Identification de la source des protéines sécrétées dans le rein par injection de Brefeldin A

Notre technique nous permet d’identifier la source et la contribution relative des cellules productrices de cytokines dans les reins lésés. L’utilisation de la Brefeldine A pour prévenir la sécrétion de protéines nous permet de recueillir plus d’informations sur les cellules produisant des cytokines dans les organes solides, telles que le type de cellules et l’état de ces cellules.

Notre protocole devrait être facilement adaptable à de nombreux systèmes d’organes. Étant donné que la brefeldine A est une petite molécule perméable aux cellules, elle devrait inhiber la sécrétion dans la plupart des types de cellules, permettant de détecter les cytokines et autres protéines sécrétées.

L’injection du coccyx est l’étape la plus difficile sur le plan technique, car le coccyx de la souris est assez petit. Nous vous recommandons de pratiquer cette étape avant d’effectuer notre protocole sur des animaux de laboratoire.

[Instructeur] Commencez par mettre la cage à moitié sur le coussin chauffant pendant 10 minutes pour vous assurer que les souris sont au chaud. Après avoir placé la souris dans un dispositif de contention, désinfectez la queue à l’aide d’un tampon de povidone iodé et d’alcool à trois reprises. Tenez la queue horizontalement et visualisez les veines latérales de la queue. Insérez ensuite une aiguille de calibre 28, en gardant l’aiguille et la seringue parallèles à la veine en direction de la tête. Injectez 200 microlitres de la solution BFA de 1,25 milligramme par millilitre. La veine doit devenir claire lorsque le sang est remplacé par la solution d’injection. Retirez ensuite l’aiguille et appuyez doucement sur la queue jusqu’à ce que le saignement s’arrête. Remettez les souris dans la cage et surveillez-les pour détecter d’autres saignements ou des signes de détresse. Utilisez une seringue de 20 millilitres et perfuser la souris avec 10 à 20 millilitres de PBS à travers le ventricule gauche à un débit de deux à quatre millilitres par minute jusqu’à ce que le perfusat devienne clair. Retirez les reins en tenant l’artère rénale et la veine près de la papille et en coupant le vaisseau du côté opposé au rein. Retirez ensuite délicatement la capsule rénale en la décollant à la main ou à l’aide d’une paire de pinces fines stériles. Utilisez un marqueur de barrière hydrophobe et tracez le contour des sections de tissu en maintenant une distance d’au moins cinq millimètres entre le tissu et le contour de la barrière hydrophobe. Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon de blocage contenant 3 % de sérum d’âne et 0,1 % de triton dans 1 % de sérum bovin d’albumine TBS sur le dessus de la section. Incuber à température ambiante pendant une heure dans une chambre humidifiée. Diluez les anticorps primaires avec du PBS à la concentration appropriée. Pour détecter les cytokines, diluez les anticorps dirigés contre le TGF bêta-un, le PDGF-D ou le CTGF dans 50 microlitres de PBS. Ajouter l’anticorps primaire anti-Alpha SMA conjugué à Cy3 à la solution d’anticorps primaires à des dilutions de 1:200 pour marquer les myofibroblastes. Retirez le tampon de blocage et ajoutez les anticorps primaires à la section, en veillant à ce qu’il ne s’échappe pas du contour hydrophobe circulaire. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Retirez la chambre humidifiée de l’incubateur et lavez les lames avec du PBS trois fois pendant cinq minutes. Ensuite, diluez les anticorps secondaires appropriés à un à 200 avec du PBS. Incuber les échantillons avec 50 microlitres de solutions d’anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans une chambre humidifiée. Retirez les lames de la chambre humidifiée et lavez-les avec du PBS pendant cinq minutes. Diluer la lectine de lotus tetragonolobus conjuguée à la fluorescéine dans le PBS avec du calcium et du magnésium à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Ensuite, incubez les mouchoirs avec 50 microlitres de solution LTL pendant 30 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée. Retirez les lames de la chambre humidifiée et lavez-les avec du PBS avec du calcium et du magnésium pendant cinq minutes. Incuber les tissus avec 50 microlitres de DAPI pour colorer les noyaux d’ADN pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez une fois avec du PBS. Ajoutez 20 microlitres de réactif de montage anti-décoloration dans le mouchoir pour monter les lamelles, puis placez lentement la lamelle. Attendez 24 heures que le réactif anti-décoloration se solidifie avant d’imager. Allumez le microscope inversé avec une platine XY automatisée et sélectionnez l’objectif 20x. Placez la lame sur la platine du microscope et localisez la section de tissu. Ouvrez ensuite le logiciel d’acquisition d’images et cliquez sur en direct pour ouvrir la fenêtre de visualisation en direct. Trouvez la section du tissu en vous assurant qu’elle est nette. Cliquez sur le menu Acquérir et sélectionnez Numériser une grande image. Configurez la zone à scanner en déplaçant la platine à l’aide du joystick vers la partie la plus à gauche de la section du tissu, puis cliquez sur la flèche gauche. Répétez cette opération pour les segments de tissu le plus haut, le plus à droite et le plus bas. Cliquez sur le menu d’acquisition et assurez-vous que la case de capture multicanal est cochée. Pour capturer des images multicanaux, cliquez sur l’onglet lambda, cliquez sur chaque canal et réglez le temps d’exposition à un niveau où la coloration est apparente sans saturer aucune partie de l’image. Répétez cette opération pour chaque canal à collecter. Cliquez ensuite sur Scan. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et cliquez sur Fichier. Cliquez ensuite sur Ouvrir et sélectionnez l’image. Faites un clic droit sur la fenêtre de l’image et choisissez Polygonal ROI. Décrivez le retour sur investissement à l’aide d’un outil à main levée. Décrivez ensuite les cellules tubulaires LTL positives ou les cellules interstitielles alpha SMA positives. Cliquez sur l’onglet mesure puis sur le seuil. Configurez les limites de seuil supérieure et inférieure en ajustant les curseurs de chaque côté de la zone du signal positif. Cliquez ensuite sur l’onglet ROI. Enfin, cliquez sur l’icône d’exportation pour enregistrer les valeurs. Utilisez un tableur pour calculer les pourcentages de la zone de signal positif par zone de retour sur investissement.

[Présentateur] Les vésicules bêta positives du TGF le troisième jour après l’administration de cisplatine ou de solution saline sont montrées dans les images représentatives. Des vésicules bêta-positives au TGF sont observées dans les PTC marqués avec LTL dans les reins traités au cisplatine en présence de BFA. Cependant, ces vésicules n’ont pas été observées chez les reins non blessés ou non traités par l’AFF.

[Instructeur] La modification a révélé une augmentation de la zone bêta positive du TGF avec le traitement par BFA dans les lésions rénales aiguës induites par le cisplatine. Semblable au TGF bêta, les vésicules PTGF-D positives ou CTGF positives se sont également accumulées avec le traitement BFA dans l’IRA induite par le cisplatine. La quantification a démontré que les zones positives pour le PDGF-D et le CTGF étaient également significativement augmentées avec l’ABF Dans les cellules tubulaires proximales LTL positives, l’injection d’ABF n’a pas augmenté de manière significative les taux plasmatiques d’OUN le troisième jour après l’injection de cisplatine. Des vésicules bêta positives au TGF ont été observées dans les cellules interstitielles marquées par l’alpha SMA dans l’IRA au cisplatine avec traitement BFA. La modification a révélé que les zones bêta positives du TGF dans la zone positive de l’alpha SMA étaient significativement augmentées avec le traitement par BFA dans l’IRA au cisplatine. Semblable aux vésicules bêta-positives au TGF, les vésicules positives au CTGF ont également augmenté avec le traitement BFA. La quantification a démontré que le traitement par BFA améliorait le rapport entre la zone positive CTGF et la zone positive pour l’AS alpha dans l’IRA induite par le cisplatine. Par rapport aux lésions induites par le cisplatine, les vésicules positives au TGF-bêta dans les PTC étaient beaucoup plus petites dans la phase chronique de l’AA. Il y avait une coloration positive minime dans les PTC positifs LTL. Cependant, l’intensité du signal du TGF bêta dans la molécule de lésion rénale 1 positive PTC a été augmentée avec le traitement BFA. Le niveau d’intensité moyen du TGF bêta était trois fois plus élevé avec l’injection de BFA que sans BFA.

L’étape la plus critique consiste à s’assurer que l’injection de la veine caudale est réussie. Une injection ratée fausserait les résultats. Donc, s’il vous plaît, recherchez les signes de succès comme la veine qui devient claire avec l’injection et s’il vous plaît recherchez les signes d’échec comme l’enflure sur les queues.

L’injection de Brefeldin A pourrait être combinée à un certain nombre de tests, y compris le transfert Western ou la cytométrie en flux, pour évaluer la production de cytokines à l’échelle d’un organe ou d’une cellule unique.

Grâce à cette technique, nous avons pu identifier de nouvelles cytokines sécrétées par les cellules épithéliales rénales que l’on pensait auparavant provenir d’autres types de cellules. Il peut être utilisé pour régler des débats de longue date sur la contribution de types de cellules spécifiques aux blessures.