Name: Exploration du méthylome d’arginine par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Découvrez la quantification de la méthylation de l'arginine par spectroscopie RMN 1H pour la recherche en biochimie et oncologie. Cette méthode simple s'applique aux cellules, tissus et biofluides pour évaluer les biomarqueurs.

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Le travail a été soutenu par les subventions P28854, I3792 du Fonds autrichien pour la science (FWF), doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (projet phare DYNIMO), les subventions 864690 de l’Agence autrichienne de promotion de la recherche (FFG) et 870454, le Centre de recherche sur le métabolisme intégratif de Graz; Programme d’infrastructure autrichien 2016/2017, gouvernement styrien (Zukunftsfonds) et Fonds de démarrage pour les talents de haut niveau de l’Université médicale du Fujian (XRCZX2021020). Nous remercions le Centre de recherche médicale pour l’accès aux installations de culture cellulaire. F.Z. a été formé dans le cadre du programme de doctorat en médecine moléculaire de l’Université médicale de Graz. Q.Z. a été formé dans le cadre du programme de doctorat sur les maladies métaboliques et cardiovasculaires de l’Université médicale de Graz.

Des hydrolysats de protéines de levure ont été utilisés comme échantillons pour les résultats représentatifs de ces travaux. L’ensemble du protocole est résumé à la figure 1.
1. Préparation des matériaux et des réactifs
<ol><li>Méthanol/eau : préparer un mélange de deux parties de méthanol à 99 % (MeOH) et d’une partie deH2O, désigné comme MeOH/H 2O. Entreposer le MeOH pur et le MeOH/H2Oà -20°C pour minimiser l’évaporation de l’alcool et augmenter la stabilité de l’échantillon.</li>
	<li>Acide chlorhydrique (HCl) : diluer 9 mol/L de HCl concentré (12,0 mol/L ou 37 %) ainsi que 0,1 mol/L de HCl. La solution concentrée plus élevée (9 mol/L) est utilisée pour l’hydrolyse des protéines, tandis que la solution concentrée plus faible (0,1 mol/L) est utilisée pour l’extraction en phase solide. ATTENTION : Travaillez à l’intérieur de la hotte.</li>
	<li>Préparer une solution de remplacement pour SPE contenant 10 % d’une solution d’ammoniac saturée (stock : 30 % p/p d’ammoniac), 50 % de méthanol et 40 % d’eau (v/v).</li>
	<li>Tampon RMN : Dissoudre 5,56 g d’hydrogénophosphate disodique (Na2 HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g de sel de sodium de l’acide 3-(triméthylsilyl)propionique-2,2,3,3-d4 (PTS, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) d’azoture de sodium (NaN3) dans 500 mL de dioxyde de deutérium (D2O) et ajuster à pH7,4 (en utilisant HCl ou NaOH, respectivement) (voir le tableau des matières). Vérifier la pureté de chaque nouveau lot tampon par spectroscopie RMN. REMARQUE : La quantité de contaminants (p. ex. éthanol) doit être aussi faible que possible.</li>
	<li>Remplir les tubes de mise en pâte avec des billes d’oxyde de zirconium (les tubes de 2 mL et les billes de 1,4 mm conviennent à la plupart des applications, mais différentes variantes sont disponibles) (voir le tableau des matériaux). Remplissez environ 10 à 20 perles à la main ou achetez des tubes préremplis, qui sont également disponibles.</li>
	<li>Gardez les pipettes et les embouts respectifs prêts dans la plage de 10 à 1 000 μL. REMARQUE : De l’eau très pure, désignéeH 2 O, définie par une résistance élevée de ≥18,2 MΩ·cm-1, a été utilisée tout au long des travaux. Elle correspond à de l’eau distillée double.</li>
</ol>2. Prélèvement et stockage des échantillons
<ol><li>Congeler rapidement les échantillons liquides (sérum/plasma, surnageant de culture cellulaire, etc.) avec de l’azote liquide et les conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Préparez les matériaux solides comme mentionné ci-dessous.<ol><li>Recueillir les cellules à partir de cultures cellulaires (3 à 5 millions de cellules) soit en collectant des cellules adhérentes, après lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate froid, grattage et centrifugation, soit par centrifugation directe des cellules cultivées en suspension.</li>
		<li>Retirer les surnageants cellulaires (qui peuvent être collectés pour une analyse plus approfondie, soit par mesure directe consécutive, voir étape 6, soit après précipitation des protéines solubles, voir étape 3.1), puis congeler les pastilles avec de l’azote liquide et les conserver à -80 °C. Pour un traitement plus approfondi, voir l’étape 3.2.</li>
		<li>Stocker et collecter les tissus conformément à l’objectif de l’étude. Pour les tissus très homogènes, tels que le foie ou le muscle, analysez n’importe quelle partie de celui-ci. Par exemple, dans le cas d’un cerveau de souris, déterminer la méthylation globale de l’arginine de l’ensemble du cerveau ou des sections du cerveau. REMARQUE: Le poids idéal des tissus à traiter est de 30 à 60 mg. Il est conseillé de congeler et de pulvériser tout le cerveau et d’utiliser des aliquotes de celui-ci. Alternativement, des parties spécifiques du cerveau (par exemple, frontal, cervelet, régions occipitales ou un hémisphère, pesant ~ 250 mg) peuvent être utilisés.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Préparation préliminaire de l’échantillon
REMARQUE: Effectuez le travail sur la glace, en gardant MeOH froid. Les échantillons doivent également être conservés sur de la glace pour éviter la dégradation des protéines.
<ol><li>Pour les échantillons liquides, ajouter 400 μL de méthanol glacé à 200 μL de l’échantillon. Passez à l’étape 3.3. REMARQUE: Si moins d’échantillon est disponible, ajustez les volumes en conséquence; La sensibilité RMN est généralement suffisamment élevée pour des échantillons plus petits, mais doit être testée individuellement.</li>
	<li>Dans le cas des matériaux solides, préparer suffisamment de tubes de 1,5 mL pour les lysats (utiliser pour la centrifugation après homogénéisation).<ol><li>Soigneusement, mais soigneusement, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 600 μL de MeOH/H2O et transférer toute la phase liquide dans les tubes de réduction en pâte.</li>
		<li>Placez les mouchoirs dans des tubes de réduction en pâte (vous pouvez les peser directement dans les tubes) et ajoutez 600 μL de MeOH/H2O (pour 30-60 mg; ajuster si le poids diffère considérablement).</li>
		<li>Mettez les tubes dans l’homogénéisateur tissulaire (voir le tableau des matériaux) et homogénéisez une fois pendant 20 s avec agitation importante (pour les granulés cellulaires, les tissus mous) ou deux fois pendant 20 s chacun (ou plus si nécessaire) avec un intervalle de 5 minutes entre les deux (pour les tissus rigides).</li>
		<li>Après homogénéisation, remettre immédiatement les échantillons sur la glace et transférer les lysats entiers dans de nouveaux tubes de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Conserver les échantillons pendant au moins 30 minutes (jusqu’à plusieurs jours) à -20 °C avant de poursuivre le traitement.</li>
	<li>Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C. En attendant, préparez suffisamment de tubes de 1,5 mL pour recueillir les surnageants. REMARQUE : Ce surnageant (désigné « (1) » dans la figure 1) peut être jeté, lyophilisé et directement traité pour la RMN (étape 6) ou analysé autrement.</li>
	<li>Dans ce protocole, le précipité de MeOH (= pastille obtenue après l’étape 3.1 ou 3.2.2, respectivement) est utilisé pour des analyses ultérieures contenant, entre autres, des composants tels que des acides nucléiques et des lipides, des protéines méthylées à l’arginine. Poursuivre l’hydrolyse des protéines ou conserver les granulés à -20 °C pendant quelques jours.</li>
</ol>4. Hydrolyse des protéines
<ol><li>Ajouter 500 μL de 9 mol/L de HCl à chaque échantillon. Ensuite, tronquez les bouchons de chaque tube avec des ciseaux et placez-les dans les tubes de culture en verre (figure 2A). Fermez soigneusement mais fermement les bouchons rouges (vérifiant ainsi l’étanchéité). REMARQUE: Avant utilisation, vérifiez toujours chaque étanchéité (feuille PTFE grise à l’intérieur des bouchons à vis rouges) pour un serrage approprié et nettoyez-les régulièrement avec de l’eau.</li>
	<li>Une fois terminé, placez les tubes dans un bécher partiellement rempli de sable (pour un meilleur transfert de chaleur) et hydrolysez les échantillons pendant environ 16 h à 110 °C dans une chambre de séchage.</li>
	<li>Après hydrolyse, refroidir les échantillons (~1 h).</li>
	<li>Après cela, lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’une centrifugeuse à vide poussé (inférieur à 100 Pa).</li>
	<li>Dissoudre les pastilles - si elles sont complètement sèches (sinon, poursuivre la lyophilisation) - dans 1 mL de 0,1 mol/L de HCl et ajouter 50 μL de chloroforme (CHCl3) dans chaque tube; Dissoudre soigneusement la pastille avec une pipette de 1 000 μL, mélangeant ainsi les liquides, puis transférer le volume complet dans un nouveau tube. ATTENTION: Toujours travailler avec de petites quantités pour minimiser l’évaporation importante</li>
	<li>Ensuite, centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Recueillir soigneusement la phase supérieure du liquide biphasique contenant la fraction soluble dans l’eau (Figure 2B, la fraction de densité inférieure) à l’aide d’une pipette et la remplir dans de nouveaux tubes. Utiliser des tubes de 1,5 mL pour l’EPS manuelle (section 5.2) ou des flacons en verre pour l’EPS robotisée (section 5.3 et figure 2D). Éviter de renverser la CHCl3 et son contenu (figure 2C).</li>
</ol>5. Extraction en phase solide (SPE)
<ol><li>Avant la première utilisation, nettoyer les cartouches SPE deux fois avec 1 mL de la solution de remplacement (étape 1.3) suivie d’une centrifugation à 800 x g pendant 1 min à température ambiante (placées dans des tubes de 15 mL). Ils peuvent être utilisés 10 à 20 fois chacun.</li>
	<li>SPE manuelle<ol><li>Préconditionner les cartouches (voir le tableau des matériaux) à chaque passage avec 1 mL de méthanol pur et 2 x 1 mL de PBS, suivi à chaque fois d’une centrifugation à 800 x g pendant 1 min à température ambiante (placées dans des tubes de 15 mL).</li>
		<li>Ensuite, chargez les échantillons (à partir de l’étape 4.7) sur les cartouches SPE et centrifugez-les à 600 x g pendant 2 min à température ambiante.</li>
		<li>Ensuite, appliquez un cycle de lavage comme mentionné ci-dessous.<ol><li>Ajouter trois fois 1 mL deH2O(chacun suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).</li>
			<li>Ajouter cinq fois 1 mL de 0,1 mol/L de HCl (chacun suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).</li>
			<li>Ajouter deux fois 1 mL de MeOH (suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).</li>
		</ol></li>
		<li>Ensuite, éluer l’arginine et ses dérivés avec 3 x 1 mL de solution de remplacement (suivie d’une centrifugation 1 min à 800 x g à température ambiante) dans un seul tube de 15 mL. NOTE: La solution de remplacement sert d’éluant pour l’arginine et ses dérivés et est également utilisée pour nettoyer les cartouches (toutes les substances sont soit éliminées avant élution, soit à la valeur de pH de base de la solution de remplacement). Néanmoins, pour éviter la contamination au fil du temps, la réutilisation doit être limitée (voir étape 5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>SPE robotique NOTE: Ici, un robot de pipetage (la partie principale consistant en une aiguille de pipetage, une station de lavage pour l’aiguille, une alimentation en réactif et des positions pour les échantillons et les éluats, voir Tableau des matériaux) est fourni avec un porte-cartouche pour les colonnes SPE. Pour les autres instruments, assurez-vous d’être entièrement équipé avec tout ce qui est énuméré.<ol><li>Remplir le surnageant (à partir de l’étape 4.7) directement dans des flacons en verre avec un scellage en PTFE (Figure 2D), préparer suffisamment de réactifs (100 mL de chaque, c’est-à-dire une solution de remplacement, 99 % de MeOH, PBS, H 2 O et 0,1 de HCl mol/L), des tubes de 5 mL pour l’élution et une solution delavage pour l’aiguille du robot (habituellement H2O).</li>
		<li>Utiliser une application ou une méthode dans le logiciel du robot en se basant précisément sur les étapes décrites pour l’EPS manuelle (étape 5.2). REMARQUE: Les détails peuvent varier considérablement d’un fournisseur d’instruments à l’autre, reportez-vous donc au manuel du logiciel du robot respectif pour la programmation. Un robot de pipetage fonctionne généralement en appliquant une pression d’air sur les cartouches au lieu de la centrifugation, ce qui est la principale différence. Si le protocole est établi et exécuté pour la première fois, inclure des contrôles (par exemple, L-arginine de concentration connue) pour vérifier un flux de travail optimal.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Préparation finale pour la RMN
<ol><li>Lyophiliser les échantillons pendant la nuit pour compléter la sécheresse afin de se débarrasser de l’ammoniac et deH2O.</li>
	<li>Dissoudre chaque échantillon dans 500 μL de tampon RMN (étape 1.4) et transférer dans des tubes RMN. Il est important de noter que le volume doit être le même dans tous les tubes et que les échantillons doivent être homogènes (exempts de résidus et de lipides, qui ont tendance à s’agréger). NOTE: Les détails de la spectroscopie RMN vont au-delà de cet examen de la méthode et sont décrits plus en détail ailleurs27. Ici, seules les principales exigences et étapes sont expliquées. La quantification de l’arginine et de ses métabolites est effectuée sur un spectromètre RMN de 600 MHz (voir le tableau des matériaux). En principe, tout autre spectromètre RMN/intensité de champ RMN peut être utilisé, à condition que les signaux RMN de l’arginine et des arginines méthylées puissent être détectés avec une sensibilité suffisante et sans chevauchement de signaux. Toute tête de sonde avec des gradients d’axe z capables d’enregistrer 1spectre H peut être utilisée, à condition que les séquences d’impulsions soient configurées en conséquence.</li>
	<li>Enregistrer un spectre 1D en utilisant la séquence d’impulsions CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 balayages, taille de fid 73728, largeur spectrale 11904,76 Hz sur une RMN de 600 MHz, délai de recyclage 4 s) avec suppression du signal d’eau par présaturation.</li>
	<li>Dans ces expériences, supprimez les couplages scalaires de 1H par découplage virtuel, réduisant ainsi le chevauchement du signal. Enregistrer des questions spécifiques et/ou des échantillons ou matrices complexes, p. ex., 1 H-13C-hétéronucléaire spectre de cohérence quantique unique (HSQC)27. NOTA : Pour les matrices plus complexes dans lesquelles les signaux RMN de 1 H d’arginines méthylées pourraient être partiellement chevauchés avec des signaux RMN de 1 H d’autres métabolites (p. ex. lysine), des spectres homonucléaires résolus en J (JRES)35 de 1H sont requis. </li>
	<li>Effectuer une quantification absolue en intégrant les intensités de crête respectives des étalons d’une concentration connue, par exemple, 100 μmol/arginine. REMARQUE : Habituellement, l’ADMA, la SDMA et le MMA (voir le tableau des matières) sont déclarés comme un rapport par rapport à l’arginine. Cela présente un avantage significatif qu’aucune normalisation distincte (p. ex. nombre de cellules, masse tissulaire, concentrations de protéines) ne doit être effectuée. Dans ce cas, l’arginine sert d’étalon interne, et la quantification relative est suffisante pour obtenir des informations biologiquement pertinentes.</li>
	<li>Pour la différenciation de la SDMA et du MMA, lyophiliser à nouveau les échantillons pour se débarrasser deD2O(s’ils ont été remis en suspension dans un tampon RMN auparavant), qui est ensuite remplacé par du diméthylsulfoxyde deutéré (d6-DMSO), permettant la résolution des résonances méthyliques27. Par conséquent, aspirez les échantillons des tubes RMN avec des pipettes Pasteur, lyophilisez-les et dissolvez-les dans 500 μL de d6-DMSO.</li>
</ol>

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<li>Altincekic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+detection+of+arginine+methylation+in+highly+repetitive+protein+motifs+of+low+sequence+complexity+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).</li>
<li>Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FUS+about+arginine+methylation+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD.</a> The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Dans la section suivante, l’accent est mis sur la méthode elle-même; les implications biologiques de la méthylation de l’arginine sont décrites dans la section Introduction.
Tout d’abord, les tissus de rigidité différente peuvent nécessiter un ajustement de la lyse de l’échantillon: les cellules de culture cellulaire (y compris les bactéries, les levures, etc.) et les tissus comme le cerveau, le foie jeune, les muscles lisses, etc., peuvent rapidement être homogénéisés. Pour les tissus de fort...

Au cours des deux dernières décennies, la méthylation des résidus d’arginine a été reconnue comme une modification post-traductionnelle essentielle des protéines. Il affecte les processus biologiques fondamentaux tels que la régulation de la transcription, la transduction du signal et bien d’autres1. Les principales protéines impliquées dans la régulation de la méthylation de l’arginine sont les protéines arginine méthyltransférases (PRMT)2. Les principaux dérivés de l’arginine sont la ω-(N G,N G)-diméthylarginine asymétrique (ADMA), la ω-(N G,N’G)-diméthylarginine symétrique (SDMA) et la ω-N G-monométhylarginine (MMA)2.
Les PRMT utilisent la S-adénosyl-l-méthionine pour transférer les groupes méthyle au groupe guanidino terminal (avec deux groupes aminés équivalents) de l’arginine1 liée aux protéines. Deux enzymes principales peuvent être distinguées: les enzymes de type I et de type II catalysent la première étape de méthylation pour former le MMA (qui perd ainsi sa symétrie). Après cette étape, les enzymes de type I (p. ex. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) utilisent le MMA comme substrat pour former l’ADMA, tandis que les enzymes de type II (principalement PRMT5 et PRMT9) produisent de la SDMA. PRMT1 a été la première protéine arginine méthyltransférase à être isolée à partir de cellules de mammifères3. Pourtant, les PRMT ont été conservés au cours de l’évolution4 chez d’autres animaux comme les vertébrés non mammifères, les chordés d’invertébrés, les échinodermes, les arthropodes et les nématodes cnidaires5, les plantes6 et les protozoaires, y compris les champignons comme la levure7. Dans de nombreux cas, l’élimination de l’un des PRMT entraîne une perte de viabilité, révélant le rôle essentiel des espèces d’arginine méthylée impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux tels que la transcription, la traduction, la transduction du signal, l’apoptose et la séparation de phase liquide-liquide (c’est-à-dire la formation d’organites sans membrane, par exemple des nucléoles), qui implique régulièrement des domaines riches en arginine 8,9,10 . À son tour, cela influence la physiologie et les états pathologiques, y compris le cancer 11,12,13, le myélome multiple 14, les maladies cardiovasculaires15, la pathogenèse virale, l’amyotrophie spinale 16, le diabète sucré 17 et le vieillissement1. On pense que l’augmentation des taux d’ADMA dans la circulation sanguine, par exemple dérivée du poumon18 en raison de la dégradation des protéines, est liée à un dysfonctionnement endothélial, à une maladie pulmonaire chronique19 et à d’autres syndromes de maladie cardiovasculaire20. La surexpression des PRMT a été trouvée pour accélérer la tumorigenèse et est associée à un mauvais pronostic21,22. Par ailleurs, l’ablation de PRMT6 et PRMT7 déclenche un phénotype de sénescence cellulaire23. Une diminution significative de l’ADMA et du PRMT1 a été observée au cours du vieillissement des fibroblastes WI-3824.
Le défi consiste à comprendre comment la méthylation agit dans les processus (physio)physiologiques en identifiant et en quantifiant la méthylation de la protéine arginine. La plupart des approches actuelles utilisent des anticorps pour détecter les arginines méthylées. Cependant, ces anticorps sont toujours spécifiques au contexte et pourraient ne pas reconnaître différents motifs des protéines méthylées de l’arginine25,26. Dans le protocole décrit, tous les dérivés de l’arginine mentionnés ci-dessus peuvent être quantifiés de manière fiable par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), c’est-à-dire seuls, en combinaison ou, comme dans la plupart des cas, dans des matrices biologiques complexes comme les cellules eucaryotes (par exemple, de levure, de souris ou d’origine humaine) et les tissus27, ainsi que le sérum28. Pour les protéines et ces matrices complexes, l’hydrolysedes protéines 29 est une condition préalable à la génération d’acides aminés libres (modifiés), tels que l’arginine, le MMA, la SDMA et l’ADMA. L’extraction en phase solide (SPE)30 permet l’enrichissement des composés d’intérêt. Enfin, la spectroscopie 1H-RMN permet la détection parallèle de l’arginine et de tous les principaux dérivés méthyliques de l’arginine. La spectroscopie RMN présente l’avantage d’être véritablement quantitative, hautement reproductible et d’être une technique robuste31,32. Les mesures RMN finales peuvent être effectuées par la suite lorsque de nombreux échantillons ont été prélevés et préparés. Enfin, ce protocole se concentre principalement sur la préparation des échantillons car cela ne nécessite pas de spectromètre RMN propre. Il peut être effectué dans la plupart des laboratoires biochimiques. Néanmoins, quelques indices sur lesquels les mesures de spectroscopie RMN devraient être effectuées sont fournis dans ce travail.

<table><tbody><tr><td>Tubes de 15 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>3-(triméthylsilyl)acide propionique-2,2,3,3-d4 sel de sodium (TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 5 mL, fond rond</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’ammoniac 32 %</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Spectromètre RMN 600 MHz, équipé d’une tête de sonde TXI</td><td>Bruker</td><td>- </td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse, réfrigérée, par ex. 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform &ge ; 99 % par an</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Fluide caloporteur Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>pour système SpeedVac</td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium (D2O)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Liant de chambre de séchage</td><td></td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture DURAN, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards Pompe à huile pour vide profond RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>partie du système SpeedVac</td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf 1,5 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Gilson Robot de pipetage GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td>26150008</tr><tr><td>L-arginine</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol &ge ; 99 %</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q aparatus d’eau</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartouches</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr> <tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 homogénéisateur de tissus</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr> <tr><td>Tubes Precellys (tubes de mise en pâte)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Precellyse 1,4 mm billes d’oxyde de zirconium</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap Modules de chauffage, d’agitation et d’évaporation</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 Rotor pour tubes de 1,5 mL, FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant Piège réfrigéré</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>partie du système SpeedVac</td></tr><tr><td>Concentrateur sous vide Savant SpeedVac SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>partie du système SpeedVac ; équipé avec rotor pour tubes de 1,5 ml</td></tr><tr><td>Bouchons à vis pour flacons en verre avec étanchéité en PTFE, DN9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en verre à filetage court 1,5 mL, ND9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (Logiciel)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&omega ;-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega ;-NG-monomethylarginine (MMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega ;-NG-NG'-diméthylarginine symétrique (SDMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

exploration du méthylome d’arginine par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

L’arginine liée aux protéines est généralement méthylée dans de nombreuses protéines et régule leur fonction en modifiant les propriétés physico-chimiques, leur interaction avec d’autres molécules, y compris d’autres protéines ou acides nucléiques. Ce travail présente un protocole facilement réalisable pour quantifier l’arginine et ses dérivés, y compris la diméthylarginine asymétrique et symétrique (ADMA et SDMA, respectivement) et la monométhylarginine (MMA). Après l’isolement des protéines à partir de fluides corporels biologiques, de tissus ou de lysats cellulaires, une méthode simple d’homogénéisation, de précipitation des protéines et d’hydrolyse des protéines est décrite. Étant donné que les hydrolysats contiennent de nombreux autres composants, tels que d’autres acides aminés, lipides et acides nucléiques, une étape de purification par extraction en phase solide (SPE) est essentielle. L’EPS peut être effectuée manuellement à l’aide de centrifugeuses ou d’un robot de pipetage. La sensibilité pour ADMA utilisant le protocole actuel est d’environ 100 nmol/L. La limite supérieure de détection de l’arginine est de 3 mmol/L en raison de la saturation SPE. En résumé, ce protocole décrit une méthode robuste, qui s’étend de la préparation d’échantillons biologiques à la détection basée sur la RMN, fournissant des conseils précieux et des pièges pour un travail réussi lors de l’étude du méthylome d’arginine.

Régulièrement, des projections 1H 1D de spectres RMN 2D résolus en J (JRES), virtuellement découplés, sont utilisées pour les assignations de pics et les quantifications dans notre laboratoire36. La figure 3 montre des spectres JRES représentatifs d’hydrolysats de protéines de levure purifiés à l’aide du protocole SPE actuel. Bien qu’à des concentrations très différentes, les deux substances peuvent être séparées et quantifiées dans une matrice cellulaire. ...

Le présent protocole décrit la préparation et la mesure quantitative de l’arginine libre et liée aux protéines et des méthyl-arginines par spectroscopie RMN 1H.

Exploration du méthylome d’arginine par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Ce protocole permet de quantifier les niveaux et la dynamique de méthylation de l’arginine. Cette modification joue un rôle régulateur important et pourrait servir de biomarqueur de la maladie. L’avantage de cette méthode est qu’elle fournit un flux de travail simple pour un nombre presque illimité de matrices allant des cellules, des milieux aux tissus et aux biofluides.La méthylation de l’arginine est élevée dans de nombreux cancers humains et les premiers inhibiteurs de la méthode arginine transférases sont testés dans des essais cliniques. Cette méthode pourrait aider à la stratification des patients et à l’évaluation des risques. Hansjorg Habisch, un technicien de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour les échantillons liquides, ajouter 400 microlitres de méthanol glacé à 200 microlitres de l’échantillon, puis incuber pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius. Centrifuger cet échantillon à 10 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Déplacez le surnageant et recueillez la pastille dans des tubes de 1,5 millilitre.Pour les matériaux solides, ajoutez 600 microlitres d’eau à 66 % de méthanol dans des tubes de réduction en pâte contenant 30 à 60 milligrammes de granulés de tissus ou de cellules. Homogénéiser les tissus mous une fois pendant 20 secondes et les tissus rigides deux fois pendant 20 secondes avec un intervalle de cinq minutes entre les deux. Placez immédiatement l’échantillon sur de la glace et transférez tout le lysat dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, suivi d’une incubation.Ensuite, centrifuger l’échantillon à 10 000 G pendant 30 minutes. À quatre degrés Celsius, sélectionnez le surnageant dans des tubes de 1,5 millilitre et procédez à l’hydrolyse des protéines à l’aide de ce surnageant. Tronquez les bouchons de chaque tube.Ajoutez ensuite 500 microlitres d’acide chlorhydrique molaire neuf molaires à chaque échantillon. Enfin, mettez les tubes dans des tubes en verre. Fermez-les hermétiquement avec des bouchons, en veillant à une bonne étanchéité, et placez ces tubes dans un bécher en verre partiellement rempli de sable.Hydrolyser les échantillons pendant 16 heures à 110 degrés Celsius dans une chambre de séchage. Refroidir les échantillons et les lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’une centrifugeuse à vide poussé. Le lendemain, dissoudre les granulés complètement séchés dans un millilitre d’acide chlorhydrique 0,1 molaire.Ajouter 50 microlitres de chloroforme à chaque tube et dissoudre complètement la pastille à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres. Transférer le volume complet dans un nouveau tube et centrifuger les échantillons pendant 10 minutes. Recueillir soigneusement la phase supérieure du liquide biphasique dans un nouveau tube.Utilisez des tubes en plastique pour les tubes manuels ou en verre pour l’extraction robotique en phase solide. Pour l’extraction manuelle en phase solide, préconditionnez les cartouches à chaque passage, puis une centrifugation d’une minute. Ensuite, chargez l’échantillon sur des cartouches SPE et centrifugez-les à 600 G pendant deux minutes à température ambiante.Lavez les cartouches avec un millilitre d’eau trois fois, chaque lavage suivi d’une centrifugation pendant une minute. Laver ensuite cinq fois avec un millilitre d’acide chlorhydrique 0,1 molaire, puis par centrifugation pendant une minute à 800 G à température ambiante. Lavez les cartouches deux fois avec un millilitre de méthanol suivi d’une centrifugation pendant une minute.Éluter l’arginine et ses dérivés dans un seul tube de 15 millilitres en ajoutant un millilitre de trois solutions de remplacement X et centrifuger deux fois pendant une minute. Pour l’extraction robotisée en phase solide, placez les tubes pour la collecte des éluats et les tubes de verre contenant la phase supérieure du liquide biphasique dans la position respective du robot. Utilisez une application ou une méthode dans le logiciel en fonction des étapes décrites pour SPE manuel.Lyophiliser les échantillons pendant la nuit pour les sécher complètement afin de se débarrasser de l’ammoniac et de l’eau. Dissoudre chaque échantillon dans 500 microlitres de tampon RMN jusqu’à ce qu’il devienne homogène. Ensuite, transférez une quantité égale d’échantillon homogène dans chaque tube RMN.Les spectres J-RES des hydrolysats de protéines de levure purifiés à l’aide du protocole SPE sont présentés ici. Différents changements chimiques caractéristiques peuvent discriminer la L-arginine et l’ADMA à 3,25 et 3,02 parties par million. Les deux substances peuvent être séparées et quantifiées dans une matrice cellulaire.Sur la base du nombre de protons du groupe méthyle ou méthylène spécifique au décalage chimique respectif, une spectroscopie de résonance magnétique nucléaire H permet une quantification précise. En utilisant cette approche, les décalages chimiques par résonance magnétique nucléaire d’un H de la SDMA et du MMA peuvent être séparés et quantifiés par des décalages chimiques caractéristiques à 2,76 parties par million de SDMA et 2,74 parties par million de MMA. Lors de l’exécution de ce protocole, prélever soigneusement la phase supérieure du liquide biphasique contenant la fraction soluble dans l’eau avec une pipette et la transférer dans de nouveaux tubes.Utilisez des tubes de 1,5 millilitre pour le SPE manuel ou du verre de classe pour le SPE robotisé. Éviter de renverser du chloroforme et de son contenu. Les éluats contenant de l’arginine et les espèces d’arginine méthylée sont analysés par spectroscopie RMN.Cela donne des quantités absolues de ces espèces. Notre technologie est actuellement utilisée dans une pléthore de projets de recherche fondamentale visant à disséquer le rôle physiopathologique de la méthylation de l’arginine. De plus, nous évaluons la méthylation de la protéine arginine comme candidat biomarqueur dans plusieurs maladies humaines.

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Deux méthodes d’attribution des signaux de résonance magnétique nucléaire α- et ε-diméthylamine d’une lysine N-terminale 13C-méthylée réductrice sont décrites. Une méthode utilise la sélectivité induite par le pH de la réaction de méthylation réductrice, et l’autre utilise l’aminopeptidase pour éliminer sélectivement la lysine N-terminale.

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

Protéine méthylation de l'arginine, catalysée par une classe d'enzymes à savoir. Protéine arginine méthyl transférases (en PRMT), est le processus d'addition enzymatique de groupe (s) méthyle arginines à l'intérieur des protéines. Le test de méthylation in vitro est l'outil le plus fiable pour évaluer l'état de méthylation de substrats connus ou nouveaux PRMT.

In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

Les réseaux de peptides synthétisés par la méthode SPOT peuvent être utilisés pour analyser la spécificité du substrat des protéines lysine méthyltransférases (PKMT) et pour définir le spectre du substrat des PKMT afin de comprendre leur rôle biologique. Ce protocole décrit comment synthétiser des réseaux de peptides, les méthyler avec des PKMT et analyser les résultats.

Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays

La méthylation de l’ADN est capable de maintenir des niveaux stables d’expression génique et de permettre des changements dynamiques dans l’expression des gènes en réponse à une variété de stimuli. Nous détaillons les techniques qui permettent d’étudier les changements spécifiques aux gènes dans la méthylation de l’ADN et l’effet de ces changements sur l’expression des gènes.

Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l&#39;expression et l&#39;activité transcriptionnelle des astrocytes<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Ce protocole décrit la reconstitution de nucléosomes contenant différentiellement histones sœurs marqués d'un isotope. Dans le même temps, les nucléosomes asymétriquement modifications post-traductionnelles peuvent être générés après l'utilisation d'une copie préalablement modifiée de l'histone. Ces préparations peuvent être facilement utilisés pour étudier les mécanismes de modification de diaphonie, simultanément sur les deux histones sœurs, en utilisant la spectroscopie de RMN à haute...

Reconstitution de nucléosomes avec histones soeurs Différentiellement Isotope marqués

La méthylation de l’arginine (R) est une modification post-traductionnelle généralisée régulant de multiples voies biologiques. La spectrométrie de masse est la meilleure technologie pour établir le profil global du R-méthyl-protéome, lorsqu’elle est couplée à des approches biochimiques pour l’enrichissement peptidique modifié. Le flux de travail conçu pour l’identification à haut niveau de confiance de la R-méthylation globale dans les cellules humaines est décrit ici.

Une approche protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse globale et à haut niveau de confiance de la R-méthylation des protéines

Ces protocoles fournissent la méthodologie utilisée pour évaluer l’activité enzymatique de membres individuels de la famille de la méthyltransférase d’arginine de protéine (PRMT) dans les cellules. Des directives détaillées sur l’évaluation de l’activité de PRMT utilisant des biomarkers endogènes et exogènes, la méthyl-arginine reconnaissant des anticorps, et les composés d’outil d’inhibiteur sont décrites.

Méthodes quantitatives pour étudier l’activité de la protéine Arginine méthyltransférase 1-9 dans les cellules

Nous présentons ici un protocole détaillant l’acquisition, le traitement et l’analyse d’une série d’expériences RMN visant à caractériser les interactions protéine-glycane en solution. Les méthodologies les plus courantes basées sur les ligands et les protéines sont décrites, qui contribuent sans aucun doute aux domaines de la glycobiologie structurale et des études de reconnaissance moléculaire.

Démêler les interactions glycanes-protéines : la résonance magnétique nucléaire (RMN) à la rescousse

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer semi-quantitativement les niveaux globaux de m⁶A en utilisant le blot de points. L’ARN total est extrait, dénaturé, taché sur une membrane en nylon, sondé avec un anticorps anti-m⁶A, et visualisé par chimiluminescence. L’intensité du signal, quantifiée par l’analyse en niveaux de gris ImageJ, reflète l’abondance relative de méthylation, offrant un flux de travail reproductible pour la recherche.

Essai par blot de points pour détecter les niveaux globaux de modification de l’ARNde la N 6-méthyladenosine

La polarisation nucléaire dynamique avec dissolution ultérieure de l’échantillon a permis d’étudier en temps réel le métabolisme dans les systèmes biologiques. Le [1-13-C]pyruvate hyperpolarisé a été utilisé pour étudier in vitro l’activité de la lactate déshydrogénase dans une lignée cellulaire de carcinome de la prostate.

hyperpolarisé 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Découvrez la quantification de la méthylation de l'arginine par spectroscopie RMN 1H pour la recherche en biochimie et oncologie. Cette méthode simple s'applique aux cellules, tissus et biofluides pour évaluer les biomarqueurs.

Exploration du méthylome d’arginine par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire

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