Quantification de la distribution subcellulaire du glycogène dans les fibres musculaires squelettiques à l’aide de la microscopie électronique à transmission

La mesure de la teneur en glycogène dans les cellules individuelles et les organisations subcellulaires est importante car dans la plupart des types de cellules, les cellules individuelles s’adaptent différemment aux conditions physiologiques changeantes et aux maladies. Ainsi, le principal avantage de cette technique est la très haute résolution dans le microscope électronique à transmission. Cela améliore la possibilité d’avoir des structures subcellulaires localisées et aussi dans ce contenu dans cette technique ici, il est important que la coloration au glycogène soit sans anticorps.

Nous n’avons donc aucune spécificité à craindre. Afin d’obtenir un meilleur contraste sur le glycogène, il suffit d’utiliser du ferrocyanure de potassium 1,5% au lieu du ferrocyanure de potassium. Préparer 1,6 millilitre de la solution fixative primaire en ajoutant 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire dans un tube de microcentrification de deux millilitres.

Conservez-le à cinq degrés Celsius pendant un maximum de 14 jours. Isolez un petit échantillon de la biopsie musculaire ou d’un muscle entier qui a un diamètre maximal d’un millimètre dans n’importe quelle direction et qui est plus long longitudinalement que transversalement. Placer l’échantillon dans le tube contenant la solution de fixation primaire froide.

Conservez-le à cinq degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, lavez l’échantillon quatre fois dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire. À l’aide de pipettes de transfert, retirez le tampon utilisé du tube en laissant l’échantillon intact et ajoutez le tampon frais.

Post-fixer l’échantillon avec 1% de tétroxyde d’osmium et 1,5% de ferrocyanure de potassium dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire pendant 120 minutes à quatre degrés Celsius. Rincer l’échantillon deux fois dans de l’eau distillée double à température ambiante. Déshydrater en s’immergeant dans une série graduée d’éthanol à température ambiante.

Infiltrer l’échantillon avec de l’oxyde de propylène et des mélanges classés en résine epossique à température ambiante en utilisant les rapports de volume mentionnés. Le lendemain, incorporez des échantillons dans de la résine épsidique 100% fraîche dans des moules et polymérez à 60 degrés Celsius pendant 48 heures. Montez le bloc d’un spécimen sur le support ultramicrotome.

Coupez le bloc à la surface avec une lame de rasoir pour atteindre le niveau des tissus. Montez un couteau à diamant devant l’échantillon et alignez la surface de l’échantillon parallèlement au couteau. Produire une section semi-mince d’un micromètre d’épaisseur avec le couteau à diamant pour vérifier l’orientation de l’échantillon.

Tacher la section semi-mince avec du bleu de toluidine pour l’observation en microscopie optique. Ensuite, coupez le bloc plus loin pour réduire la zone d’intérêt afin d’obtenir des sections ultraminces appropriées. Découpez des sections ultraminces de 60 à 70 nanomètres d’épaisseur avec un deuxième couteau en diamant.

Collectez une à deux sections sur une grille de cuivre entière à l’aide d’une boucle parfaite. Pour contraster les sections, immergez les grilles dans une solution d’acétate d’uranyle pendant 20 minutes et lavez les grilles dans de l’eau distillée double, puis immergez les grilles dans du citrate de plomb pendant 15 minutes et lavez à nouveau les grilles dans de l’eau distillée double. Allumez l’ordinateur de microscope électronique à transmission et le logiciel d’enregistrement d’images, enregistrez des images numériques avec une caméra CCD numérique à balayage lent et le logiciel d’imagerie associé.

Après avoir inséré la grille avec plusieurs sections dans l’étage du microscope, filtrez d’abord la grille à faible grossissement pour choisir les sections de la meilleure qualité et déterminer la direction des fibres musculaires. Ensuite, faites la mise au point, l’image à un grossissement supérieur à 30 000 avec le faisceau centré sur une fibre périphérique dans la section et enregistrez les images avec un temps d’exposition d’une seconde au grossissement souhaité. Assurez-vous que les images sont réparties sur la longueur et la largeur de la fibre dans un ordre systématique aléatoire pour obtenir des résultats impartiaux et répétez l’imagerie jusqu’à ce que six à 10 fibres soient imagées.

Importez des images dans l’image J en cliquant sur fichier suivi de l’ouverture. Définissez l’échelle globale pour qu’elle corresponde à la taille d’origine de l’image en cliquant sur Analyser, puis définissez l’échelle. Pour zoomer à 100%, cliquez sur l’image, allez sur zoom et cliquez sur dans.

Mesurez l’épaisseur d’un disque Z par image de l’espace myofibrillaire à l’aide de l’outil Ligne droite du menu Outils et calculez l’épaisseur moyenne du disque Z de chacune des six à 10 fibres. Utilisez l’outil de ligne segmentée pour mesurer la longueur de la myofibrille la plus externe visible juste en dessous de la région sous-sarmate. Pour insérer une grille, cliquez sur analyser, sélectionnez outils, puis sélectionnez grille.

Maintenant, définissez la surface par point à 32 400 nanomètres carrés. Comptez le nombre de hits dans la longueur disponible dans les 12 images sous-sarmateuses où un croisement frappe le glycogène sous-sarmol. Insérez une grille en cliquant sur analyser, puis sélectionnez les outils, puis la grille et définissez la surface par point à 160 000 nanomètres carrés.

Comptez le nombre de coups dans les 12e images myofibrillaires où une croix frappe l’espace intramyofibrillaire. Là encore, pour insérer une grille, cliquez sur analyser, sélectionnez outils, puis sélectionnez grille. Maintenant, définissez la surface par point à 3 600 nanomètres carrés.

Comptez le nombre de hits dans les 12èmes images myofibrillaires où un croisement frappe le glycogène intramyofibrillaire. Insérez une grille en cliquant sur analyser, puis sélectionnez des outils, puis grillez et définissez la surface par point à 32 400 nanomètres carrés. Comptez le nombre de hits dans les 12èmes images myofibrillaires où un croisement frappe le glycogène intermyofibrillaire.

En utilisant la grille de 32 400 nanomètres carrés pour choisir au hasard les particules de glycogène, commencez par le carré supérieur gauche et déplacez-vous vers la gauche si nécessaire. À l’aide de l’outil en ligne droite, mesurez le diamètre de cinq particules de glycogène choisies au hasard de chaque pool pour chacune des 12 images afin d’obtenir une moyenne de 60 particules par pool et par fibre. Cette figure montre les valeurs normales des trois pools de glycogène.

On peut observer que les valeurs de glycogène intermyofibrillaire sont distribuées près de la normale, alors que le glycogène intramyofibrillaire et sous-sarmateux montre une distribution asymétrique où les fibres ont parfois une quantité excessive de glycogène. Parmi toutes les étapes, il est très important d’utiliser du ferrocyanure de potassium. L’analyse du glycogène peut être combinée à l’analyse des gouttelettes de mitochondrie et de lipides, ce qui peut améliorer notre compréhension de la corrélation entre d’autres composants métaboliques clés et la santé musculaire.