Après avoir activé le nettoyeur plasma, le plasma traite les gabarits et les microcanaux pendant 40 secondes, puis les retire du nettoyeur plasma et lie immédiatement les microcanaux au-dessus des gabarits.

Conservez les copeaux microfluidiques dans un four à 70 degrés Celsius pendant cinq jours pour assurer la récupération hydrophobe du PDMS. Le jour de l’expérience, réglez l’incubateur de boîte à 37 degrés Celsius plusieurs heures avant l’expérience, puis installez la pompe à seringue et la plaque de verre chauffée sur la scène du microscope, en réglant la même température que celle de l’incubateur de boîte. 90 minutes avant l’expérience, placez la puce microfluidique dans un récipient rempli de 100% d’éthanol et rincez le canal avec de l’éthanol à 100% pendant au moins 10 minutes, puis placez la puce microfluidique dans un dessiccateur sous vide et dégazez pendant au moins 30 minutes.

Maintenant, échangez l’éthanol avec de l’eau distillée et traitez la puce sous vide pendant au moins 30 minutes. Mettez la puce microfluidique dans le four à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes pour éliminer toute trace de liquide laissée dans le canal. Pipeter un millilitre de milieu MOPS dans un flacon de centrifugeuse et ajouter 10 microlitres de phosphate de potassium molaire 0,132.

Aliquote 100 microlitres de la culture de nuit dans le flacon de centrifugeuse et centrifuger la culture à 2 300 fois G pendant deux minutes. Jeter doucement le surnageant pour remettre la pastille dans un millilitre de milieu MOPS frais avec 0,015% de Tween 20 et 0,01% de phosphate de potassium et charger la suspension bactérienne dans une seringue d’un millilitre. Pour fixer la seringue et le raccord du tube, insérez directement une aiguille dans le tube.

Maintenant, montez la seringue sur la pompe à seringue et injectez la suspension dans la puce microfluidique à travers l’entrée située dans la partie amont du canal jusqu’à ce que la suspension recouvre la région du gabarit avec des pièges. Réglez la pompe à seringue à un débit de 0,07 à 0,2 microlitre par minute pour retirer la suspension bactérienne et surveiller le processus de modelage via un logiciel de microscope. Une fois que le gabarit a été modelé avec des cellules, augmentez le débit de retrait pour vider rapidement le canal microfluidique et rincez-le avec du LB frais qui a été préalablement dégazé pendant au moins 30 minutes et préaverti à 30 degrés Celsius.

Maintenant, réglez la pompe à seringue à un débit de deux microlitres par minute pour rincer doucement le canal. Une fois le canal rempli, augmentez à nouveau le débit. Acquérir des images de bactéries en croissance au grossissement et à l’intervalle de temps souhaités.

Pipette 900 microlitres d’une solution aqueuse 20 Tween 0,015% dans un flacon de centrifugeuse, puis pipette 100 microlitres de la suspension colloïdale d’origine. Centrifuger la suspension à 13 500 G pendant une minute et remplacer doucement le surnageant par la solution aqueuse Tween 20. Chargez la suspension colloïdale dans une seringue d’un millilitre et connectez la seringue à la puce à travers un tube microfluidique.

Injecter la suspension dans la puce microfluidique à travers l’entrée située dans la section centrale à la partie amont du canal et pousser progressivement la suspension jusqu’à ce que le gabarit soit recouvert. Retirez la suspension colloïdale à un débit de 0,07 à 0,2 microlitre par minute et imagez le processus de modelage via un logiciel de microscope. Augmentez le débit une fois que le ménisque atteint rapidement la fin du gabarit.

La géométrie du canal droit a été exploitée pour modeler des cellules stationnaires en phase d’une souche fluorescente d’Escherichia coli déposant 83 % des 5 000 pièges analysés. Les bactéries à motifs ont repris leur croissance à différents moments dans les 1,5 heure suivant le remplissage du canal avec du LB frais. Une fois la croissance reprise, des cellules bactériennes uniques ont commencé à former des colonies individuelles qui se sont étendues jusqu’à ce qu’une couche superficielle soit formée et que la résolution d’une seule cellule soit perdue. L’analyse menée sur 55 000 pièges a montré que des dimères vert-rouge fabriqués par des particules de deux et un micromètre de diamètre étaient formés dans 93% et 89% des pièges analysés respectivement.

Et des tondeuses vert-rouge-vert ont été formées dans 52% des pièges. La distance entre les particules à motifs peut être contrôlée avec précision en effectuant deux dépôts dans des directions opposées, piégeant ainsi ces particules aux extrémités opposées de chaque piège. Il est important d’assurer une température uniforme sur l’ensemble du gabarit pour éviter la condensation pendant le processus de modelage.

À cette fin, nous plaçons une plaque de verre chauffée sous le gabarit et la réglons à la même température que l’incubateur de boîte. Cette méthode peut être utilisée dans une variété d’études biologiques impliquant une analyse quantitative unicellulaire. Un avantage unique est sa nature à haut débit qui permet de modéliser des milliers de cellules fournissant de grandes statistiques dans la même arène expérimentale.