Un contraste de trois techniques d’inoculation utilisées pour déterminer la race de Fusarium oxysporum f.sp. inconnu niveum Isolats

Ce protocole peut aider les personnes impliquées dans la communauté de la pastèque à évaluer l’agent pathogène du fusarium flétri, ce qui aidera à déterminer les populations d’agents pathogènes présentes et à le gérer efficacement. Le flétrissement de fusarium de typage de race est complexe et prend beaucoup de temps à compléter, et le fait d’avoir trois options viables de bioessais de typage de race permettra aux utilisateurs de choisir la méthode la mieux adaptée à leurs conditions expérimentales. Les trois méthodes aident les praticiens de la santé des plantes à diagnostiquer la gravité potentielle des infections à flétrir le fusarium liées à un isolat spécifique.

Cette information permet de prendre des décisions éclairées et efficaces en matière de gestion intégrée de la maladie. Pour commencer la préparation de la plantation, remplissez les appartements de départ de 8x16 cellules avec du milieu de plantation tout en tapotant pour comprimer le sol. Ensuite, semez des graines dont le sommet pointe vers le haut jusqu’à une profondeur égale à leur longueur.

Une fois les graines semées, couvrez le milieu contenant les graines enterrées avec de la terre de Fuller à une profondeur de 0,3175 à 0,635 centimètre, puis vaporisez les plats pour amortir le milieu sans créer d’eau stagnante ou de mise en commun. Ensuite, gardez le milieu humide en brumisant pendant 20 secondes toutes les 180 minutes pendant cinq jours jusqu’à la germination des graines. Après la germination, arrosez les appartements une fois par jour.

Cinq jours après la plantation, placez des disques de papier infiltrés de 1 à 1,25 centimètre de diamètre contenant l’isolat préféré de fusarium oxysporum sur un milieu de jus V8 clarifié et une gélose au dextrose de pomme de terre de 1/4 de force, ou plaque de milieu QPDA, pour les stocker dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant huit jours. Le huitième jour, transférez les plaques V8 et QPDA dans une armoire de biosécurité avant de déloger les conidies en grattant un épandeur de cellules stériles sur la surface moyenne et regroupez la suspension de conidies liquides dans un tube de culture stérile de 50 millilitres. Ensuite, quantifiez le nombre de spores et préparez la solution finale d’inoculum en transférant le volume calculé d’environ 1 million de spores dans le tube de culture stérile frais et en portant le volume total à 30 millilitres avec de l’eau désionisée stérile.

Pour préparer l’inoculation, placez des plateaux en polystyrène 6x12 cellules préalablement désinfectés avec de l’eau de Javel à 10% et bien rincés pour recevoir les plantes inoculées. Plusieurs heures avant l’inoculation, arrosez soigneusement les plantes. Deux heures après l’arrosage, retirez les plantules des plaques de polystyrène 8x16 et rincez leurs racines.

Ensuite, stockez temporairement les plantes rincées dans des récipients propres avec de l’eau du robinet jusqu’à leur utilisation, en gardant les cultivars séparés les uns des autres. Plus tard, séparez les plantules en groupes de six individus et gardez les groupes de semis enveloppés dans des serviettes en papier humides sur un plateau de laboratoire. Placez 25 à 30 centimètres cubes de sol dans le fond de chaque cellule du plateau en polystyrène 6x12 et utilisez une bouteille de gicleurs pour mouiller le sol jusqu’à ce qu’il soit visiblement humide.

En commençant par le contrôle sain, placez un groupe des six plants non endommagés du même cultivar dans les tubes de 50 millilitres contenant l’inoculum. Pour inoculer, vortex les tubes de plantules avec des racines immergées pendant 30 secondes. Ensuite, placez une seule plantule par cellule dans les plats en polystyrène 6x12 avec les plantes du même cultivar dans une colonne du plateau.

Couvrir les plantules avec du milieu de plantation et fixer doucement. Utilisez une seringue pour mouiller le plantule avec 20 millilitres d’eau tout en évitant les éclaboussures. Lorsque toutes les plantules ont été replantées, placez les plantules pendant la nuit dans un environnement sombre fermé avec une température moyenne de 27 degrés Celsius.

Pour infester les grains, préparez l’inoculum en isolant et en cultivant une souche de fusarium oxysporum niveum sur une plaque de QPDA au point que sa croissance couvre la moitié de la plaque. Préparez les grains en ajoutant de l’eau du robinet stérile aux flacons en verre d’un litre d’Erlenmeyer contenant 200 grammes de grains pour couvrir complètement les grains jusqu’à au moins cinq centimètres. Après avoir trempé les grains dans les flacons à 24 degrés Celsius pendant deux heures, égouttez l’eau de la fiole et boucher l’ouverture de la fiole avec un morceau de rouleau de coton enveloppé dans une toile à fromage avant de recouvrir l’ouverture d’une pellicule d’aluminium.

Stériliser les flacons dans l’autoclave sur un cycle de gravité pendant une heure avec cinq minutes de temps de séchage, puis laisser les flacons refroidir à la température ambiante. Transférer les grains dans un sac de culture de champignons avec un filtre. Retirez l’air du sac, puis pliez l’excès de plastique autour de celui-ci.

Placez le sac dans un bac en plastique sans danger pour l’autoclave et couvrez le bac avec une pellicule d’aluminium, puis autoclavez à nouveau en utilisant les mêmes réglages qu’auparavant. Après l’autoclavage, laissez le champignon incuber sur les grains dans le sac pendant trois semaines. Utilisez un alésage de liège stérile de taille numéro quatre pour couper des disques de gélose de six millimètres de diamètre de la zone de croissance active sur la plaque de culture.

Dépliez le sac pour placer cinq disques de gélose avec une technique stérile stricte. Utilisez un cylindre gradué stérile de 50 millilitres pour mesurer et ajoutez 35 millilitres d’eau du robinet stérile au sac. Remplissez un pot en plastique avec un terreau, puis ajoutez la quantité mesurée de terreau dans un grand sac en plastique contenant 14 grains de grains infestés.

Créez un coussin d’air dans le sac et scellez-le fermé avant de mélanger les grains et la terre en inversant le sac plusieurs fois. Une fois cela fait, remplissez un pot stérilisé en surface avec le mélange de sol infesté. Répétez le processus pour chaque variété de pastèque restante pour un total de quatre pots pleins de sol infesté par isolat testé.

Ensuite, semez six graines de pastèque dans le pot avec l’extrémité apex de la graine tournée vers le haut. À l’aide d’un vaporisateur, mouillez les 0,3 à 0,6 centimètres supérieurs de sol avec de l’eau, puis placez un plat en plastique transparent sous et sur chaque pot. Remplissez 48 inserts de cellules avec du sable pasteurisé à la vapeur, de la tourbe, de la vermiculite dans un rapport de 4: 1: 1 et tapez sur les inserts pour comprimer le sol.

Ensuite, placez les inserts dans des plateaux en plastique et semez les graines comme expliqué précédemment. Sept jours avant la plantation, inoculez cinq plaques QPDA avec du papier infiltré pour les stocker dans une zone incubée pendant huit jours sur un cycle sombre de 14 heures / 10 heures. Le septième jour, transférer deux bouchons de gélose d’un centimètre carré dans chaque fiole d’Erlenmeyer de 250 millilitres contenant 100 millilitres de dextrose de pomme de terre et placer les fioles d’Erlenmeyer sur un agitateur de paillasse.

Le jour de l’inoculation, récoltez les spores en filtrant l’inoculum à travers quatre couches de tissu de fromage stérile pour déterminer la concentration micro-cidiale de la fiole. 14 jours après le semis, transférez les inserts cellulaires avec les semis dans le plateau palmé, puis placez le plateau palmé avec les semis dans une baignoire en plastique contenant les sept litres de suspension d’inoculum. Après 15 minutes de conservation de l’inoculum, transférez les inserts cellulaires contenant les plants inoculés dans des plateaux sans trou et placez les plateaux sans trou sur le banc de la serre, puis arrosez au besoin.

Maintenir l’éclairage et les conditions environnementales décrites précédemment pour l’essai biologique de trempage racinaire. Selon la méthode utilisée, commencez l’évaluation en observant et en calculant l’incidence du flétrissement et de la mort des plantes et prenez des images numériques pour documenter la progression de la maladie. Dans la méthode modifiée de trempage des plateaux, les cultivars Black Diamond et Charleston Gray infectés par un isolat de race 2 ont présenté des symptômes graves et sont décédés.

En revanche, le cultivar Citrullus amarus PI a montré une résistance. Dans la méthode de trempage des racines, les semis infectés par un isolat de race 0 ont pour la plupart survécu, tandis que presque tous les semis infectés par un isolat de race 3 sont morts. Dans la méthode du noyau infesté, les cultivars Sugar Baby et Charleston Gray cultivés dans un sol infesté par la race 2 ont commencé à flétrir et à mourir, tandis que les plantes Citrullus amarus PI semblent toujours en bonne santé.

N’oubliez pas de semer et d’entretenir les plantes de manière appropriée, de vérifier la viabilité de l’isolat d’agent pathogène, de comprendre les techniques uniques de chaque méthode d’inoculation et d’être cohérent lors de l’évaluation des symptômes de la maladie. Avec les résultats de ces méthodes, les chercheurs peuvent étudier les déterminants génétiques sous-jacents régissant l’expression de la variance différentielle entre les isolats par séquençage et analyse génomique comparative. En utilisant ces méthodes, les chercheurs ont pu évaluer la prévalence de différents phénotypes de virulence à différents endroits et comparer ces phénotypes avec des éléments génétiques observables.