Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Ce protocole est important car il fournit un moyen d’isoler les vésicules extracellulaires d’une variété de bactéries d’une manière hautement reproductible. La grande chose à propos de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour isoler des véhicules électriques à partir d’environnements assez grands de cultures bactériennes, ce qui permettra des études in vivo. Bien que les données que nous montrons reflètent des applications précliniques, il est prévisible que ce protocole pourrait être adapté à la fabrication de véhicules électriques bactériens à des fins thérapeutiques.

Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système de culture cellulaire évolutif avec une modification mineure. En raison de l’évolutivité du protocole, il est important d’avoir des filtres et des colonnes SEC de taille appropriée pour gérer les volumes de départ souhaités de culture cellulaire bactérienne. Sadie Johnson, technologue adjointe dans le laboratoire du Dr Justin Lathia, Dionysius Watson, boursier en oncologie dans le laboratoire du Dr Justin Lathia, et Akeem Santos, technologue de recherche dans mon laboratoire, font la démonstration des procédures.

Commencez par inoculer des colonies uniques d’Escherichia coli dans 250 à 1000 millilitres de bouillon Luria-Bertani, ou LB, à l’aide d’une boucle stérile. Ensuite, incuber la culture en aérobie dans un incubateur à agitation à 300 rotations par minute et 37 degrés Celsius. Après 48 heures d’incubation, clarifier le milieu de culture bactérien en transférant les cultures cellulaires dans des flacons de centrifugeuses en polypropylène de 500 millilitres pour les centrifuger dans un rotor à angle fixe de grande capacité à quatre degrés Celsius et 5 000 fois G pendant 15 minutes.

Transférer le surnageant dans les bouteilles de centrifugeuses propres en versant soigneusement sur centrifugeuse à 10 000 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, transférez le surnageant dans un dispositif filtrant sous vide en polyéthersulfone de 0,2 micron d’une taille appropriée et connectez le dispositif de filtration à une alimentation en paroi sous vide. Si le taux de filtration diminue considérablement, déplacez le matériau non filtré vers un nouvel appareil.

Le milieu filtré peut être stocké à quatre degrés Celsius pendant la nuit ou peut être traité immédiatement. Pour vérifier l’élimination complète des cellules viables, étaler une partie aliquote du surnageant filtré sur des plaques de gélose appropriées et s’assurer de l’absence de colonies après l’incubation dans des conditions optimales pour la souche bactérienne. Pour concentrer le milieu filtré d’un volume de 100 millilitres, chargez 90 millilitres de milieu de culture filtré sur le réservoir du dispositif d’ultrafiltration centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons et centrifugez le milieu dans un rotor de godet oscillant à quatre degrés Celsius et 2 000 fois G pendant des intervalles de 15 à 30 minutes jusqu’à ce que le volume du réservoir dans le réservoir supérieur ait été concentré à moins de 0,5 millilitre.

Pour remplir le réservoir avec tout milieu de culture filtré restant, retirez le flux dans le bas de l’appareil pour le rééquilibrer. Si la viscosité du milieu concentré dans le réservoir est visiblement augmentée, diluer le milieu avec du PBS et le reconcentrer par centrifugation pour réduire toute vésicule non extracellulaire, ou protéines EV, inférieure à la limite de poids moléculaire de 100 kilodaltons. Ensuite, transférer le milieu concentré dans un tube de liaison à faible teneur en protéines pour stocker à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour concentrer le milieu filtré avec un volume supérieur à 100 millilitres, choisissez un dispositif de filtration à flux tangentiel de taille appropriée, ou TFF, avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons.

Après avoir assemblé un circuit de filtration comme expliqué dans le manuscrit, pomper 200 millilitres de PBS dans une cuve graduée pour déterminer la vitesse appropriée correspondant au débit souhaité. Lorsque la vitesse est réglée, faire circuler le milieu conditionné filtré à environ 200 millilitres par minute à température ambiante et recueillir les molécules inférieures à 100 kilodaltons, en traversant la membrane d’ultrafiltration comme déchets dans un récipient séparé jusqu’à ce que le volume du milieu conditionné ait été réduit à 100 à 200 millilitres. Diluer séquentiellement le volume filtré deux fois avec du PBS et continuer à faire circuler le fluide avec la pompe dans des récipients plus petits pour concentrer le volume à 75 à 100 millilitres, puis à 25 millilitres et 10 millilitres.

Soulevez le tube d’alimentation hors du réservoir d’échantillon et pompez pour purger le filtre afin de récupérer la quantité maximale de l’échantillon. Déplacer l’échantillon concentré vers un dispositif d’ultrafiltration centrifuge de 15 millilitres avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons et centrifuger dans un rotor à godet oscillant à quatre degrés Celsius et 2 000 fois G pendant des intervalles de 15 à 30 minutes jusqu’à ce que le volume du milieu dans le réservoir supérieur soit inférieur à deux millilitres. Transférer le milieu concentré dans un tube de liaison à faible teneur en protéines pour le stocker à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Pour l’isolation des véhicules électriques, effectuez une chromatographie d’exclusion de taille, ou SEC, en utilisant une petite colonne avec un volume de lit de 10 millilitres pour moins de 100 millilitres de matériau de départ et une colonne plus grande avec un volume de lit de 47 millilitres pour plus de 100 millilitres de matériau de départ. Pendant plusieurs heures avant l’expérience, amener la colonne SEC et le PBS à température ambiante, puis stabiliser la colonne en position verticale à l’aide d’un support de laboratoire et d’un support standard. Avant de vous connecter à la colonne SEC, hydratez le réservoir d’échantillon en laissant cinq millilitres de PBS s’écouler à travers la fritte dans un conteneur à déchets.

Ensuite, dévissez le bouchon d’entrée de la colonne pour ajouter deux millilitres de PBS au réservoir d’échantillon et connectez soigneusement le réservoir à la colonne pendant que le PBS s’égoutte à travers la frette. Pour l’équilibrage de la colonne, ajouter 47 millilitres de PBS au réservoir d’échantillon, puis déboucher le bas de la colonne SEC. Ensuite, laissez toute la mémoire tampon d’échantillon chargée circuler dans la colonne et ignorez le flux.

Après avoir chargé deux millilitres de l’échantillon sur le réservoir d’échantillon, laissez l’échantillon entrer complètement dans la colonne et collectez le flux continu. Ajouter immédiatement du PBS au réservoir d’échantillon à un volume de 14,25 millilitres moins le volume de l’échantillon pour permettre à la solution de s’écouler à travers la colonne, tout en éliminant la quantité égale au volume de vide de la colonne. Ensuite, placez un microtube à faible liaison de deux millilitres directement sous la colonne SEC pour recueillir le premier écoulement continu ou fraction un après avoir laissé passer deux millilitres de PBS à travers la colonne.

Continuez à ajouter deux millilitres de PBS au réservoir d’échantillon pour recueillir chaque fraction subséquente. Conservez les fractions collectées à quatre degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Pour les essais de stérilité des fractions collectées de VE, inoculer trois millilitres du milieu de culture avec 100 microlitres des fractions à utiliser dans les essais.

Ensuite, cultiver le milieu dans des conditions optimales tout en observant la turbidité pendant au moins trois jours. Alternativement, les échantillons de fraction peuvent être appliqués sur des plaques de gélose contenant le milieu utilisé pour développer les bactéries productrices, puis vérifier la formation de colonies. Ensuite, entreposez les VE en transférant 25 à 50% des fractions individuelles ou regroupées dans des tubes de liaison à faible teneur en protéines à moins 80 degrés Celsius pour éviter les cycles de gel-dégel.

L’analyse représentative montre l’élution des EV MP1 d’Escherichia coli dans les premières fractions chromatographiques. Les fractions un à six contenaient le plus de véhicules électriques, avec un diamètre moyen inférieur à 100 nanomètres. Dans le même temps, les fractions suivantes contenaient des protéines sans EV et très peu de EV.

L’enrichissement et la taille de l’EV ont été confirmés par microscopie électronique à transmission, en particulier dans les fractions deux à six. Il a été observé que les fractions enrichies en EV deux à sept avaient une activité nanoluciférase élevée, mais seulement un signal fluorescent très faible de mCherry non associé à EV par rapport à celui des fractions ultérieures. Le marquage immunogold a confirmé l’association EV de la nanoluciférase dans les fractions deux à cinq.

L’applicabilité du protocole aux autres espèces bactériennes a été évaluée en isolant les VE des cultures de diverses bactéries anaérobies. Il a été observé que les premières fractions chromatographiques un à quatre étaient enrichies pour les VE, avec un diamètre inférieur à 100 nanomètres. La perfusion complexe cerveau-cœur, ou BHI, contenait les particules de la taille d’un VE à moins de 25% du rendement total de l’EV.

Il est important d’utiliser des dispositifs TFF capables de manipuler le volume de départ de la culture cellulaire bactérienne. Cette technique nous permet de générer suffisamment de VE pour poser des questions biologiques sur leur fonction dans des modèles animaux complexes.