Name: Approches de cartographie chimique pour étudier l’infection à trypanosomatidé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Découvrez la cartographie chimique pour modéliser la distribution des métabolites et parasites trypanosomatidés en 3D. Cette méthode permet d'analyser les perturbations métaboliques tissulaires et leurs liens avec la pathogenèse.

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Laura-Isobel McCall, Ph.D., est titulaire d’un prix Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease du Burroughs Wellcome Fund. Les auteurs souhaitent en outre reconnaître le soutien du numéro de prix R21AI148886 des NIH, d’une subvention pilote de l’Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) sous le numéro de prix niH P20GM103648 et des fonds de démarrage de l’Université de l’Oklahoma (à LIM). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des bailleurs de fonds. Les auteurs tiennent également à remercier les développeurs des outils utilisés dans ce protocole. Toutes les publications pertinentes ont été citées, le cas échéant.

Aucun conflit d’intérêts à signaler.

Comprendre les infections à trypanosomatides est essentiel pour guider le développement de nouveaux médicaments et les approches thérapeutiques. Cette méthode de cartographie chimique est particulièrement bien placée pour fournir des informations exploitables sur la relation entre le métabolisme et la pathogenèse de la maladie trypanosomatide, répondant ainsi à ce besoin translationnel.
Seuls les solvants de qualité LC-MS sont recommandés lors de l’extraction des métabolites et des analyses MS, afin de réduire la contamination de fond. La contamination polymère35, généralement dérivée d’un film de paraffine et/ou d’autres plastiques36,37,38, doit être évitée dans la mesure du possible. Le parafilm, en particulier, ne doit jamais être utilisé. Ces aspects sont cruciaux car la qualité des données LC-MS dépend des matériaux utilisés lors de la préparation des échantillons et de l’extraction des métabolites. La qualité des données doit être assurée avant de générer des diagrammes. De plus, la génération de ces cartes métabolomiques spatiales complètes nécessite la collecte de tous les échantillons de tissus adjacents et l’extraction de métabolites à partir de tous les échantillons prélevés afin d’éviter les lacunes dans ces cartes. Les procédures de collecte, la logistique de l’extraction des métabolites et l’analyse LC-MS, ainsi que les coûts doivent donc être pris en compte et planifiés en conséquence.
Ce protocole peut être modifié pour répondre aux besoins des utilisateurs de plusieurs façons. Par exemple, la polarité et la solubilité des solvants utilisés lors de l’extraction des métabolites influenceront les métabolites détectés39. Pour maximiser la diversité des caractéristiques des métabolites détectés pour les analyses cartographiques chimiques non ciblées, il est recommandé de combiner plusieurs étapes d’extraction et solvants. Par exemple, cette méthode utilise le dichlorométhane, le méthanol et l’eau comme solvants d’extraction, car ils permettent une détection précise des molécules non polaires et polaires20,40. Cependant, ces solvants ne conviennent pas universellement à toutes les expériences sur la SEP, et les chercheurs devraient sélectionner les solvants d’extraction en fonction des objectifs de leur projet. De même, différentes conditions LC-MS/MS peuvent être utilisées, telles que le remplacement de la chromatographie en phase inversée par la chromatographie en phase normale. Des colonnes alternatives peuvent également être utilisées pour la collecte de données en phase inversée au lieu de la chromatographie en C8, bien que empiriquement, la chromatographie en C8 soit plus robuste pour les lipides tissulaires et ait une fréquence de colmatage plus faible. Conceptuellement, ces protocoles peuvent également être appliqués à d’autres méthodes de spectrométrie de masse telles que la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse, etc.
Une autre approche est l’imagerie par spectrométrie de masse. En effet, contrairement aux approches d’imagerie par spectrométrie de masse, la chromatographie liquide-spectrométrie de masse ne préserve pas intrinsèquement l’information spatiale10. Les approches de cartographie chimique comblent cette lacune en incluant l’emplacement de l’échantillonnage au moment de la conceptualisation du projet, dans les métadonnées de l’échantillon et aux étapes de traitement des données. L’une des forces de cette approche de cartographie chimique, contrairement à l’imagerie par spectrométrie de masse, est la capacité de fournir des annotations fiables (confiance d’annotation de niveau 1 ou de niveau 2 de la Metabolomics Standards Initiative41), contrairement à l’imagerie par spectrométrie de masse où la majeure partie des applications reposent sur une masse précise uniquement pour l’annotation. L’imagerie par spectrométrie de masse permettra une cartographie spatiale à grain fin, parfois jusqu’au niveau d’une seule cellule, par exemple,42,43. En revanche, les approches de cartographie chimique permettent une cartographie inter-organes à grande échelle de la distribution des métabolites sans nécessiter de compétences hautement spécialisées en cryosection d’animaux entiers. La cartographie chimique fournit des preuves complémentaires aux nombreuses approches transcriptomiques spatiales en cours de développement, par exemple,44, avec l’avantage de se concentrer sur la « couche omique la plus proche du phénotype»45. D’autres méthodes de quantification de la charge parasitaire comprennent la mesure de la bioluminescence au moment du prélèvement de l’échantillon6. Des segments fins pourraient également être collectés pour permettre la microscopie confocale ou électronique afin d’évaluer la charge parasitaire localisée et les lésions tissulaires. L’homogénat d’eau, qui est utilisé pour la quantification des cytokines dans ce protocole et dans des publications antérieures13, pourrait également être utilisé pour quantifier les marqueurs à base de protéines des lésions tissulaires.
Il existe également plusieurs façons d’obtenir des modèles 3D adaptés pour tracer les données LC-MS résultantes. En plus de la méthode suggérée ici, les modèles peuvent être achetés pré-fabriqués auprès de divers fournisseurs en ligne. S’assurer que les conditions d’utilisation correspondent à l’utilisation prévue, en particulier en ce qui concerne la publication. Les modèles pour les grands organes peuvent être générés de novo à l’aide de scanners 3D selon les instructions du scanner. Des alternatives telles que MATLAB existent pour générer et visualiser des modèles 3D pour la cartographie chimique46, mais elles ont été principalement mises en œuvre avant le développement de 'ili16. MATLAB est une suite d’outils d’analyse et de programmation de données offrant une grande variété d’applications dans de nombreux domaines. Cependant, MATLAB n’est ni gratuit ni open-source, et il nécessite une familiarité avec les interfaces MATLAB, d’autant plus que MATLAB n’a pas été développé pour le traitement des données de spectrométrie de masse. Les alternatives de cette méthode proposée, à savoir SketchUp, Meshlab et 'ili, sont librement accessibles, conviviales et offrent des fonctions similaires à celles de MATLAB à des fins de cartographie chimique.
Cette méthode est robuste en ce qui concerne la préparation des échantillons et l’extraction des métabolites. Le dépannage est le plus souvent nécessaire à l’étape d’acquisition de données LC-MS. Cela dépasse le cadre de cet article. Les lecteurs sont dirigés vers d’excellentes publications sur le dépannage de l’acquisition de données LC-MS, y compris20,47. De même, les complexités de l’annotation des métabolites dépassent le cadre de l’accent mis par cette méthode sur la génération de modèles 3D. Les références utiles sur ce sujet incluent24,25,48,49.
Bien que cette méthode explore efficacement la pathogenèse de la maladie, il existe des limites à cette approche, dont certaines sont communes à toute expérience métabolomique. L’une de ces limitations est le faible taux d’annotation des fonctionnalités LC-MS50, qui dépend de la disponibilité et de la qualité des bibliothèques spectrales de référence. Une autre limitation est que ce protocole ne préserve pas l’ARNm en raison de l’incompatibilité des réactifs de préservation de l’ARN tels que l’ARNilatter avec l’analyse LC-MS/MS. Cependant, la qualité des protéines est adéquate pour les analyses en aval et peut donc remplacer les analyses à base d’ARNm.
Une approche cartographique chimique de la pathogenèse des infections reflète directement comment les infections bactériennes, virales ou parasitaires se développent dans les systèmes organiques et provoquent des maladies localisées. L’analyse de ces sous-échantillons régionaux et la génération de modèles 3D permettent en fin de compte de comprendre comment les métabolites fonctionnent dans l’espace tridimensionnel, mettant en lumière ces dimensions spatiales de la biologie moléculaire jusqu’alors méconnues. En utilisant ce protocole, par exemple, la localisation des métabolites a été comparée à la charge parasitaire de Trypanosoma cruzi. Les résultats ont clarifié la relation entre l’agent pathogène et le tissu hôte et ont également démontré la dynamique métabolique de la progression des symptômes de la maladie de Chagas6. Les méthodes de cartographie chimique ont également été appliquées à divers sujets, tels que l’interaction homme-environnement construit51,52,53, la composition chimique des systèmes organiques comme la peau humaine46 et les poumons54, et le métabolisme des plantes et les interactions environnementales55. Les applications futures peuvent impliquer l’évaluation de la tolérance et de la résilience localisées aux maladies, ou la relation entre les niveaux locaux de métabolites, le tropisme pathogène et le tropisme de la maladie dans des modèles au-delà de l’infection trypanosomatidée. Cette approche devrait également avoir une large applicabilité pour élargir les protocoles pharmacocinétiques actuels, pour évaluer la relation entre les niveaux locaux de médicaments tissulaires et le métabolisme des médicaments par rapport au contexte métabolique global, aux lésions tissulaires et à la clairance des agents pathogènes. Dans l’ensemble, la cartographie chimique permet d’explorer de manière unique les distributions de métabolites dans divers types d’échantillons, avec des applications telles que la pathogenèse des maladies, la santé humaine, les interactions homme-environnement et la dynamique microbienne.

Les parasites trypanosomatidés sont constitués d’espèces de Leishmania, de trypanosomes africains (Trypanosoma brucei) et de trypanosomes américains (Trypanosoma cruzi). Les protozoaires leishmaniaques provoquent la leishmaniose, qui comprend l’auto-guérison et la leishmaniose cutanée localisée auto-limitée, la leishmaniose muco-cutanée dans laquelle les tissus muqueux de la bouche, du nez et de la gorge sont endommagés, et la leishmaniose viscérale avec tropisme parasitaire aux organes viscéraux provoquant de la fièvre et de l’hépatosplénomégalie1,2. T. brucei est à l’origine de la trypanosomiase humaine africaine (THA), également connue sous le nom de maladie du sommeil, principalement signalée dans les pays africains3. Les signes et symptômes cliniques comprennent l’hépatosplénomégalie, la fièvre, les maux de tête, les douleurs musculo-squelettiques, les lymphadénopathies et l’anémie au stade hémo-lymphatique lorsque les parasites se localisent dans la circulation sanguine et lymphatique. Ceci est suivi par le stade méningo-encéphalitique, où les parasites se localisent dans le système nerveux central et provoquent des troubles du sommeil, une altération du comportement et éventuellement un comas mortel4. T. cruzi provoque la maladie de Chagas, endémique dans les Amériques. Les personnes infectées connaissent un stade aigu initial, généralement asymptomatique, avec un tropisme parasitaire large. Environ 10 % à 30 % des personnes infectées présentent des symptômes au stade chronique après des décennies d’infection, caractérisés par un mégaœsophage, un mégacôlon et des complications cardiovasculaires5,6.
La métabolomique étudie les petites espèces moléculaires (50-1 500 Da), y compris les composés biologiques issus du métabolisme primaire ou secondaire et les composés dérivés de l’extérieur tels que les médicaments ou les molécules dérivées des aliments. Dans le contexte des interactions hôte-pathogène, la métabolomique peut explorer l’impact de l’infection sur les environnements de métabolites de l’hôte, ce qui est crucial pour accéder à l’effet de l’agent pathogène sur l’hôte. Il peut également évaluer les adaptations des agents pathogènes à l’environnement nutritionnel et immunologique de l’hôte7,8,9. La spectrométrie de masse (SEP) et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) sont des outils métabolomiques courants utilisés pour identifier, quantifier et caractériser les métabolites. Cette approche « omique » peut également être appliquée à la découverte de biomarqueurs et au développement de médicaments10,11.
Compte tenu du tropisme tissulaire spécifique des parasites trypanosomatidés, les analyses métabolomiques spatiales peuvent permettre de mieux comprendre la pathogenèse des maladies qu’ils provoquent. La cartographie de la distribution spatiale des métabolites a révélé des métabolites localement affectés par une infection chronique à Trypanosoma cruzi dans le tissu cardiaque de la souris et une infection aiguë et à long terme à Trypanosoma cruzi dans le tractus gastro-intestinal de la souris6,12,13. Plus précisément, la cartographie chimique 3D a démontré une déconnexion entre la persistance du parasite et les altérations métaboliques dans le tissu cardiaque de souris chroniquement infectées par Trypanosoma cruzi. Le métabolisme était le plus perturbé dans les segments inférieurs et apicals du cœur, correspondant aux sites de symptômes de la maladie de Chagas (anévrismes apicals cardiaques). Les familles de métabolites perturbées par l’infection à des sites cardiaques spécifiques et corrélées à la gravité de la maladie comprennent les acylcarnitines et la glycérophosphocholines12,13,14. Dans le tractus gastro-intestinal, des altérations métaboliques persistantes concordaient avec les sites de symptômes de la maladie de Chagas: œsophage et côlon. En revanche, le métabolisme est renormalisé à des sites non associés aux symptômes de la maladie de Chagas, tels que l’intestin grêle. Les métabolites localement perturbés par une infection dans le tractus gastro-intestinal comprennent les acylcarnitines, la glycérophosphocholines, la kynurénine, le tryptophane et l’acide cholique. De plus, ces analyses ont permis d’identifier un nouveau mécanisme métabolique de tolérance à la maladie de Chagas6. L’application de ces méthodes à l’étude de la leishmaniose cutanée a révélé des perturbations métaboliques importantes sur le site de la lésion, mais aussi des changements métaboliques spécifiques dans les tissus sains macroscopiquement adjacents à la lésion. Par exemple, la glutamine a été épuisée au site de la lésion, tandis que la glycérophosphocholines dans le m/z (rapport masse/charge) 200-299, 400-499, 500-599 et 600-699 a été significativement augmentée au site de la lésion. La PC (O-34:1) n’a été augmentée qu’aux sites adjacents aux lésions15.
L’objectif de ce manuscrit est de démontrer les étapes nécessaires pour générer des modèles 3D de distribution des métabolites (« cartographie chimique ») appliqués aux modèles d’infection parasitaire trypanosomatide (Figure 1). Cette approche s’appuie sur plusieurs avancées critiques dans le contexte du traitement des données métabolomiques et métabolomiques, en particulier le développement d’un logiciel 'ili pour tracer facilement les données métabolomiques sur des modèles 3D16.

<table><tbody><tr><td>Tubes Eppendorf de 1,5 mL</td><td>NA NA</td><td></td><td>de toute marque, tel que disponible</td></tr><tr><td>Flacon de 1 L, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>de toute marque, tel que disponible</td></tr><tr><td>Cylindre gradué de 1 L, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>de toute marque, tel que disponible</td></tr><tr><td>Tubes SafeLock Eppendorf de 2 mL</td><td>VWR</td><td>20901-540</td><td>utiliser le modèle de tube approprié pour l’homogénéisateur</td></tr> <tr><td>de tissu disponibleModèle 3D (généré de novo selon les étapes du protocole, ou acheté)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>selon le système à l’étude</td></tr><tr><td>Cordon en acier inoxydable de 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>96 plaque de puits</td><td>Fisher</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>toute marque, selon la disponibilité ; publié dans Piron, M. et al. Développement d’un test PCR en temps réel pour la détection de Trypanosoma cruzi dans des échantillons de sang. Acta tropica. 103 (3), 195 et 195 ; 200 (2007).</td></tr><tr><td>balance analytique</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, telle que disponible</td></tr><tr><td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, selon la disponibilité ; publié dans Piron, M. et al. Développement d’un test PCR en temps réel pour la détection de Trypanosoma cruzi dans des échantillons de sang. Acta tropica. 103 (3), 195 et 195 ; 200 (2007).</td></tr><tr><td>centrifugeuse de paillasse avec microcentrifugeuse, tube de faucon et plaque à 96 puits</td><td>NA</td><td></td><td>NA toute marque, selon la disponibilité</td></tr><tr><td>armoire de biosécurité</td><td>NA</td><td>NA</td><td>classe II, type A2 ; n’importe quelle marque, selon la disponibilité</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer</td><td>NA</td><td>NA toute</td><td>marque, selon la disponibilité ; publié dans Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Quantification rapide de Trypanosoma cruzi dans le tissu hôte par PCR en temps réel. Parasitologie moléculaire et biochimique. 129 (1), 53 et 53 ; 59 (2003).</td></tr><tr><td>appareil photo</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, selon la disponibilité. L’appareil photo d’un téléphone portable est suffisant pour ce protocole</td></tr><tr><td>Système d’imagerie capable de chimiluminescence</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quel système, comme disponible</td></tr><tr><td>boules de coton</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, comme disponible</td></tr><tr><td>cryogants</td><td>VWR</td><td>97008-208</td><td>remplacer par n’importe quelle marque, comme disponible</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, comme disponible</td></tr><tr><td>glace sèche</td><td>NA</td><td>NA</td><td>toute marque, selon les disponibilités</td></tr><tr><td>Pinces extra-longues</td><td>NA</td><td>NA</td><td>toutes marques, selon les</td></tr><tr><td>disponibilités Réfrigérateur inflammable</td><td>NA</td><td>NA</td><td>toutes les marques, selon les disponibilités</td></tr><tr><td>Boîtes de congélation pour tubes à microcentrifuger</td><td>NA</td><td>NA</td><td>toutes les marques, les plus disponibles</td></tr><tr><td>Hotte</td><td>NA</td><td>NA</td><td>toutes les marques, selon les disponibilités</td></tr><tr><td>Masse haute résolution spectromètre</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, selon la disponibilité, tel que ThermoFisher Q-Exactive Plus (numéro de catalogue 0726030)</td></tr><tr><td>seau à glace</td><td>NA</td><td>NA n’importe</td><td>quelle marque, selon la disponibilité</td></tr><tr><td>logiciel ili</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>grand tupperware</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, selon la disponibilité ; assez grand pour contenir confortablement souris, boule de coton</td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Dichololométhane de qualité LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique de qualité LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol de qualité LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>La colonne de chromatographie liquide</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>peut être remplacée par d’autres marques et modèles, selon les métabolites d’intérêt, en fonction des métabolites d’intérêt</td></tr>. La <tr><td>cartouche de protection de la colonne de chromatographie</td> liquide <td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>peut être remplacée par d’autres marques et modèles, selon les caractéristiques des métabolites d’intérêt.</td></tr><tr><td>Porte-cartouche de protection de la colonne de chromatographie</td><td>liquide Phenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>peut être remplacé par d’autres marques et modèles selon les métabolites d’intérêt</td></tr><tr><td>azote liquide</td><td>NA</td><td>NA n’importe</td><td>quelle marque, selon la disponibilité</td></tr><tr><td>luciférine</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel MeshLab</td><td>https://www.meshlab.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Meshmixer</td><td>https://www.meshmixer.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MS calibratent</td><td>NA</td><td>NA</td><td>adapté à l’instrument disponible</td></tr><tr><td>Logiciel de traitement de données MS</td><td>S.A.</td><td>S.A</td>. <td>Plusieurs options sont disponibles ; les auteurs recommandent le logiciel MZmine</td></tr><tr><td>MSConvert</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>d’autres modèles nanodrop conviennent également pointes</td></tr><tr><td>de pipette p1000</td><td>NA</td><td></td> <td>NAutiliser la marque appropriée pour s’adapter aux pipettes</td></tr><tr><td>P1000</td> disponibles <td>pipette NA</td><td>NA n’importe</td><td>quelle marque, comme disponible</td></tr><tr><td>pointes de pipette P20</td><td>NA</td><td>NA utiliser</td><td>la marque appropriée pour s’adapter aux pipettes p20 disponibles</td></tr><tr><td>pipette</td><td>NA</td><td>NA n’importe</td><td>quelle marque, comme disponible</td></tr><tr><td>pointes de pipette p200</td><td>NA</td><td>NA utiliser</td><td>la marque appropriée pour s’adapter aux pipettes</td></tr><tr><td>p200 disponibles pipettor</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, selon la disponibilité</td></tr><tr><td>de l’équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire, lunettes de sécurité/lunettes de protection, écran facial)</td><td>NA</td><td>NA n’importe</td><td>quelle marque, selon la disponibilité</td></tr><tr><td>Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td><td>peut être remplacé par d’autres dosages de cytokines à base de protéines, tels que d’autres kits ELISA de cytokines</td></tr><tr><td>commerciaux Kit Quick-DNA Miniprep Plus (200 préparations)</td><td>Zymo</td><td>D4069</td><td>remplace par n’importe quelle marque de kit d’extraction d’ADN de mammifère, selon les disponibilités</td></tr><tr><td>Thermocycleur en temps réel</td><td>NA</td><td>NA n’importe</td><td>quelle marque, selon les disponibilités</td></tr><tr><td>salière ou infuseur à thé</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque ; pour contenir une boule de coton imbibée d’isoflurane et empêcher tout contact avec la peau de souris</td></tr><tr><td>Logiciel SketchUp</td><td>https://www.sketchup.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>spécimen pinces</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, selon les disponibilités</td></tr><tr><td>Speedvac avec tube de microcentrifugation et plaque à 96 puits</td><td>NA</td><td></td><td>NA n’importe quelle marque, comme</td></tr><tr><td>disponible Tableur</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td>NA</td><td>peut remplacer par d’autres logiciels de gestion de tableur, le cas échéant</td></tr><tr><td>sulfachloropyridazine</td><td>Sigma</td><td>S9882-100G</td><td></td></tr><tr><td>sulfadimethoxine</td><td>Sigma</td><td>S7007-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sybr green qPCR reaction mix</td><td>Fisher</td><td>A25780</td><td>peut remplacer par d’autres mélanges réactionnels Sybr green qPCR, si désiré</td></tr><tr><td>TCCCTCTCATCATCAGTTCTAT GGCCCA primer</td><td>NA</td><td>NA n’importe</td><td>quelle marque, selon la disponibilité ; publié dans Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Quantification rapide de Trypanosoma cruzi dans le tissu hôte par PCR en temps réel. Parasitologie moléculaire et biochimique. 129 (1), 53 et 53 ; 59 (2003).</td></tr><tr><td>homogénéisateur de tissus</td><td>NA NA</td><td>n’importe quelle marque, selon les disponibilités ; par exemple, Qiagen TissueLyser II, numéro de catalogue 85300, avec kit d’adaptateurs TissueLyser (2 x 24), numéro de catalogue 69982</td><td></td></tr><tr><td>échantillons de tissus</td><td>NA</td><td>NA à</td><td>partir du modèle d’infection approprié</td></tr><tr><td>TissueLyser distributeur de billes Qiagen</td><td></td><td>69965</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, selon la disponibilité, telle que ThermoFisher Vanquish (numéro de catalogue IQLAAAGABHFAPUMBHV)</td></tr><tr><td>congélateur ultra-basse température (-80)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>toute marque, selon la disponibilité</td></tr><tr><td>bain à ultrasons</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quel système, comme disponible</td></tr><tr><td>glace humide</td><td>NA</td><td>NA</td><td>n’importe quelle marque, comme disponible</td></tr><tr><td>film d’étanchéité sans zone</td><td>VWR</td><td>&nbsp ; Référence 490007-390</td><td></td></tr></tbody></table>

approches de cartographie chimique pour étudier l’infection à trypanosomatidé

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Le tropisme des agents pathogènes et le tropisme des maladies désignent les emplacements tissulaires colonisés de manière sélective ou endommagés par des agents pathogènes, ce qui entraîne des symptômes localisés de la maladie. Les parasites trypanosomatidés infectieux par l’homme comprennent Trypanosoma cruzi, l’agent causal de la maladie de Chagas; Trypanosoma brucei, l’agent causal de la maladie du sommeil; et les espèces de Leishmania , agents responsables de la leishmaniose. Ensemble, ils touchent 20 millions de personnes à travers le monde. Ces parasites montrent un tropisme spécifique: cœur, œsophage, côlon pour T. cruzi, tissu adipeux, pancréas, peau, système circulatoire et système nerveux central pour T. brucei, peau pour les souches de Leishmania dermropiques et foie, rate et moelle osseuse pour les souches viscérotropes de Leishmania . Une perspective spatiale est donc essentielle pour comprendre la pathogenèse de la maladie trypanosomatide. La cartographie chimique génère des visualisations 3D de l’abondance de petites molécules générées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse, par rapport aux paramètres microbiologiques et immunologiques. Ce protocole montre comment la cartographie chimique peut être appliquée pour étudier les processus pathogènes au cours de l’infection par trypanosomatide, en commençant par l’échantillonnage systématique des tissus et l’extraction des métabolites, suivis de l’acquisition de données par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem, et se terminant par la génération de cartes 3D de la distribution des métabolites. Cette méthode peut être utilisée pour de multiples questions de recherche, telles que les besoins en nutriments pour la colonisation tissulaire par T. cruzi, T. brucei ou Leishmania, l’immunométabolisme aux sites d’infection et la relation entre la perturbation métabolique tissulaire locale et les symptômes cliniques de la maladie, conduisant à un aperçu complet de la pathogenèse de la maladie trypanosomatide.

Le nombre de caractéristiques métabolites obtenues dépend du type de tissu analysé et des paramètres de traitement des données. Par exemple, ce protocole a été utilisé pour analyser l’impact spatial de l’infection à T. cruzi sur le métabolome du tractus gastro-intestinal dans un modèle murin d’infection à T. cruzi. Dans des travaux antérieurs, des C3H/HeJ mâles ont été injectés par voie intrapéritonéale avec 1 000 parasites CL + luc T. cruzi32,6. Les animaux ont été euthanasiés 12 ou 89 jours après l’infection, et une analyse cartographique chimique de 13 segments contigus du tractus gastro-intestinal a été effectuée comme décrit dans ce protocole. Cette analyse a conduit à un tableau de 5 502 entités, qui ont ensuite été visualisées en 3D à l’aide des étapes décrites dans ce protocole. Cette approche permet de visualiser les caractéristiques des métabolites chez les animaux individuels qui sont élevés sur le site d’une charge parasitaire élevée (kynurénine, Figure 2B vs charge parasitaire, Figure 2A), de métabolites ayant une distribution différentielle entre les régions tissulaires (glutamine, Figure 2C) et de caractéristiques métabolites qui se trouvent à des niveaux comparables dans le petit et le gros intestin (LPE 16:0 Figure 2D ). La kynurénine a été sélectionnée pour la visualisation en raison de sa relation connue avec l’inflammation et des publications antérieures sur la capacité des métabolites dérivés de la kynurénine à réguler la charge de T. cruzi33. Des modèles aléatoires d’apprentissage automatique basés sur la forêt avaient précédemment révélé une association entre les niveaux de kynurénine et le statut d’infection6. La glutamine a été sélectionnée pour une visualisation basée sur des publications antérieures démontrant une relation entre la disponibilité de la glutamine in vitro et la sensibilité au médicament T. cruzi34. La distribution différentielle a été confirmée par régression logistique, p &lt; 0,05. LPE 16:0 a été sélectionné après inspection visuelle des données pour découvrir les caractéristiques des métabolites trouvés à des niveaux comparables sur les sites tissulaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole. L’illustration a été créée avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg"> Figure 2 : Analyse cartographique chimique. Des souris mâles C3H/HeJ ont été injectées par voie intrapéritonéale avec 1 000 parasites CL+luc T. cruzi32. Les animaux ont été euthanasiés 12 ou 89 jours après l’infection, et le tractus gastro-intestinal a été prélevé et sectionné systématiquement (étape 1)6. Les métabolites ont été extraits comme à l’étape 2 et analysés par LC-MS/MS.3D génération du modèle a été effectuée à l’aide du logiciel SketchUp (étape 5), et les données ont été tracées en 3D comme à l’étape 6. (A) Distribution du parasite chez une souris spécifique, 12 jours après l’infection. (B) Distribution du métabolite de la kynurénine chez la même souris, 12 jours après l’infection. (C) Distribution moyenne de la glutamine chez les souris infectées, 89 jours après l’infection. (D) Niveaux comparables de temps de rétention m/z 454,292 2,929 min, annotés en 2-hexadécanoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine (LPE 16:0), chez la même souris que chez A et B dans l’intestin grêle et le côlon. Des échantillons et des données ont été générés en6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit les étapes pour générer un modèle 3D de la distribution des métabolites pendant l’infection par trypanosomatide, y compris la collecte d’échantillons, l’extraction de métabolites, un aperçu de l’acquisition de données de chromatographie de masse en tandem et de chromatographie liquide, la génération de modèles 3D et, enfin, la visualisation de données.

Approches de cartographie chimique pour étudier l’infection à trypanosomatidé

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Ce protocole peut être utilisé pour construire des modèles 3D de distribution des métabolites et des parasites. Cela peut aider à comprendre la relation entre la perturbation métabolique des tissus locaux, la distribution des parasites et les symptômes cliniques de la maladie. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet une cartographie inter-organes à l’échelle réelle de la distribution des métabolites par rapport à la distribution des agents pathogènes et son analyse statistique.Théoriquement, la cartographie chimique peut explorer le développement et l’impact de la maladie sur l’hôte en examinant directement les métabolites responsables de la pathogenèse et les effets du traitement. Commencez par peser et étiqueter les tubes. Coupez systématiquement les tissus avec une section par tube.Peser les tubes contenant des échantillons de tissus pour déterminer le poids de l’échantillon et enregistrer le poids. Pour effectuer l’homogénéisation à base d’eau des échantillons de tissus, ajoutez une bille d’acier inoxydable de cinq millimètres aux deux tubes de microcentrifugation millilitres contenant des échantillons de tissus. Faites un tube vierge contenant de l’eau de qualité LCMS.Augmenter le volume à 500 microlitres par 50 milligrammes d’échantillon en ajoutant de l’eau réfrigérée de qualité LCMS, puis homogénéiser les échantillons à 25 hertz pendant trois minutes. Les échantillons doivent être soigneusement homogénéisés. Collecter 1/10ème du volume d’homogénéisation pour l’extraction de l’ADN et d’autres analyses.Ajouter au méthanol glacé de qualité LCMS enrichi de quatre micromolaires de sulfachloropyridazine à l’homogénat. Homogénéiser les échantillons dans un homogénéisateur tissulaire à 25 hertz pendant trois minutes, suivi d’une centrifugation pendant 10 minutes. Recueillir un volume égal de surnageant dans une plaque de 96 puits et garder les résidus solides sur la glace tout en recueillant les surnageants.Sécher complètement le surnageant d’extraction aqueux en utilisant une vitesse maximale et sans chauffage. Effectuer une extraction organique en ajoutant 1 000 microlitres de méthanol dichlorométhane prérefroidisé enrichi de deux sulfachloropyridazine micromolaires par 50 milligrammes d’échantillon de résidus solides. Homogénéiser les échantillons à 25 hertz pendant cinq minutes, suivis d’une centrifugation pendant 10 minutes.Collectez un volume égal de surnageant dans une plaque de 96 puits. Prenez une photo de l’organe d’intérêt. Cliquez sur Fichier, puis sur Importer dans le logiciel SketchUp pour importer une image des organes d’intérêt.Cliquez sur l’outil Lignes et sélectionnez l’option à main levée. Utilisez l’outil crayon pour tracer et dessiner les contours des organes d’intérêt. Sélectionnez l’outil push/pull et tirez vers le haut sur la zone ombrée pour convertir le dessin de 2D en 3D.Exportez le fichier au format dae en cliquant sur Exporter le fichier, puis sur modèle 3D. Pour améliorer le réalisme du modèle, importez le modèle dans le logiciel MeshLab en sélectionnant Fichier, puis en cliquant sur Importer le maillage. Sélectionnez Wireframe dans le menu supérieur, puis sélectionnez Filtres, cliquez sur Remeshing Simplification and Reconstruction, puis sur Subdivision Surfaces Midpoint.Laissez toutes les valeurs par défaut et sélectionnez Appliquer deux fois. Exportez le modèle au format sdl en cliquant sur Fichier, puis sur Exporter le maillage sous, puis en sélectionnant Format de fichier SDL dans le menu déroulant Type de fichiers. Enregistrez-le et sélectionnez OK dans le menu contextuel suivant.Ouvrez le logiciel Meshmixer et importez le fichier sdl généré à l’étape précédente. Utilisez la sculpture, les pinceaux, la sculpture du dragon, les pinceaux, les outils de gonflage pour extraire les surfaces du modèle qui doivent être arrondies. Enregistrez-le au format sdl une fois que le modèle a l’apparence souhaitée en cliquant sur Fichier et exporter.Nommez le fichier comme vous le souhaitez, sélectionnez le format binaire SDL et enregistrez-le. Ouvrez le modèle 3D dans le logiciel MeshLab. Cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle de traitement post-ouverture.Obtenez les coordonnées X, Y et Z pour chaque point d’échantillonnage en sélectionnant l’outil Points de prélèvement, puis cliquez avec le bouton droit de la souris à intervalles réguliers sur la surface du modèle 3D. Une fois que toutes les coordonnées souhaitées ont été sélectionnées, cliquez sur le bouton Enregistrer le plus haut dans la fenêtre contextuelle du formulaire. Dans un tableur, ouvrez le fichier pp généré à l’étape précédente.Ajustez l’affichage des données en cliquant sur Texte des données en colonnes, puis sur Délimité. Cliquez sur Suivant, puis sélectionnez Espace et cliquez sur Terminer. Reformatez de sorte que seules les valeurs numériques restent dans les cellules de la feuille de calcul en sélectionnant Rechercher dans l’accueil et Sélectionner Remplacer.Dans la zone Trouver quoi, entrez Y égale et laissez la case de remplacement vide. Cliquez sur Remplacer tout, puis sur OK. Répétez l’opération pour X couche égale et pour Z couche égale et pour la barre oblique supérieure à. Dans le tableau du table du tableur, les lignes correspondent à chaque position et les colonnes aux données.Collez les métadonnées appropriées et l’abondance des caractéristiques métabolites dans les colonnes de feuille de calcul suivantes. Dans la colonne rayon, entrez la taille souhaitée des points d’échantillonnage à visualiser sur le modèle. Déterminez empiriquement les valeurs du rayon et enregistrez le fichier au format CSV.Accédez au logiciel ELI Plot, sélectionnez Surface, puis faites glisser et déposez le modèle 3D créé dans la fenêtre du navigateur. Faites glisser et déposez la table des fonctionnalités créée dans la même fenêtre de navigateur. Utilisez la légende dans le coin inférieur droit pour projeter la colonne de données souhaitée sur le modèle 3D.Sélectionnez consécutivement chaque colonne de données pour évaluer la distribution de cette caractéristique métabolite sur le modèle 3D. Cette analyse a conduit à un tableau de 5 502 entités et à leur visualisation en 3D. Cette approche permet de visualiser les caractéristiques des métabolites chez les animaux individuels qui sont élevés sur le site d’une charge parasitaire élevée, les métabolites à distribution différentielle entre les régions tissulaires et les caractéristiques des métabolites qui se trouvent à des niveaux comparables dans le petit et le gros intestin.Il est important de ne pas oublier de n’utiliser que des solvants LCMS et de prélever tous les tissus adjacents et d’extraire les métabolites pour tous les échantillons prélevés afin d’éviter les lacunes dans les cartes spatiales. Cette technique peut être utilisée pour explorer les besoins en nutriments pour la colonisation tissulaire par les parasites trypanosomatidés afin de comprendre la pathogenèse de la maladie en comparant les cartes de distribution des métabolites 3D lors de l’infection.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce manuscrit décrit l’utilisation d’une souche bioluminescente de trypanosomes africains pour permettre le suivi de l’infection à un stade avancé et démontre comment l’imagerie en direct in vivo peut être utilisée pour visualiser les infections au sein du système nerveux central en temps réel.

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

Les trypanosomes africains cultivés in vitro subissent une variation antigénique à un faible taux, de sorte que les populations sont constituées de parasites exprimant un variant dominant de type glycoprotéine de surface (VSG) et d’une petite population de variants « commutés ».  Ce protocole décrit une méthode rapide de détection et de quantification de ces populations.

détection de la<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Dans ce protocole, fluorescent étiquetés T. cruzi ont été injectées dans des larves de poisson zèbre transparent, et la motilité de parasite a été observée in vivo à l’aide de la microscopie de fluorescence nappe de lumière.

Mise en place du poisson-zèbre larvaire comme modèle Animal pour enquêter sur Trypanosoma cruzi motilité In Vivo

L’agent de la maladie de Chagas de Trypanosoma cruzi produit durable des infections asymptomatiques qui brusquement se développent en pathologie cliniquement reconnue. Le protocole de recherche suivant décrit une étude épidémiologique axée sur la famille de court terme pour démêler l’infection de T. cruzi transmise sexuellement des parents aux descendants.

Transmission sexuelle du trypanosome américaine des mâles et des femelles à des camarades de Naive

Cette méthode de séparation des trypanosomes dans le sang dépend de leur charge de surface étant moins négatif que les cellules de sang de mammifères. Sang contaminé est placé et traité sur une colonne d’échangeur d’anions. Cette méthode, plus raccord diagnostique pour la trypanosomiase africaine, fournit parasites purifiées à des investigations immunologiques, biologiques, biochimiques, pharmaceutiques et de la biologie moléculaire.

Purification des Trypanosomes extracellulaires, y compris les pays d’Afrique, du sang par échangeurs d’anions (colonnes diéthylaminoéthyl-cellulose)

Le présent protocole décrit la microscopie fluorescente à feuille de lumière et les méthodes automatisées assistées par logiciel pour visualiser et quantifier avec précision la prolifération et la dormance des parasites Trypanosoma cruzi et des lymphocytes T dans des organes et des tissus intacts et nettoyés. Ces techniques fournissent un moyen fiable d’évaluer les résultats du traitement et offrent de nouvelles perspectives sur les interactions parasite-hôte.

Imagerie 3D quantitative de cellules infectées par Trypanosoma cruzi, d’amastigotes dormants et de cellules T dans des organes clarifiés intacts

Cette étude montre un protocole détaillé pour effectuer la microscopie à expansion d’ultrastructure dans trois stades du cycle de vie in vitro de Trypanosoma cruzi, l’agent pathogène responsable de la maladie de Chagas. Nous incluons la technique optimisée pour les protéines cytosquelettiques et le marquage pan-protéome.

Microscopie à expansion ultrastructurale en trois étapes du cycle de vie in vitro de Trypanosoma cruzi

Les parasites sanguins médicaux du monde entier ont été automatiquement dépistés à l’aide d’étapes simples sur une plateforme d’IA low-code. Le diagnostic prospectif des films sanguins a été amélioré par l’utilisation d’une méthode de détection et de classification d’objets dans un modèle hybride d’apprentissage profond. La collaboration d’une surveillance active et de modèles bien entraînés permet d’identifier les points chauds de transmission des trypanosomes.

Auto-identification supérieure des parasites trypanosomes à l’aide d’un modèle hybride d’apprentissage profond

Nous décrivons une méthode pour étudier comment le pH répond aux signaux environnementaux dans les glycosomes de la forme sanguine des trypanosomes africains. Cette approche implique une sonde de protéine héréditaire sensible au pH en combinaison avec la cytométrie en flux pour mesurer la dynamique du pH, à la fois en tant que test temporel et dans un format de criblage à haut débit.

Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant

Le protocole fourni ici décrit en détail les étapes détaillées de la réalisation d’études d’efficacité médicamenteuse dans un modèle bioluminescent d’infection à Trypanosoma cruzi , en mettant l’accent sur l’acquisition, l’analyse et l’interprétation des données. Des procédures de dépannage et de contrôle de la qualité visant à minimiser les problèmes techniques sont également fournies.

Démystifier l’imagerie par bioluminescence in vivo d’un modèle murin de la maladie de Chagas pour des études d’efficacité de médicaments

Découvrez la cartographie chimique pour modéliser la distribution des métabolites et parasites trypanosomatidés en 3D. Cette méthode permet d'analyser les perturbations métaboliques tissulaires et leurs liens avec la pathogenèse.

Approches de cartographie chimique pour étudier l’infection à trypanosomatidé

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