Cultiver et cribler le nématode parasite végétal Ditylenchus dipsaci

Ce protocole permet la découverte de nouveaux nématicides pour lutter contre la dipsacie de Ditylenchus par la technique de culture et les criblages chimiques à débit moyen. La simplicité de cette technique permet de cribler des milliers de composés par semaine pour identifier les composés à potentiel nématicidal. Cette technique peut identifier de nouveaux composés pour tuer les nématodes parasites des plantes des cultures et, par conséquent, augmenter l’approvisionnement alimentaire mondial.

Pour commencer, préparez 500 millilitres de gélose nutritive, ou NA, avec 23 grammes par litre de NA et de l’eau ultra-pure. En utilisant la technique stérile, versez 25 millilitres de support NA autoclavé dans 20 boîtes de Petri jetables de 100 millimètres de diamètre et de 15 millimètres de profondeur. Préparez 500 millilitres de Gamborg B5, ou GA media, contenant 3,2 grammes par litre de milieu basal GA avec un minimum de matières organiques, 20 grammes par litre de saccharose, 15 grammes par litre de gélose et de l’eau distillée.

En utilisant une technique stérile, versez 50 millilitres de support GA autoclavé dans 10 boîtes de Petri jetables. Pour effectuer la stérilisation des graines, versez 150 graines de pois dans un bécher stérile de deux litres avec une barre d’agitation près d’une flamme de brûleur Bunsen sur un banc de laboratoire. Ajouter 200 millilitres d’éthanol à 95% aux graines et remuer vigoureusement sur la plaque de remuage pendant cinq minutes.

Ensuite, versez l’éthanol dans un conteneur à déchets. Versez la solution d’eau de Javel dans le bécher pour immerger complètement les graines. Remuer vigoureusement sur une assiette à remuer pendant 20 minutes.

Ensuite, versez l’eau de Javel dans un conteneur à déchets. Versez de l’eau distillée dans le bécher pour immerger les graines et remuez vigoureusement sur une plaque à remuer pendant 20 minutes. Après le lavage final à l’eau, versez les graines stérilisées dans la boîte de Petri en verre.

Pour vérifier la contamination, transférez six graines sur chaque plaque NA de 10 centimètres dans la hotte à écoulement laminaire à l’aide d’une pince stérilisée. Disposez les graines autour de la circonférence de la plaque. Enveloppez les assiettes individuellement dans un film d’emballage de laboratoire et incubez-les dans l’obscurité pendant trois jours à 26 degrés Celsius.

Dans une hotte à écoulement laminaire, plaquer deux graines non contaminées sur chaque plaque GA avec des pinces stérilisées. Incuber à température ambiante pendant 7 à 10 jours pour permettre aux graines de germer. Préparez 50 millilitres de solution de saccharose de 20 grammes par litre.

Filtrer stériliser la solution de saccharose et réserver. Dans une hotte à écoulement laminaire, coupez un morceau de gélose contenant du tissu racinaire dans une plaque de culture existante. Pipette 500 microlitres de solution de saccharose sur une nouvelle plaque GA avec des plants de pois et placer un cube de gélose sur le saccharose.

Maintenez la culture dans une boîte recouverte de papier d’aluminium à température ambiante. Pour maintenir la culture, sous-cultiver les nématodes sur des assiettes d’AG fraîches toutes les huit à neuf semaines. Les nématodes sont prêts à être extraits après environ huit semaines.

Dans une hotte à écoulement laminaire, coupez la gélose et le tissu racinaire en cubes d’un centimètre avec un scalpel stérile. Transférez les cubes d’agar dans l’entonnoir tapissé de filtre à café et versez lentement de l’eau distillée sur la gélose pour humidifier le filtre à café. Retirez l’entonnoir recouvert de filtre à café du bécher et remplissez le bécher d’eau distillée jusqu’à ce que le niveau d’eau ne touche que le fond du filtre une fois que l’entonnoir recouvert de filtre à café est remplacé.

Couvrir l’entonnoir et le bécher recouverts de filtre à café avec du papier d’aluminium. Pour recueillir les vers, retirez l’entonnoir recouvert de filtre à café et aspirez les 40 millilitres d’eau supérieurs du bécher de collecte, sans perturber les vers installés. Recueillir le liquide restant dans un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres avec une pipette sérologique en plastique de 10 millilitres.

Pour préparer les plaques d’essai, versez de l’eau distillée en autoclave dans un bac stérile et distribuez 40 microlitres d’eau distillée de l’abreuvoir dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits avec une pipette multicanal. Ajoutez les produits chimiques des plaques de base chimiques à 96 puits aux plaques d’essai en épinglant trois fois dans la plaque chimique. Ensuite, transférez les broches 10 fois dans la plaque d’essai.

Éponger sur du papier devant la solution de nettoyage. Pour compter le nombre de nématodes de la collection, remettez d’abord la collection à nouveau en suspension, puis pipetez cinq microlitres de la solution à l’aide d’embouts à faible rétention sur une lame. Comptez le nombre de nématodes dans cinq microlitres à l’aide d’un microscope à dissection.

Ensuite, ajustez la concentration à deux vers par microlitre en utilisant de l’eau distillée stérile. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de l’échantillon à chaque puits des plaques de 96 puits avec une pipette multicanal et un bac. Enveloppez les assiettes avec une serviette en papier humide et placez-les dans une boîte.

Ensuite, ajoutez une serviette en papier humide supplémentaire pour stabiliser et assurer un mouvement minimal des plaques et fixez-les sur un tampon collant dans un incubateur à agitation de 20 degrés Celsius réglé à 200 tr / min. Observez les plaques le cinquième jour sous un microscope à dissection. Compter le nombre de D.dipsaci mobiles et totaux dans les témoins de solvants DMSO et les puits traités par des médicaments.

Si les vers sont immobiles, ajoutez deux microlitres d’hydroxyde de sodium à une molaire à une concentration finale de 40 millimolaires au puits pour stimuler le mouvement. Calculez la proportion de vers mobiles. Dans les écrans D.dipsaci, les puits qui ont produit de manière reproductible des vers mobiles à 0% sont classés comme des résultats forts.

Trois plaques de médicament différentes ont été examinées à une concentration de 60 micromolaires, où chaque plaque de médicament a trois répliques biologiques. Les trois plaques comprenaient 6 % des commandes contenant uniquement des solvants DMSO. De nombreuses plaques contenant des médicaments de la bibliothèque de petites molécules manquaient de molécule présentant une bioactivité observable contre D.dipsaci.

Certaines plaques avaient des hits entièrement reproductibles, tandis que d’autres contenant des nématicides caractérisés variaient dans leur activité. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne. Ici, le fluopyrame a montré une activité robuste dans le test.

Le fluopyrame a induit un effet dose-dépendant apparent sur la mobilité de D.dipsaci avec une EC50 de 9,3-micromolaires. Oxamyl n’a eu aucun effet significatif sur la mobilité jusqu’à une concentration de 120 micromolaires. Oxamyl n’a eu aucun effet significatif sur la mobilité jusqu’à une concentration de 120-micromolaires.

L’ajout d’hydroxyde de sodium a amélioré la sensibilité du test dans la détection des vers immobiles. 40 millimolaires d’hydroxyde de sodium ont été utilisés comme critère d’évaluation du test pour stimuler le mouvement chez les individus capables et, par conséquent, distinguer les vers au repos des vers malades. Ce protocole a permis d’identifier des composés dotés de nouveaux mécanismes d’action contre D.dipsaci et d’autres espèces.