Quantification de la motilité de l’essaimage de surface bactérienne sur les plaques de gradient inducteur

Le protocole suit simultanément les réponses d’essaimage bactérien à différentes concentrations d’inducteurs sur une gélose semi-solide. Ceci est réalisé de manière rentable. Cette technique de criblage à haut débit annule le besoin d’une gélose avec diverses concentrations inductrices pour observer les réponses microchimiotactiques.

La technique est conçue pour le dépistage de drogues et aussi pour observer les réponses SD micropathogènes. En outre, il peut être utilisé pour étudier les microréponses à divers indices biochimiques chez l’hôte humain. Cette méthode peut fournir un aperçu de la chimiotaxie bactérienne.

Les bactéries réagiront à diverses concentrations d’attractifs chimiques connus sous le nom de chimiotaxie positive ou de répulsifs chimiques connus sous le nom de chimiotaxie négative. Une configuration soigneusement préparée est essentielle pour éviter les variations entre l’angle de gel de la couche inférieure afin d’éviter le problème de reproductibilité. Pour commencer, étiquetez des boîtes de Petri carrées de 13 par 13 centimètres avec des taches et des noms d’inducteurs.

Ensuite, soutenez la vaisselle sur le bord des couvercles. Ajouter la solution d’arabinose au milieu de la couche inférieure chaude. Ajouter 40 millilitres de milieu de couche inférieure chaud.

Laissez le milieu de la couche inférieure durcir à découvert pendant une heure à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire sans être dérangé. Une fois la couche inférieure complètement solidifiée, retirez les couvercles et posez les boîtes de Petri à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire. Ajouter 40 millilitres de milieu chaud de la couche supérieure à l’aide d’un filtre à pipette motorisé.

Durcissez les plaques à double couche couvertes et non perturbées pendant une heure, puis conservez-les à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Placez le papier A4 marqué sous une plaque dégradée bien solidifiée. Poussez le côté plus large d’une pointe de pipette de 100 microlitres dans la surface du milieu semi-solide à la position marquée et appuyez sur la pointe de la pipette jusqu’à ce qu’elle atteigne le bas du milieu de la couche supérieure.

Lorsque la pointe touche le fond, arrêtez d’appliquer une force verticale sur la pointe et faites pivoter doucement la pointe pour isoler le contenu du puits cylindrique. Déplacez horizontalement l’embout de la pipette le long d’une petite distance pour permettre à l’air de circuler dans l’endroit étroit mis de côté. Appuyez sur la pointe avec l’index pour bloquer le flux de gaz à l’intérieur de la pointe.

Retirez la pointe verticalement, en gardant le contenu du puits dans la pointe tout en la retirant. Ajoutez 80 microlitres de la culture de croissance du jour au lendemain dans chaque puits. Sortez les plaques d’essaim de l’incubateur une à la fois toutes les 12 heures et placez-les dans le système d’imagerie en gel.

Sélectionnez le mode d’imagerie sur gel, exposez la plaque d’essaim à la lumière blanche et ajustez la distance focale pour obtenir une vue claire des essaims. Améliorez la luminosité des essaims pour une observation précise en ajustant le temps d’exposition à 300 millisecondes. Ajustez le seuil pour minimiser les interférences de la lumière de fond.

Enregistrez le fichier image pour une analyse plus approfondie. Enregistrez le temps d’imagerie, le type d’inducteur, l’orientation du gradient et les déformations dans un fichier txt. Cliquez sur Processus, puis sur Ombres pour améliorer la netteté de l’image.

Cliquez sur Processus suivi de Batch pour traiter l’image. Ensuite, traitez une image comme référence en cliquant sur Processus, Ombres et Sud. Cliquez sur Processus, Lot, Macro pour ouvrir la fenêtre Traitement par lots.

Recherchez les commandes affichées dans la fenêtre. Tapez l’adresse du dossier des images d’origine dans l’adresse du fichier de sortie en cliquant sur Processus dans la fenêtre Traitement par lots. Utilisez l’outil de traçage de baguette pour sélectionner les essaims individuellement et double-cliquez sur l’outil de traçage de baguette pour ajuster la tolérance jusqu’à ce que la ligne générée s’adapte correctement à la limite de l’essaim.

Cliquez sur Analyser, puis sur Mesurer pour exporter la valeur de la zone. E. coli K12 YdeH a été testé sur des plaques de gradient arabinose utilisées pour démontrer le processus d’essaimage de surface avec chevauchement se produisant entre les puits adjacents. Une plaque avec trois puits d’essai a permis la formation de limites qui ne se chevauchaient pas.

La motilité d’essaimage de P.aeruginosa PAO1 YdeH a été favorisée par une augmentation de la concentration d’arabinose à partir de la concentration la plus faible, mais progressivement limitée avec des concentrations plus élevées d’arabinose. Les souches de type sauvage E. coli K12 testées sur des plaques de gradient de resvératrol dans la plage de concentration de zéro à 400 microlitres ont montré une restriction modeste de la motilité d’essaimage avec une concentration croissante de resvératrol. Les zones d’essaim ont été quantifiées par le logiciel ImageJ.

La courbe d’essaimage affichait les multiples réponses de concentration. La partie la plus cruciale de cette procédure consiste à fabriquer une plaque d’essaim à double couche avec une plage de concentration spécifique d’inducteurs. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier l’essaimage de surface induit dans une plage de concentration spécifique et de quantifier les effets d’autres inducteurs et composants sur l’essaimage.