Name: Une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV à l’aide d’un test colorimétrique à base de cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Apprenez à détecter les anticorps neutralisants contre l'AAV6 à l'aide d'un test colorimétrique sur cellules HT1080. Cette méthode simple et économique permet d'évaluer l'activité neutralisante pour optimiser les thérapies géniques.

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Cette étude a été financée par une subvention de projet du Conseil national de la santé et de la recherche médicale à JRM et CJT (ID 1163732) et en partie par le programme de soutien à l’infrastructure opérationnelle du gouvernement victorien. SB est soutenu par une bourse de doctorat conjointe baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University. KLW est soutenu par la Shine On Foundation et une future bourse Future Leader de la National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM est soutenu par une bourse de recherche principale du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (ID 1078985).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce rapport décrit un test colorimétrique qui évalue l’étendue de la neutralisation de l’AAV dans un échantillon de sérum donné en évaluant une réaction chromogène correspondant au degré de transduction virale in vitro. Le développement du protocole était basé sur la réaction chromogène connue entre l’enzyme phosphatase alcaline et nbT / BCIP, qui a été largement utilisée comme outil de coloration pour la détection de cibles protéiques dans des applications telles que l’immunohistochimie et comme outil rapporteur...

Les virus adéno-associés (AAV) sont de plus en plus utilisés comme vecteurs pour l’administration de thérapies géniques à des traitements d’essai pour divers problèmes de santé qui ont un impact sur les systèmes cardiovasculaire, pulmonaire, circulatoire, oculaire et nerveux central1,2,3,4,5. La popularité des vecteurs AAV en tant que plate-forme de thérapie génique de premier plan découle de leur profil d’innocuité positif, de leur expression transgénique à long terme et de leurs tropismes spécifiques aux tissus1,6. Les résultats positifs des études animales ont ouvert la voie à plus de cinquante essais cliniques de thérapie génique AAV qui ont atteint avec succès leurs critères d’efficacité7, ainsi qu’à la sortie du premier médicament de thérapie génique AAV disponible dans le commerce approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis8. Après les premiers succès, l’AAV a continué de gagner du terrain dans les secteurs de la recherche fondamentale et clinique en tant que vecteur de choix et est actuellement la seule thérapie génique in vivo approuvée pour une utilisation clinique aux États-Unis et en Europe9. Néanmoins, la présence d’anticorps neutralisants préexistants (NAbs) contre les capsides vectorielles AAV reste un obstacle à la recherche préclinique et à l’efficacité des essais cliniques. Les NAbs sont présents dans les populations humaines et animales naïves et inhibent la transduction des gènes après l’administration in vivo d’un vecteur AAV1. La séropositivité à l’AAV est un critère d’exclusion pour la plupart des essais de thérapie génique et, par conséquent, le dépistage préliminaire de l’immunité de l’hôte est crucial en laboratoire et en clinique. L’établissement d’un test capable de détecter la présence de NAbs contre l’AAV est une étape essentielle dans le pipeline de tout projet de recherche basé sur la thérapie génique AAV. Ce rapport se concentre sur AAV6 qui a intéressé les chercheurs en raison de sa transduction efficace et sélective dans les muscles striés (cœur et muscle squelettique)1,10,11,12. La thérapie génique est considérée comme une stratégie prometteuse pour cibler le cœur, car il est difficile de cibler spécifiquement le cœur sans procédures invasives à cœur ouvert.
L’activité neutralisante est généralement déterminée à l’aide d’un test d’inhibition de la transduction in vitro ou in vivo à base de cellules. In vivo Les tests NAb impliquent généralement l’administration de sérum d’un sujet testé (par exemple, humain ou gros animal) à des souris, suivie d’un AAV avec un gène rapporteur, suivi d’un test d’expression du gène rapporteur ou de l’antigène correspondant. Les essais in vitro déterminent les titres de NAb en incubant du sérum ou du plasma d’un humain ou d’un gros animal dans des dilutions en série avec un AAV recombinant (rAAV) qui exprime un gène rapporteur. Les cellules sont infectées par le mélange sérum/virus, et la mesure dans laquelle l’expression du gène rapporteur est inhibée est évaluée par rapport aux témoins. Les tests in vitro sont largement utilisés pour le dépistage du NAb en raison de leur coût comparativement inférieur, de la rapidité des tests et de la plus grande capacité de normalisation et de validation13,14 par rapport aux essais in vivo. On rapporte souvent que les essais in vivo ont une plus grande sensibilité15,16, mais la même allégation a été faite concernant les essais in vitro14,17.
À ce jour, les tests NAb in vitro ont principalement utilisé la luminescence (luciférase) comme gène rapporteur pour détecter la neutralisation. Bien qu’une méthode basée sur la lumière ait du mérite dans de nombreux contextes, un test colorimétrique / chromogène NAb peut être avantageux dans certaines circonstances. Des tests colorimétriques pour évaluer la neutralisation ont été utilisés avec succès pour d’autres virus tels que la grippe et l’adénovirus18,19. Leur attrait provient de leur simplicité, de leur coût inférieur et de l’exigence de ne disposer que d’appareils et d’outils de laboratoire quotidiens20. Les tests NAb qui utilisent un gène rapporteur basé sur la luminescence nécessitent des kits de substrat coûteux, un luminomètre et un logiciel correspondant pour l’analyse21. Ce test colorimétrique a l’avantage de ne nécessiter qu’un microscope optique et un substrat très bon marché. La déclaration de la sensibilité des tests colorimétriques par rapport aux tests luminescents a donné des résultats contradictoires. Une étude a suggéré que les tests ELISA basés sur la luminescence présentent une plus grande sensibilité et une reproductibilité comparable aux tests colorimétriques22, tandis qu’une autre a révélé que les tests ELISA basés sur la colorimétrie conféraient une plus grande sensibilité23. Ici, un protocole détaillé pour un test NAb in vitro contre l’AAV qui utilise la réaction chromogène entre un AAV codant pour un gène rapporteur de phosphatase alcaline (AP) et un substrat de tétrazolium bleu nitro / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP) est fourni. Ce protocole étape par étape a été développé sur la base d’un rapport précédent qui utilisait un gène rapporteur hPLAP (phosphatase alcaline placentaire humaine) (AAV6-hPLAP) pour détecter l’activité neutralisante contre AAV24. Ce test est rentable, rapide, facile à configurer et nécessite un minimum de compétences techniques, d’équipement de laboratoire et de réactifs. De plus, la simplicité de ce test lui donne le potentiel d’être optimisé pour de larges applications sur différents types de cellules, de tissus ou de sérotypes viraux.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsine/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Ou l’équivalent</td></tr><tr><td>75 cm2 carré Fioles</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td>Ou l’équivalent</td></tr><tr><td>Plaque à fond plat à 96 puits</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>AAV6-CMV-hPLAP Vecteur</td><td></td><td></td><td>Recherche musculaire & Laboratoire thérapeutique (Université de Melbourne, Australie) AAV6-CMV-hPLAP peut être fourni sur demande.</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal de souris anti-AAV6 (particule intacte), (ADK6)</td><td>PROGEN</td><td>610159</td><td>Anticorps monoclonal à contrôle positif</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>SIGMAFAST</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Armoire</td><td></td><td></td><td></td>de sécurité pour la culture cellulaire et tissulaire</tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td> électronique <td>5 & 10 mL inserts</td></tr> <tr><td>à bandesSérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haute glycémie Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>cellules HT1080</td><td>Logiciel</td> ATCC <td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Disponible gratuitement : https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>Incubateur <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>37 &deg ; C, 5 % CO2</sub</td></tr><tr><td>>Light microscope avec appareil photo</td><td></td><td></td><td>Capable de prendre des photos avec un objectif 4x</td></tr><tr><td>Four</td><td></td><td></td><td>Pour un 65 &deg ; C incubation</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>MERCK</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline</td><td></td><td></td><td></td>tamponnée au phosphate</tr><tr><td>Pipettes et pointes</td><td></td><td></td><td>20 &mu ; L, 200 &mu ; L & 1 mL de pipettes simples et d’embouts 200 &mu ; L Pipette multicanaux</td></tr><tr><td>Filtre à dégagement rapide Stericup</td><td>Millipore</td><td>S2GPU10RE</td><td>Utilisé pour combiner les réactifs de média</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Séparateur de sérum Activateur de caillot</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>455071</td><td>Utilisé pour la collecte et le traitement du sérum de mouton</td>Bain-marie</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’aav à l’aide d’un test colorimétrique à base de cellules

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Les virus adéno-associés recombinants (rAAV) se sont avérés être un vecteur sûr et efficace pour le transfert de matériel génétique afin de traiter divers problèmes de santé en laboratoire et en clinique. Cependant, les anticorps neutralisants préexistants (NAbs) contre les capsides AAV posent un défi permanent pour l’administration réussie de thérapies géniques à la fois dans les grands modèles expérimentaux animaux et dans les populations humaines. Un dépistage préliminaire de l’immunité de l’hôte contre l’AAV est nécessaire pour assurer l’efficacité des thérapies géniques à base d’AAV en tant qu’outil de recherche et en tant qu’agent thérapeutique cliniquement viable. Ce protocole décrit un test colorimétrique in vitro pour détecter les facteurs neutralisants contre le sérotype 6 de l’AAV (AAV6). Le test utilise la réaction entre un AAV codant pour un gène rapporteur de phosphatase alcaline (AP) et son substrat NBT / BCIP, qui génère une tache violette quantifiable insoluble lors de la combinaison. 
Dans ce protocole, les échantillons de sérum sont combinés avec un AAV exprimant l’AP et incubés pour permettre une activité neutralisante potentielle. Le mélange de sérum viral est ensuite ajouté aux cellules pour permettre la transduction virale de tous les AAV qui n’ont pas été neutralisés. Le substrat NBT/BCIP est ajouté et subit une réaction chromogène, correspondant à la transduction virale et à l’activité neutralisante. La proportion de surface colorée est quantifiée à l’aide d’un outil logiciel gratuit pour générer des titres neutralisants. Ce test montre une forte corrélation positive entre la coloration et la concentration virale. L’évaluation d’échantillons de sérum de moutons avant et après l’administration d’un AAV6 recombinant a entraîné une augmentation spectaculaire de l’activité neutralisante (augmentation de 125 à >10 000 fois). Le test a montré une sensibilité adéquate pour détecter l’activité neutralisante dans >1:32 000 dilutions sériques. Ce test fournit une méthode simple, rapide et rentable pour détecter les NAbs contre les AAV.

Test de transduction pour établir le dosage viral optimal pour la couverture des plaques Les cellules HT1080, une lignée cellulaire de fibrosarcome bien établie, ont été sélectionnées pour ce test. Une concentration de 1 x 104 cellules HT1080 / puits a fourni ~ 50% de confluence cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Pour déterminer la concentration virale optimale pour le dosage, un rAAV codant pour un gène rapporteur hPLAP (phosphatase alcaline placentaire humaine) (AAV6-h...

Un protocole de laboratoire complet et un flux de travail d’analyse sont décrits pour un test colorimétrique rapide, rentable et simple basé sur les cellules afin de détecter les éléments neutralisants contre AAV6.

Une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV à l’aide d’un test colorimétrique à base de cellules

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Les anticorps préexistants qui neutralisent l’AAV constituent un obstacle à l’avancement des thérapies géniques de l’AAV. Ce test est un outil de dépistage pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV. Le principal avantage est qu’il est rentable, rapide, facile à configurer et nécessite un minimum de compétences techniques, d’équipement de laboratoire et de réactifs.Commencez à plaquer les cellules HT1080 le premier jour en diluant les cellules à une concentration de 1 x 10 à la cinquième cellule par millilitre dans un milieu DMEM complet préchauffé. Ensuite, ensemencez 100 microlitres de cellules par puits dans des plaques claires à fond plat de 96 puits jusqu’à la concentration de 1 x 10 à la quatrième cellule par puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit pendant 16 à 22 heures.Le deuxième jour, générez des dilutions en série des échantillons de sérum d’intérêt dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à l’aide de DMEM complet préchauffé. À chaque tube contenant des échantillons de sérum dilués, ajoutez 66 microlitres du 7,5x10 aux six génomes viraux par solution de travail de microlitre de virus. Mélanger la dilution sérique du virus par pipetage, puis placer les tubes contenant les mélanges de sérum du virus dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes pour permettre la neutralisation potentielle.Après 30 minutes, pipettez 100 microlitres du mélange de sérum viral dans chaque puits de la plaque de 96 puits contenant 1x10 à la quatrième cellule par puits, puis enveloppez la plaque dans une feuille pour la placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit pendant 16 à 24 heures. Le troisième jour, aspirez le média des puits de la plaque de 96 puits à l’aide d’un aspirateur à hotte sans perturber les cellules adhérentes et ajoutez 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4% à chaque puits. Après avoir enveloppé la plaque dans du papier d’aluminium, laissez-la pendant 10 minutes à température ambiante.Plus tard, lavez et aspirez les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS à température ambiante. Après le deuxième lavage, pipettez 200 microlitres de PBS préchauffé dans chaque puits et enveloppez la plaque dans une feuille suivie d’une incubation à 65 degrés Celsius pendant 90 minutes pour dénaturer l’activité endogène de la phosphatase alcaline, après incubation à 50 microlitres du BCIP/NBT dissous fraîchement préparé dans chaque puits et incuber les plaques enveloppées à température ambiante pendant deux à 24 heures. Plus tard, prenez des photos de chaque puits à l’aide d’un objectif 4X dans un appareil photo de microscope optique, en assurant l’utilisation cohérente de la même exposition, de l’équilibrage des blancs et des mêmes paramètres de lumière pour tous les tests.Pour analyser l’image dans ImageJ, sélectionnez le fichier et cliquez sur Ouvrir. Pour les images colorées, convertissez-les en échelle de gris en sélectionnant les onglets Image, Type et 8 bits dans l’ordre. Ensuite, allez dans l’onglet Image et sélectionnez Ajuster et Seuil pour modifier le seuil jusqu’à ce que toutes les zones colorées soient colorées et rouges, mais pas l’arrière-plan.cliquez sur Analyser et définir les mesures et cochez les cases Zone, Fraction de surface, Limite au seuil et Étiquette d’affichage avant d’appuyer sur OK.To déterminer la lecture du signal d’un puits donné, cliquez sur Analyser et mesurer afin que la colonne de pourcentage de la fenêtre contextuelle affiche la lecture du signal. L’étude a établi le dosage viral optimal en ajoutant le gène rapporteur AAV6-hPLAP dans les cellules à une gamme de concentrations du génome viral. Une multiplicité d’infection de 15 000 a conféré une coloration de plaque de 36% et a été sélectionnée comme dosage viral optimal.L’analyse représentative montre la corrélation entre la coloration et les multiplicités d’infection. La concentration testée la plus élevée qui n’a pas affecté la corrélation linéaire entre la coloration et la concentration virale a été obtenue. L’étude de l’activité neutralisante sur un anticorps monoclonal anti-AAV6 contre le virus adéno-associé ou AAV6 à la dilution log 10 a montré une inhibition de 50% de la transduction AAV6 ou TI50 à une concentration de 10 nanogrammes par millilitre.Dans le test d’anticorps neutralisants ou de NAb, le degré de neutralisation de l’AAV variait au sein de la population d’échantillons naïfs avec des valeurs de titre TI50 allant de 1/2 à 1/80. Les résultats du test ont indiqué que les valeurs du titre TI50 d’inhibition de l’AAV avant l’administration de l’AAV variaient de 1/4 à 1/80. Après l’administration de l’AAV, le titre TI50 est passé entre 1/2000 et plus de 1/32 000, ce qui démontre un net contraste dans les valeurs de titre entre l’administration pré-AAV et post-AAV.Lors de la prise de photos des puits, il est important d’utiliser systématiquement les mêmes réglages de microscope tout au long de l’essai et de s’assurer que les photos sont prises directement au centre des puits.

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Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test colorimétrique in vitro pour détecter la présence d’anticorps neutralisants contre les vecteurs du virus adéno-associé recombinant de sérotype 6 exprimant la phosphatase alcaline (rAAV6) dans des échantillons de sérum de mouton. Le test utilise la réaction entre l’AAV codant pour un gène de phosphatase alcaline placentaire humaine et son substrat pour générer un produit violet insoluble.

Dosage cellulaire des anticorps neutralisants AAV : une technique colorimétrique pour détecter les anticorps neutralisants contre des virus adéno-associés spécifiques dans le sérum

Cette vidéo montre des tests de microneutralisation pour mesurer les anticorps neutralisants à l’aide de cellules rénales canines de Madin-Darby surexprimant l’acide sialique lié à l’α2,6 dans le sérum humain. Ce test est souvent utilisé pour la sérologie humaine de la...

Un test de microneutralisation pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants dans le sérum humain

Cette vidéo montre le test de micro-neutralisation basé sur l’imagerie pour analyser les relations antigéniques entre les virus de la grippe A et B. Il fournit un moyen quantitatif et visuel d’évaluer l’efficacité des anticorps ou d’autres traitements dans la prévention des infections virales.

Analyse de la relation antigénique entre les virus à l’aide d’un test de microneutralisation basé sur l’image

Cette vidéo présente un test de mesure des anticorps neutralisants contre le virus respiratoire syncytial (VRS). La pré-incubation avec un sérum contenant des anticorps neutralisants contre le VRS neutralise les particules virales, réduisant ainsi l’infection cellulaire et la formation de plaques. Les cellules infectées par le virus sont ensuite soumises à la fixation, au blocage et au marquage d’anticorps conjugués aux fluorophores pour la visualisation de la plaque. Ce processus permet...

Un test pour mesurer le titre d’anticorps neutralisants spécifiques du virus respiratoire syncytial

Cette étude décrit un   à base d'imagerie-dosage micro-neutralisation pour analyser les relations antigéniques entre les virus. Le protocole utilise un scanner à plat et comporte quatre étapes, dont le titrage, titrage quantification, la neutralisation et la neutralisation quantification. Le test fonctionne bien avec un courant circulant de la grippe A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B.

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

Les anticorps neutralisants de grippe sont en corrélation avec protection des infections grippales. Tests de micro-neutralisation mesurent les anticorps neutralisants dans des sérums humains et sont souvent utilisés pour la sérologie humaine de la grippe. Nous décrivons un essai de micro-neutralisation en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants à virus a (H3N2) 3C.2a et 3C.3a contemporains après vaccination contre la grippe ou une infection.

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Ce manuscrit détaille un essai par transfert de point simple pour le dosage des titres adeno-associated virus (AAV) et son application pour étudier le rôle de l’Assemblée-activation protéines (AAPs), une nouvelle classe de protéines virales non structurales dans tous les AAV sérotypes, dans la promotion de l’Assemblée des capsides dérivé de sérotypes d’AAV apparentés et hétérologues.

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Le protocole décrit ici décrit décrit une méthode rapide et efficace pour mesurer les anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 en évaluant la capacité des échantillons de sérum de convalescent à inhiber l’infection par un virus de la stomatite vésiculeuse marqué par une protéine fluorescente verte améliorée pseudotypée avec une glycoprotéine de pointe.

Détection des anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide de l’imagerie fluorescente à haut débit de l’infection à pseudovirus

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la génération et la purification de vecteurs viraux adéno-associés à l’aide d’une méthode de chromatographie d’affinité optimisée basée sur l’héparine. Il s’agit d’une approche simple, évolutive et rentable, qui élimine le besoin d’ultracentrifugation. Les vecteurs résultants présentent une pureté et une activité biologique élevées, ce qui prouve leur valeur dans les études précliniques.

Isolement de vecteurs viraux adéno-associés au moyen d’un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine en une seule étape et semi-automatisé

Alors que le domaine de la thérapie génique continue d’évoluer, il existe un besoin croissant de méthodes innovantes capables de relever ces défis. Ici, une méthode unique est présentée, qui rationalise le processus de génération de vecteurs AAV à haut rendement et de haute pureté à l’aide d’une plate-forme d’usine de cellules, répondant aux normes de qualité des études in vivo .

Une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire

Apprenez à détecter les anticorps neutralisants contre l'AAV6 à l'aide d'un test colorimétrique sur cellules HT1080. Cette méthode simple et économique permet d'évaluer l'activité neutralisante pour optimiser les thérapies géniques.

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