Une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV à l’aide d’un test colorimétrique à base de cellules

Les anticorps préexistants qui neutralisent l’AAV constituent un obstacle à l’avancement des thérapies géniques de l’AAV. Ce test est un outil de dépistage pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV. Le principal avantage est qu’il est rentable, rapide, facile à configurer et nécessite un minimum de compétences techniques, d’équipement de laboratoire et de réactifs.

Commencez à plaquer les cellules HT1080 le premier jour en diluant les cellules à une concentration de 1 x 10 à la cinquième cellule par millilitre dans un milieu DMEM complet préchauffé. Ensuite, ensemencez 100 microlitres de cellules par puits dans des plaques claires à fond plat de 96 puits jusqu’à la concentration de 1 x 10 à la quatrième cellule par puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit pendant 16 à 22 heures.

Le deuxième jour, générez des dilutions en série des échantillons de sérum d’intérêt dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à l’aide de DMEM complet préchauffé. À chaque tube contenant des échantillons de sérum dilués, ajoutez 66 microlitres du 7,5x10 aux six génomes viraux par solution de travail de microlitre de virus. Mélanger la dilution sérique du virus par pipetage, puis placer les tubes contenant les mélanges de sérum du virus dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes pour permettre la neutralisation potentielle.

Après 30 minutes, pipettez 100 microlitres du mélange de sérum viral dans chaque puits de la plaque de 96 puits contenant 1x10 à la quatrième cellule par puits, puis enveloppez la plaque dans une feuille pour la placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit pendant 16 à 24 heures. Le troisième jour, aspirez le média des puits de la plaque de 96 puits à l’aide d’un aspirateur à hotte sans perturber les cellules adhérentes et ajoutez 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4% à chaque puits. Après avoir enveloppé la plaque dans du papier d’aluminium, laissez-la pendant 10 minutes à température ambiante.

Plus tard, lavez et aspirez les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS à température ambiante. Après le deuxième lavage, pipettez 200 microlitres de PBS préchauffé dans chaque puits et enveloppez la plaque dans une feuille suivie d’une incubation à 65 degrés Celsius pendant 90 minutes pour dénaturer l’activité endogène de la phosphatase alcaline, après incubation à 50 microlitres du BCIP/NBT dissous fraîchement préparé dans chaque puits et incuber les plaques enveloppées à température ambiante pendant deux à 24 heures. Plus tard, prenez des photos de chaque puits à l’aide d’un objectif 4X dans un appareil photo de microscope optique, en assurant l’utilisation cohérente de la même exposition, de l’équilibrage des blancs et des mêmes paramètres de lumière pour tous les tests.

Pour analyser l’image dans ImageJ, sélectionnez le fichier et cliquez sur Ouvrir. Pour les images colorées, convertissez-les en échelle de gris en sélectionnant les onglets Image, Type et 8 bits dans l’ordre. Ensuite, allez dans l’onglet Image et sélectionnez Ajuster et Seuil pour modifier le seuil jusqu’à ce que toutes les zones colorées soient colorées et rouges, mais pas l’arrière-plan.

cliquez sur Analyser et définir les mesures et cochez les cases Zone, Fraction de surface, Limite au seuil et Étiquette d’affichage avant d’appuyer sur OK.To déterminer la lecture du signal d’un puits donné, cliquez sur Analyser et mesurer afin que la colonne de pourcentage de la fenêtre contextuelle affiche la lecture du signal. L’étude a établi le dosage viral optimal en ajoutant le gène rapporteur AAV6-hPLAP dans les cellules à une gamme de concentrations du génome viral. Une multiplicité d’infection de 15 000 a conféré une coloration de plaque de 36% et a été sélectionnée comme dosage viral optimal.

L’analyse représentative montre la corrélation entre la coloration et les multiplicités d’infection. La concentration testée la plus élevée qui n’a pas affecté la corrélation linéaire entre la coloration et la concentration virale a été obtenue. L’étude de l’activité neutralisante sur un anticorps monoclonal anti-AAV6 contre le virus adéno-associé ou AAV6 à la dilution log 10 a montré une inhibition de 50% de la transduction AAV6 ou TI50 à une concentration de 10 nanogrammes par millilitre.

Dans le test d’anticorps neutralisants ou de NAb, le degré de neutralisation de l’AAV variait au sein de la population d’échantillons naïfs avec des valeurs de titre TI50 allant de 1/2 à 1/80. Les résultats du test ont indiqué que les valeurs du titre TI50 d’inhibition de l’AAV avant l’administration de l’AAV variaient de 1/4 à 1/80. Après l’administration de l’AAV, le titre TI50 est passé entre 1/2000 et plus de 1/32 000, ce qui démontre un net contraste dans les valeurs de titre entre l’administration pré-AAV et post-AAV.

Lors de la prise de photos des puits, il est important d’utiliser systématiquement les mêmes réglages de microscope tout au long de l’essai et de s’assurer que les photos sont prises directement au centre des puits.