Name: Cartographie du transfert d’énergie par résonance de Förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Découvrez la cartographie FRET pour étudier la dynamique des protéines et identifier les sites de liaison des ligands en solution. Cette méthode complète les données structurales 3D pour une analyse biomoléculaire avancée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la subvention R15GM135904 des National Institutes of Health (attribuée à IM) et la subvention GM110552 des National Institutes of Health (attribuée à DBO).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Grâce à l’utilisation de la méthodologie de cartographie FRET, nous avons identifié le site de liaison de la séquence de signaux sur la protéine SecA. Il est important de noter que la présence d’une structure cristalline 3D du complexe a grandement facilité notre étude. La force de cette méthodologie de cartographie réside dans la capacité d’utiliser une structure existante pour identifier les emplacements à étiqueter. Cette méthodologie ne peut pas être utilisée pour déterminer une structure 3D; toutefois, la déterminat...

Pour les protéines, l’élucidation de la dynamique ainsi que les connaissances structurelles en 3 dimensions (3D) conduisent à une meilleure compréhension des relations structure-fonction des systèmes biomoléculaires. Les méthodes structurelles, telles que la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique cryogénique, capturent une structure statique et nécessitent souvent la détermination de plusieurs structures pour élucider les aspects de la liaison et de la dynamique des biomolécules1. Cet article décrit une méthode basée sur une solution pour mapper des éléments structurels globaux, tels que des sites de liaison ou des interactions de liaison, qui sont potentiellement plus transitoires et moins facilement capturés par des méthodes statiques. Les systèmes candidats solides pour cette méthodologie sont ceux dans lesquels une structure 3D a déjà été déterminée par cristallographie aux rayons X, spectroscopie RMN ou d’autres méthodes structurelles. Dans ce cas, nous tirons parti de la structure cristalline des rayons X du complexe SecA-SecYEG, un acteur central de la voie sécrétoire générale des protéines, pour cartographier l’emplacement d’un site de liaison peptidique signal à l’aide du transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) avant le transport de la préprotéine à travers la membrane2. La manipulation du système biologique par des modifications génétiques couplée à notre connaissance de la structure 3D a permis de déterminer la conformation de la séquence de signaux et de la région mature précoce immédiatement avant l’insertion dans le canal 3.
FRET implique le transfert d’énergie sans rayonnement d’une molécule (donneur) à une autre (accepteur) d’une manière dépendante de la distance qui traverse l’espace 4,5. L’efficacité de ce transfert est surveillée soit par une diminution du donneur, soit par une augmentation de l’intensité de fluorescence de l’accepteur. L’efficacité du transfert d’énergie peut être décrite comme suit :
E = R06/(R06 + R6)
dans laquelle la valeur R0 est la distance à laquelle le transfert est efficace à 50 %6. La technique a déjà été décrite comme une règle moléculaire et est efficace pour déterminer des distances comprises entre 2,5 et 12 nm, en fonction de l’identité des colorants donneur-accepteur 4,7,8,9. Les intensités de fluorescence du donneur et les durées de vie avec ou sans accepteur permettent de déterminer les efficacités de transfert et, par conséquent, les distances 5,8. En raison de la disponibilité de la technologie, de la sensibilité de la méthode et de la facilité d’utilisation, FRET a également trouvé une large application dans des domaines tels que la spectroscopie de fluorescence à molécule unique et la microscopie confocale6. L’avènement de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte a rendu l’observation de la dynamique intracellulaire et de l’imagerie des cellules vivantes relativement facile10,11. De nombreuses applications FRET telles que celles-ci sont abordées en détail dans ce numéro virtuel.
Dans cette étude, nous nous concentrons particulièrement sur l’utilisation des mesures FRET pour produire des valeurs de distance afin de déterminer les détails structurels. Auparavant, les mesures FRET ont été utilisées efficacement pour déterminer la conformation des molécules d’ADN lorsqu’elles sont liées à la protéine 12,13,14, la dynamique interne des protéines et les interactions de liaison aux protéines 15,16,17. Les avantages de cette méthode résident dans la capacité de déterminer des éléments structurels flexibles et dynamiques dans une solution avec des quantités relativement faibles de matériau. De manière significative, cette méthode est particulièrement efficace lorsqu’elle est utilisée conjointement avec des informations structurelles existantes et ne peut pas être utilisée comme moyen de détermination de la structure 3D. La méthode fournit le meilleur aperçu et le meilleur raffinement de la structure si le travail s’appuie sur des informations structurelles existantes souvent couplées à une simulation informatique18,19. Ici, l’utilisation des distances obtenues à partir de mesures FRET à l’état d’équilibre et résolues dans le temps est décrite pour cartographier un site de liaison, dont l’emplacement n’était pas connu, sur une structure cristallographique existante du complexe SecA-SecYEG, des protéines majeures de la voie sécrétoire générale3.
La voie sécrétoire générale, un système hautement conservé des procaryotes aux eucaryotes en passant par les archées, médie le transport des protéines à travers ou dans la membrane jusqu’à leur emplacement fonctionnel dans la cellule. Pour les bactéries à Gram négatif, telles que E. coli, l’organisme utilisé dans notre étude, les protéines sont insérées ou transloquées à travers la membrane interne vers le périplasme. Le complexe de canaux secY bactériens (appelé translocon) se coordonne avec d’autres protéines pour translocaliser la protéine nouvellement synthétisée, qui est dirigée vers son emplacement correct dans la cellule par une séquence de signaux généralement située à la terminaison N20,21. Pour les protéines liées au périplasme, la protéine ATPase SecA s’associe au tunnel de sortie du ribosome, et à la préprotéine après qu’environ 100 résidus ont été traduits22. Avec la protéine chaperonne SecB, il maintient la préprotéine dans un état déplié. SecA se lie au translocon SecYEG et, à travers de nombreux cycles d’hydrolyse de l’ATP, facilite le transport des protéines à travers la membrane23,24.
SecA est une protéine multi-domaine qui existe sous des formes cytosoliques et membranaires. Une protéine homodimérique dans le cytosol, SecA se compose d’un domaine de liaison ou de réticulation préprotéique25, de deux domaines de liaison aux nucléotides, d’un domaine alaire hélicoïdal, d’un domaine d’échafaudage hélicoïdal et des deux doigts hélicoïdaux (THF)26,27,28,29 (Figure 1). Dans des études cristallographiques antérieures du complexe SecA-SecYEG, l’emplacement du THF a suggéré qu’il était activement impliqué dans la translocation des protéines et les expériences de réticulation ultérieures avec le peptide signal ont établi l’importance de cette région dans la translocation des protéines30,31. Des études antérieures, utilisant la méthodologie de cartographie FRET, ont démontré que les peptides de signal exogènes se lient à cette région de SecA 2,32. Pour bien comprendre la conformation et l’emplacement de la séquence de signaux et de la région mature précoce de la préprotéine avant son insertion dans le canal SecYEG, une chimère protéique dans laquelle la séquence de signal et les résidus de la région mature précoce ont été attachés à SecA par l’intermédiaire d’un liant Ser-Gly a été créée (Figure 1). En utilisant cette construction biologiquement viable, il a été démontré que la séquence de signaux et la région mature précoce de la préprotéine se lient au THF de manière parallèle2. Par la suite, la méthodologie de cartographie FRET a été utilisée pour élucider la conformation et l’emplacement de la séquence de signaux et de la région mature précoce en présence de SecYEG, comme décrit ci-dessous3.
La connaissance de la structure 3D du complexe SecA-SecYEG 33,34,35 et de l’emplacement possible du site de liaison nous a permis de placer judicieusement des étiquettes donneur-accepteur dans des endroits où l’intersection des distances FRET individuelles identifie l’emplacement du site de liaison. Ces mesures de cartographie FRET ont révélé que la séquence de signaux et la région mature précoce de la préprotéine forment une épingle à cheveux avec la pointe située à l’embouchure du canal SecYEG, démontrant que la structure en épingle à cheveux est modélisée avant l’insertion du canal.

<table><tbody><tr><td>Laser LED 490 nm</td><td>Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maléimide//DIBO Alcyne</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maléimide/DIBO Alcyne</td><td>Life Technologies</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alcyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alcyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra&shy ; 4 Filtre centrifuge (50kDa MWCO)</td><td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylmaltoside (DDM)</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>E. coli phosphatase alcaline peptide signal SP22</td><td>Biomolécules Midwest</td><td>N/A</td><td>Synthétisé article personnalisé</td></tr><tr><td>peptide de signal étendu SP41</td><td>Biomolécules Midwest</td><td>N/A</td><td>Synthétisé article personnalisé</td></tr><tr><td>FluorEssence</td>Programme d’acquisition spectrale <td>Horiba</td><td>version 2.4</td><td>pour le spectrofluorimètre Fluoromax4</td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre Fluoromax 4</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, Université de Californie, Irvine</td><td></td><td>Programme d’analyse spectrale pour les désintégrations résolues en temps</td></tr><tr><td>H&shy ; 4&timide ; Azido&shy ; Phe&shy ; OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Miller) Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 silice colloïdale (40 % en poids de suspension dans H2O)</td>La dilution de <td>Sigma-Aldrich</td><td>420816</td><td>est nécessaire pour obtenir une solution de diffusion appropriée</td></tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>version 4.1.0.4096</td><td>programme d’acquisition spectrale pour PTI Time Master Instrument</td></tr><tr><td>PTI Time Master Instrument</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol Molecular Graphics Program</td><td>Schrödinger</td><td>version 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

cartographie du transfert d’énergie par résonance de förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est une méthode établie basée sur la fluorescence utilisée pour mesurer avec succès les distances dans et entre les biomolécules in vitro ainsi qu’à l’intérieur des cellules. Dans FRET, l’efficacité du transfert d’énergie, mesurée par les changements d’intensité de fluorescence ou de durée de vie, est liée à la distance entre deux molécules ou étiquettes fluorescentes. La détermination de la dynamique et des changements conformationnels à partir des distances ne sont que quelques exemples d’applications de cette méthode aux systèmes biologiques. Dans certaines conditions, cette méthodologie peut ajouter et améliorer les structures cristallines de rayons X existantes en fournissant des informations sur la dynamique, la flexibilité et l’adaptation aux surfaces de liaison. Nous décrivons l’utilisation du FRET et des déterminations de distance associées pour élucider les propriétés structurelles, par l’identification d’un site de liaison ou les orientations des sous-unités dimères. Grâce à un choix judicieux des sites de marquage et souvent à l’utilisation de plusieurs stratégies de marquage, nous avons appliqué avec succès ces méthodes de cartographie pour déterminer les propriétés structurelles globales d’un complexe protéine-ADN et du système de translocation de protéines SecA-SecYEG. Dans le système SecA-SecYEG, nous avons utilisé des méthodes de cartographie FRET pour identifier le site de liaison des préprotéines et déterminer la conformation locale de la région de séquence de signaux liés. Cette étude décrit les étapes à suivre pour effectuer des études de cartographie FRET, y compris l’identification des sites d’étiquetage appropriés, la discussion des étiquettes possibles, y compris les résidus d’acides aminés non natifs, les procédures d’étiquetage, la façon d’effectuer des mesures et l’interprétation des données.

Cette étude s’est concentrée sur la détermination de l’emplacement du site de liaison des préprotéines sur SecA avant l’insertion de la préprotéine dans le canal SecYEG. Pour cartographier le site de liaison, des expériences FRET ont été réalisées entre différentes régions de la préprotéine et trois emplacements distincts sur les protéines SecA et SecYEG (Figure 1A-D). À partir des distances obtenues et des structures tridimensionnelles de SecA, SecYEG et de...

L’étude détaille la méthodologie de la cartographie FRET, y compris la sélection des sites d’étiquetage, le choix des colorants, l’acquisition et l’analyse des données. Cette méthodologie est efficace pour déterminer les sites de liaison, les changements conformationnels et les mouvements dynamiques dans les systèmes protéiques et est plus utile si elle est réalisée en conjonction avec les informations structurelles 3D existantes.

Cartographie du transfert d’énergie par résonance de Förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Nous avons développé une méthodologie de cartographie FRET qui permet l’identification et la caractérisation des sites de liaison des ligands, de l’orientation des sous-unités, des changements conformationnels associés à la liaison aux ligands et des mouvements dynamiques des protéines. Un avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée en solution et que les molécules peuvent se déplacer librement. Les distances mesurées par cette technique sont appropriées pour les systèmes biologiques.FRET est largement applicable à de nombreux systèmes. La cartographie améliore la surveillance des changements structurels et dynamiques dans tout système biomoléculaire et est particulièrement efficace s’il existe des informations structurelles tridimensionnelles. Après avoir purifié la protéine, la partie la plus difficile est l’étiquetage avec une grande efficacité et l’élimination du colorant libre.Pour les expériences, il est utile d’avoir le moins de colorant libre possible. Pour commencer, choisissez des sites d’étiquetage dans un intervalle de 25 à 75 angström du site de liaison punitive et dans des régions relativement statiques de la protéine. La distance déterminera la paire de colorant FRET spécifique à utiliser.Localisez les sites de marquage dans des régions protéiques relativement distinctes les unes des autres. Ainsi, les sites décrivent les sommets d’un triangle, avec le site de liaison punitive situé au centre. Pour mesurer les valeurs R0, en fonction de la taille et du volume de la cuvette souhaitée, préparez deux échantillons de protéines à la même concentration de protéines totales.Un avec la protéine marquée avec le colorant donneur uniquement, et un avec la protéine marquée avec le colorant accepteur uniquement. Allumez le fluoromètre et ouvrez le programme d’acquisition et d’analyse spectrale dans le logiciel FluorEssence, si vous utilisez un spectrofluoromètre. Cliquez sur le M rouge pour connecter l’ordinateur à l’instrument et choisissez Spectres d’émission.Entrez les paramètres de balayage à l’aide de l’élément de menu Collecter l’expérience, tels que la longueur d’onde d’excitation, la plage de balayage d’émission, la température et le changement de position de l’échantillon. Cliquez sur RTC et optimisez les réglages de l’instrument comme décrit dans le manuscrit, en surveillant l’émission de fluorescence au pic à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation réglée au maximum d’absorption du colorant. Placez l’échantillon de protéine étiqueté par donneur dans le porte-échantillon, puis cliquez sur exécuter pour générer un scan d’émission de la protéine étiquetée avec le colorant donneur uniquement, en excitant l’échantillon au maximum d’absorption du colorant et en balayant le pic d’émission.Établissez une base de référence pour l’analyse en étendant l’analyse à 25 à 50 nanomètres au-delà de la fin du pic. Mesurer le rendement quantique de la protéine donneuse uniquement en effectuant des absorptions et des mesures de fluorescence sur des échantillons de différentes concentrations, comme décrit dans le manuscrit du texte. Préparez des échantillons de protéines du donneur seulement, de protéines d’accepteur seulement et de protéines de donneur-accepteur, à la même concentration.Obtenez le scan du donneur uniquement pour générer des spectres d’émission de fluorescence. Excitez la solution au maximum d’absorption du colorant donneur et balayez les pics d’émission du donneur et de l’accepteur. Échangez l’échantillon contre la protéine accepteur uniquement, ou changez l’échantillon changez votre position pour la cuvette contenant la protéine accepteur uniquement.Obtenez un scan d’émission de la protéine marquée avec le colorant accepteur uniquement. Excitez l’échantillon à la longueur d’onde d’excitation du donneur. Échangez l’échantillon contre l’échantillon de protéine donneur-accepteur ou changez l’échantillon changez votre position pour la cuvette contenant la protéine marquée donneur-accepteur.Obtenez un scan d’émission de l’échantillon de protéine donneur-accepteur en utilisant les mêmes paramètres. Pour tous les spectres, corrigez la fluorescence de fond en soustrayant les nombres de fond mesurés à la fin du balayage. Utilisez un programme de visualisation graphique 3D tel que PyMOL pour mapper les distances sur la structure, en entrant directement les commandes du script dans la fenêtre de commande avec les informations de distance appropriées.Générez un shell pour chaque distance mesurée et l’erreur associée. Cartographiez la position à travers l’intersection des différentes coquilles. Le site de liaison du peptide signal a été cartographié en utilisant trois emplacements différents sur SecA et SecYEG, et quatre emplacements différents sur le peptide signal.Les expériences FRET entre différentes régions de la pré-protéine et trois emplacements distincts sur les protéines SecA et SecYEG cartographient le site de liaison et l’orientation de la pré-protéine. Le site de liaison punitive du peptide signal a déjà été identifié comme le doigt à deux hélices, et la queue C-terminal SecA suggérait une orientation parallèle au doigt à deux hélices. Des spectres FRET à l’état d’équilibre entre SecA37 et PhoA2 et PhoA22 ont été obtenus.La réduction de l’intensité du donneur a indiqué qu’une plus grande énergie était transférée de PhoA22. Par rapport au site PhoA2, qui est situé plus loin de SecA37. Les spectres de désintégration de fluorescence résolus dans le temps ont démontré que le complexe donneur-accepteur a une désintégration homogène plus courte compatible avec le transfert d’énergie associé à une distance.Les coquilles de distance FRET construites entre le résidu SecA PhoA2 et les sites triangulés ont démontré que chaque coquille se croise avec le doigt à deux hélices, le site de liaison supposé, qui est indiqué en vert. La zone entrecoupée est plus petite que chaque coque FRET et comprend une contribution importante de l’échafaudage hélicoïdal. Les coquilles de distance FRET déterminées entre le résidu PhoA2 et les sites marqués décrivent une zone plus petite située plus près de l’extrémité du doigt à deux hélices et de la bouche du canal SecYEG.Cette zone croisée est située à l’extrémité opposée du doigt à deux hélices de PhoA2. Les éléments importants à prendre en compte comprennent une sélection appropriée des sites d’étiquetage pour trianguler la zone d’intérêt, mesurer les rendements quantiques pour chaque site et éliminer tout le colorant libre. Cette méthode s’aligne sur les informations structurelles obtenues avec des méthodes telles que la RMN ou la cristallographie aux rayons X.Lorsque les résultats fret sont placés dans un contexte structurel, ils peuvent améliorer les informations existantes.

frster-resonance-energy-transfer-mapping-new-methodology-to-elucidate

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Une combinaison de trois simples courte longueur d'onde des lasers pulsés sont utilisés pour générer des anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS) et les voitures doublement résonnant (DR-CARS). La différence entre ces signaux fournit une sensibilité accrue pour les autrement difficiles à détecter des signaux cohérents Raman, permettant l'imagerie de la faiblesse des diffuseurs Raman.

Imagerie différentielle des structures biologiques avec doublement résonnante anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS)

Nous décrivons ici une méthode améliorée Transfert Luminescence Resonance Energy (LRET) où nous introduisons un site de clivage de protéase entre les sites de fluorophores donneur et accepteur. Cette modification permet d'obtenir des signaux de LRET spécifiques découlant de protéines membranaires d'intérêt, ce qui permet l'étude de protéines de la membrane sans la purification des protéines.

Luminescence Resonance Energy Transfer pour étudier les changements conformationnels dans des protéines membranaires exprimés dans les cellules de mammifères

Nous présentons la configuration et la procédure expérimentale pour obtenir des données smFRET à partir de grands réseaux donneurs-accepteurs avec un microscope TIRF. L’analyse étape par étape de ces mesures avec le logiciel d’inférence bayésienne Fast-NPS permet d’obtenir des informations structurelles à haute résolution grâce à l’application de modèles de colorants adaptés.

Information sur la structure à partir d&#39;une seule molécule FRET expériences utilisant la Nano-positionnement Système rapide

Un protocole pour les expériences FRET de haute précision au niveau de la molécule unique est présenté ici. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La détermination de distances précises est la première étape vers la construction de modèles structurels basés sur des expériences FRET.

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

Structures des assemblages supramoléculaires protéine à résolution atomique sont de grande importance en raison de leur rôle crucial dans une variété de phénomènes biologiques. Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des études structurales à haute résolution sur des ensembles de protéines macromoléculaire insoluble et non cristalline par magie-angle spinning spectroscopie RMN à l’état solide (MAS SSNMR).

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

Cet article décrit un protocole pour réaliser des cartes 3D chimiques combinant énergie filtré d’imagerie et de la tomographie électronique. La distribution de produits chimiques de deux supports de catalyseurs, formé par les éléments qui sont difficiles à distinguer par d’autres techniques d’imagerie a été étudiée. Chaque application se compose de cartographie des éléments chimiques superposés - bords respectivement espacés-ionisation.

Obtention des cartes 3D et chimiques par énergie filtré tomographie de microscopie électronique à Transmission

Présenté ici est un protocole pour effectuer un transfert d'énergie de résonance de résonance de F'rster à l'étude de la résolution de HJ. L'excitation alternée bicolore est utilisée pour déterminer les constantes de dissociation. Un seul temps de temps smFRET est ensuite appliqué dans les essais de clivage en temps réel pour obtenir la distribution de temps d'arrêt avant la résolution HJ.

Méthodes de transfert d'énergie par résonance à molécule unique pour l'étude en temps réel de la résolution de jonction Holliday par GEN1

Cet article présente une méthode d’analyse spatio-temporelle de sondes mobiles à transfert d’énergie de résonance de Förster (smFRET) à molécule unique utilisant la microscopie à fluorescence à grand champ. La boîte à outils logicielle nouvellement développée permet de déterminer les traces temporelles smFRET des sondes en mouvement, y compris l’efficacité FRET correcte et les positions moléculaires, en tant que fonctions du temps.

Analyse spatio-temporelle bidimensionnelle automatisée de sondes FRET mobiles à molécule unique

L’imagerie électronique par diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) de colorants Raman de type arc-en-ciel est une nouvelle plate-forme pour l’imagerie de protéines à base d’épitopes hautement multiplexées. Ici, nous présentons un guide pratique comprenant la préparation des anticorps, la coloration des échantillons de tissus, l’assemblage du microscope SRS et l’imagerie tissulaire epr-SRS.

Imagerie tissulaire hautement multiplexée avec des colorants Raman

Nous présentons un protocole pour acquérir des images chimiques avec la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande (SRS). Basé sur un microscope SRS qui fonctionne avec une détection différentielle multicanal, le protocole décrit la préparation de l’échantillon, l’ajustement de l’appareil SRS et la chimiométrie pour démêler différents constituants d’échantillons chimiquement hétérogènes.

Imagerie chimique multiplex basée sur la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande

Le protocole fournit des instructions pour modifier l’ARN avec du sulfate de diméthyle pour les expériences de profilage mutationnel. Il comprend le sondage in vitro et in vivo avec deux méthodes alternatives de préparation de bibliothèque.

Criblage de la structure de l’ARN avec le profilage mutationnel du sulfate de diméthyle avec séquençage in vitro et dans les cellules

Découvrez la cartographie FRET pour étudier la dynamique des protéines et identifier les sites de liaison des ligands en solution. Cette méthode complète les données structurales 3D pour une analyse biomoléculaire avancée.

Cartographie du transfert d’énergie par résonance de Förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales (Vidéo) | JoVE Journal

Cartographie du transfert d’énergie par résonance de Förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales

Explorer plus de vidéos