Name: Cultiver et cribler le nématode parasite végétal Ditylenchus dipsaci (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez une méthode de culture et de criblage de Ditylenchus dipsaci pour identifier de nouveaux nématicides. Cette technique de criblage à moyen débit permet d'évaluer rapidement des milliers de composés chimiques pour protéger les cultures.

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Les auteurs remercient le Dr Qing Yu (Agriculture et Agroalimentaire Canada) pour avoir fourni la culture dipsaciique Ditylenchus et pour ses conseils sur les méthodes de culture; Dr Benjamin Mimee (Agriculture et Agroalimentaire Canada) et Nathalie Dauphinais (Agriculture et Agroalimentaire Canada) pour des conseils sur la culture in vitro de nématodes parasites des plantes; Dr Andrew Burns et Sean Harrington pour des suggestions utiles sur le projet et le manuscrit. JK est boursier diplômé Alexander Graham Bell Canada du CRSNG. PJR est soutenu par une subvention de projet des IRSC (313296). PJR est titulaire d’une chaire de recherche du Canada (niveau 1) en génétique chimique.

La souche G-137 de D. dipsaci utilisée pour le présent travail a été recueillie à partir de l’ail de la variété Fish Lake 4 dans le comté de Prince Edward et a été fournie par Agriculture et Agroalimentaire Canada. Si vous commencez une nouvelle culture, consultez Poirier et al. pour la méthodologie d’inoculation15.
1. Culture de D. dipsaci
<ol><li>Préparer les supports et les plaques après les travaux signalés précédemment15.<ol>
<li>Préparer 500 mL de matières nutritives (NA) avec 23 g/L de NA (voir tableau des matériaux) et de l’eau ultrapure. En utilisant la technique stérile, versez 25 mL de support NA autoclavé dans 20 boîtes de Petri jetables (100 mm de diamètre x 15 mm de profondeur). Laisser la gélose se solidifier à température ambiante (22 °C) avec le couvercle allumé pendant environ 2 h et réserver pour une utilisation ultérieure.</li>
		<li>Préparer 500 mL de milieu Gamborg B-5 (GA) contenant 3,2 g/L de milieu basal GA avec un minimum de matières organiques, 20 g/L de saccharose, 15 g/L de gélose et de l’eau distillée (voir tableau des matières). En utilisant la technique stérile, versez 50 mL de support GA autoclavé dans 10 boîtes de Petri jetables (100 mm de diamètre x 25 mm de profondeur). Laisser la gélose se solidifier à température ambiante (22 °C) avec le couvercle pendant environ 5 h et conserver à la verticale à température ambiante dans un sac stérile jusqu’au transfert de la germination. REMARQUE: Les plaques de média excédentaires sont fabriquées en cas de contamination.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer la stérilisation des semences selon une méthode modifiée à partir d’un travail précédent15.<ol>
<li>Autoclavez un bécher de 2 L avec une barre de brassage, 2 pinces, une boîte de Pétri en verre et 1 L d’eau distillée. Préparer 200 mL de solution d’EtOH à 95 % et 200 mL d’une solution d’eau de Javel commerciale à 15 %.</li>
		<li>Utilisez des graines de pois (voir tableau des matières). Versez 150 graines dans un bécher stérile de 2 L avec une barre d’agitation près d’une flamme de brûleur Bunsen sur un banc de laboratoire.</li>
		<li>Ajouter 200 mL d’EtOH à 95% aux graines dans le bécher, remuer vigoureusement sur la plaque d’agitation pendant 5 min, puis verser EtOH dans un récipient à déchets.</li>
		<li>Versez la solution d’eau de Javel dans le bécher pour immerger complètement les graines. Remuer vigoureusement sur une plaque à remuer pendant 20 min, puis verser de l’eau de Javel dans un récipient à déchets.</li>
		<li>Versez de l’eau distillée dans le bécher pour immerger les graines et remuez vigoureusement sur une plaque à remuer pendant 20 min. Répétez les lavages à l’eau trois fois, en versant de l’eau distillée après chaque lavage. Après le lavage final à l’eau, versez les graines stérilisées dans la boîte de Petri en verre.</li>
		<li>Pour vérifier la contamination, transférer 6 graines sur chaque plaque NA de 10 cm (préparée à l’étape 1.1.1) dans la hotte d’inondation laminaire à l’aide de pinces stérilisées. Disposez les graines autour de la circonférence de la plaque (les graines plus pulpeuses fonctionnent mieux). Envelopper les plaques individuellement dans un film d’emballage de laboratoire et incuber dans l’obscurité pendant 3 jours à 26 °C. REMARQUE: Le placage de plus de graines que nécessaire permettra une utilisation sélective de semences non contaminées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuez le transfert de germes en suivant l’étape ci-dessous.<ol>
<li>Dans une hotte à écoulement laminaire, utiliser des pinces stérilisées pour plaquer 2 graines non contaminées sur chaque plaque GA (préparées à l’étape 1.1.2). Enveloppez les assiettes individuellement dans un film d’emballage de laboratoire et incubez à température ambiante pendant 7 à 10 jours pour permettre aux graines de germer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer un élevage in vitro selon une méthode modifiée à partir d’un travail antérieur15.<ol>
<li>Préparer 50 mL de solution de saccharose à 20 g/L. Filtrer stériliser la solution de saccharose et réserver.</li>
		<li>Dans une hotte à écoulement laminaire, couper un morceau de gélose contenant du tissu racinaire (~2 cm3) à partir d’une plaque de culture existante. Pipette 500 μL de solution de saccharose sur une nouvelle plaque GA avec des plants de pois et placer le cube de gélose sur le saccharose. Enveloppez les plaques individuellement dans un film d’emballage de laboratoire et maintenez la culture dans une boîte recouverte de papier d’aluminium à température ambiante (~ 22 ° C).</li>
		<li>Nématodes de sous-culture sur des assiettes d’AG fraîches toutes les 8 à 9 semaines pour maintenir la culture. Les nématodes sont prêts à être extraits après environ 8 semaines.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extraction et collecte de D. dipsaci
<ol><li>Effectuez l’extraction de D. dipsaci en suivant les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Autoclavez un bécher de 50 mL, un entonnoir de 80 mm, 150 mL d’eau distillée et des filtres à café. Placez l’entonnoir dans le bécher et tapissez l’entonnoir avec un filtre à café stérile.</li>
		<li>Dans une hotte à écoulement laminaire, couper la gélose et le tissu racinaire en 1 cm3 à l’aide d’un scalpel stérile. Transférez les cubes d’agar dans l’entonnoir tapissé de filtre à café et versez lentement de l’eau distillée sur la gélose pour humidifier le filtre à café.</li>
		<li>Retirez l’entonnoir recouvert de filtre à café du bécher et remplissez le bécher d’eau distillée jusqu’à ce que le niveau d’eau ne touche que le fond du filtre une fois que l’entonnoir recouvert de filtre à café est remplacé.</li>
		<li>Couvrir l’entonnoir et le bécher recouverts de filtre à café avec du papier d’aluminium. Laisser reposer toute la nuit (16 h) sur la paillasse pour permettre aux vers de se déplacer à travers le filtre à café dans le bécher de collecte. REMARQUE: Une plaque de culture de nématodes est prête à être extraite lorsque des vers ont rampé dans la gélose lorsqu’ils sont examinés avec un microscope à dissection. En règle générale, une plaque est prête à être extraite 6 à 8 semaines après son inoculation initiale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuez la collecte de D. dipsaci. REMARQUE: Le lendemain, les vers D. dipsaci se seront installés au fond du bécher.<ol>
<li>Retirez l’entonnoir recouvert d’un filtre à café et aspirez les 40 mL d’eau supérieurs du bécher de collecte; assurez-vous de ne pas perturber les vers installés. À l’aide d’une pipette sérologique en plastique de 10 mL, recueillir le liquide restant dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. REMARQUE: Cette collection peut être utilisée directement dans les essais. Placer à 4 °C s’ils ne seront pas utilisés dans les 24 heures. Les vers peuvent être laissés pendant 3 jours à 4 °C sans impact visible sur la mobilité. Le retrait de l’entonnoir peut perturber les vers dans le bécher de collecte. Laissez-les s’installer au fond avant de les ramasser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Criblage in vitro de petites molécules
<ol><li>Préparez les plaques d’essai en suivant les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Versez de l’eau distillée autoclavée dans un bac stérile et, à l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 40 μL d’eau distillée de l’abreuvoir dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer l’outil d’épinglage et ajouter les produits chimiques<ol>
<li>Installez des plateaux d’épinglage (voir Table des matériaux) près d’une flamme de brûleur Bunsen sur un banc de laboratoire. Ajouter les éléments suivants aux plateaux d’épinglage successifs : 25 mL de solution de nettoyage des broches, 35 mL de DMSO à 50 % (dans l’eau), 45 mL d’eau distillée, 55 mL de 70 % d’EtOH et 65 mL d’EtOH à 95 %. Placez un morceau de papier buvard devant chaque bac</li>
		<li>Nettoyez l’outil d’épinglage en emersant les broches dans la solution de nettoyage et en déplaçant les broches de haut en bas trois fois (3x) dans la solution. Dans ce protocole, '3x' et '10x' sont définis comme le déplacement du pinner de haut en bas dans une solution trois ou dix fois, respectivement. Épongez les épingles sur le papier buvard. Répétez cette procédure une fois de plus.<ol>
<li>Ensuite, rincez les broches 3x dans de l’eau distillée, puis épongez les broches. Répétez la procédure une fois de plus.</li>
			<li>Enfin, rincez les broches 3x dans 95% EtOH, puis épongez les broches. Répétez une fois de plus. Allumez le pinner et laissez l’éthanol s’évaporer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ajoutez les produits chimiques des plaques de base de produits chimiques de 96 puits aux plaques d’essai en épinglant 3x dans la plaque chimique, puis en transférant les broches 10X dans la plaque d’essai. Éponger sur du papier devant la solution de nettoyage.</li>
		<li>Nettoyer l’outil d’épinglage entre les plaques en le lavant dans l’ordre suivant, en épongeant entre les deux sur du papier buvard: 3x dans 50% de DMSO (une fois), 3x dans de l’eau distillée (une fois), 3x dans 75% EtOH (une fois), 3x dans 95% EtOH (deux fois). Allumez le pinner et laissez l’éthanol s’évaporer.</li>
		<li>Répétez l’étape 3.2.2 lorsque tout l’épinglage est terminé. NOTE : Le dépistage a été effectué à une concentration finale de 60 μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajout de vers<ol>
<li>Comptez le nombre de nématodes de la collection en les remettant d’abord en suspension, puis en pipetant 5 μL à l’aide de pointes à faible rétention sur une lame pour observation. Compter le nombre de nématodes dans 5 μL à l’aide d’un microscope à dissection.<ol>
<li>Ajuster la concentration à 2 vers/μL en utilisant de l’eau distillée stérile. À l’aide d’une pipette multicanal et d’un bac, ajouter 10 μL (~ 20 vers) à chaque puits des plaques de 96 puits. REMARQUE : Environ 15 000 nématodes D. dipsaci seront collectés par plaque de culture à l’aide de la méthode de culture et de collecte décrite. Vingt vers sont utilisés par puits car le petit nombre facilite la visualisation et la comptabilisation claires des vers mobiles et immobiles.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Scellez les plaques dans un film d’emballage de laboratoire et enveloppez-les avec une serviette en papier humide. Placer dans la boîte et apposer sur un tampon collant dans un incubateur à agitation à 20 °C réglé à 200 tr/ min. Assurez-vous que les plaques sont stabilisées dans la boîte en ajoutant une serviette en papier humide supplémentaire pour assurer un mouvement minimal des plaques.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Collecte et analyse des données
<ol><li>Observez les plaques le jour 5 sous un microscope à dissection. Compter le nombre de D. dipsaci mobiles et le nombre total de D. dipsaci dans les puits de contrôle des solvants DMSO et les puits traités par des médicaments.<ol>
<li>Si les vers sont relativement immobiles, ajouter 2 μL de 1 M NaOH à une concentration finale de 40 mM dans le puits pour stimuler le mouvement19,20. REMARQUE: Après avoir ajouté NaOH, les vers se déplaceront instantanément et devront être visualisés dans les 5 minutes. Le nombre de vers mobiles et le nombre total de vers seront utilisés pour calculer la proportion de vers mobiles. La durée du test peut changer en fonction de l’objectif de l’écran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculez la proportion de vers mobiles. Dans les écrans D. dipsaci , les puits qui ont produit de manière reproductible 0% de vers mobiles sont classés comme des coups forts. REMARQUE: L’exposition prolongée des plaques sur la scène des microscopes à dissection est évitée car la source lumineuse peut chauffer les plaques et induire des effets variables sur le bioessai.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Étapes critiques Malgré la simplicité du protocole, il y a des étapes critiques dans le protocole qui méritent une attention supplémentaire pour maximiser les chances de succès. Tout d’abord, le surblanchiment des graines peut perturber leur croissance. Par conséquent, il est essentiel de limiter le temps des graines dans la solution de blanchiment à 20 minutes ou moins. Deuxièmement, comme l’ont déjà noté Storelli et coll., la santé apparente des nématodes diminue avec le temps lorsqu’ils sont entreposés à 4 °C16. L’utilisation des nématodes peu de temps après leur collecte donne une confiance supplémentaire que des conditions de dépistage optimales peuvent être atteintes. Si un stockage à plus long terme est nécessaire, assurez-vous que le couvercle du tube n’est pas hermétique pour permettre l’échange d’oxygène. Troisièmement, s’assurer que les pois poussent sur les plaques NA pendant le temps suggéré permet à l’expérimentateur de juger quelles graines sont contaminées. Quatrièmement, la prolifération des pois sur les plaques d’AG avant d’ajouter les nématodes affaiblira l’infection et réduira le rendement des nématodes. Enfin, de nombreux facteurs difficiles à contrôler peuvent avoir une incidence sur les résultats du dépistage. Par conséquent, il est essentiel d’effectuer plusieurs écrans de réplication indépendants à différents jours et idéalement avec des PPN collectés à partir de différentes plaques de culture pour assurer la reproductibilité des résultats.
Limites de la méthode Une limitation du protocole est qu’il ne parvient pas à synchroniser le stade de développement des vers collectés, qui vont des juvéniles aux adultes. Par conséquent, les coups forts révélés par n’importe quel écran sont probablement efficaces à plusieurs étapes. Cependant, le protocole augmente le risque de négliger les résultats efficaces spécifiques à la scène. Une deuxième considération est que le dépistage in vitro devrait être considéré comme la première étape d’un pipeline de découverte de nématicides; les essais à base de sol sont un excellent ajout à un pipeline pour tester la translatabilité des coups.
Signification et application du protocole Les protocoles décrits ici sont simples et faciles à reproduire. De plus, ce protocole a été appliqué avec succès à d’autres PPN en laboratoire, y compris Pratylenchus penetrans, en n’apportant que de légères modifications. L’élaboration de nouvelles mesures de contrôle sûres des PPN est essentielle pour assurer la sécurité alimentaire mondiale. Cela est particulièrement vrai pour des espèces comme D. dipsaci qui sont généralement tolérantes à une grande variété de nématicides chimiques actuellement acceptables13,14. Par conséquent, les protocoles décrits ici ont le potentiel d’apporter une contribution importante à la santé humaine à l’échelle mondiale.

On estime que les nématodes parasites des plantes (PPN) sont responsables de la perte de 12,3% de la production alimentaire mondiale et causent environ 157 milliards de dollars de dommages par an 1,2,3. Malheureusement, la capacité de contrôler les PPN diminue parce que les nématicides chimiques efficaces ont été interdits ou sont confrontés à des restrictions croissantes en raison de préoccupations en matière de sécurité humaine et d’environnement. Cela est principalement dû à la faible sélectivité des nématodes des générations précédentes de pesticides4. Au cours des 25 dernières années, six nouveaux nématicides chimiques ont été mis à l’essai ou introduits sur le marché5. L’un d’entre eux a déjà été interdit en Europe, et un autre a été abandonné alors qu’il faisait l’objet d’une enquête pour son impact sur la chaleur humaine 6,7. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouveaux nématicides qui sont très sélectifs pour les PPN.
Le nématode de la tige et du bulbe, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) est un PPN4. D. dipsaci qui a un impact économique infecte près de 500 espèces végétales à travers 30 races biologiques et cible certaines des cultures les plus importantes sur le plan agricole telles que le seigle, l’avoine, l’ail, l’oignon et le poireau 8,9. Par exemple, D. dipsaci a récemment détruit des champs d’ail en Ontario et au Québec, entraînant des pertes allant jusqu’à 90 %10,11. Sa répartition géographique est presque omniprésente et comprend les Amériques (y compris la Californie et la Floride), l’Europe, une grande partie de l’Asie (y compris la Chine) et l’Océanie9. D. dipsaci est un endoparasite migrateur qui pénètre dans les stomates sur les feuilles ou les plaies et les lenticelles où ils libèrent des enzymes pour décomposer la paroi cellulaire12. Aggravant l’impact de D. dipsaci sur les cultures, les dommages causés par le PPN rendent la plante sensible à une infection secondaire11. Malheureusement, D. dipsaci présente des niveaux de tolérance élevés aux nématicides actuels par rapport à d’autres souches de nématodes13,14.
Ce protocole décrit la culture de D. dipsaci et son utilisation dans des criblages à grande échelle pour les nématicides candidats à petites molécules. En bref, les populations de D. dipsaci sont maintenues et étendues sur des plants de pois cultivés dans des milieux stériles de Gamborg B-5 (GA)15. Avant de faire pousser des germes de graines sur un milieu GA, les graines doivent être stérilisées par une série de lavages et plaquées sur une gélose nutritive (NA) pour vérifier la contamination. La stérilisation des semences est essentielle pour détecter les contaminants bactériens et fongiques qui peuvent être présents. Les graines non contaminées sont ensuite transférées dans des plaques d’AG, où les germes de graines pousseront en préparation de l’infection. Les plaques GA contenant des germes de graines sont infectées par des nématodes d’une plaque de culture précédente en transférant un morceau de gélose contenant du tissu racinaire aux plaques fraîches. Après 6 à 8 semaines, les nématodes sont extraits du milieu GA et sont filtrés à travers un entonnoir doublé de filtre à café dans un bécher de collection. Les nématodes peuvent être utilisés dans divers essais biologiques une fois qu’un nombre approprié a été collecté. La technique décrite dans ce protocole génère environ 15 000 D. dipsaci par plaque de culture. Des protocoles alternatifs pour cultiver D. dipsaci ont été publiés 16,17.
Un test de criblage in vitro de petites molécules basé sur des travaux antérieurs18 est également décrit ici. En tant qu’indicateur de la santé des vers, la mobilité de 20 nématodes par puits est examinée après 5 jours d’exposition aux petites molécules. Pour mieux visualiser la mobilité des vers, NaOH est ajouté pour augmenter le mouvement des vers vivants19,20. Ce protocole permet le criblage à débit moyen et fournit des données précieuses pour évaluer le potentiel nématicidal des petites molécules. Si une technique de collecte de nématodes différente est utilisée16,17, la méthodologie de criblage des petites molécules décrite ici peut néanmoins être mise en œuvre.

<table><tbody><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>2 pinces</td><td>Almedic</td><td>7747-A10-108</td><td></td></tr><tr><td>Bécher 2L</td><td>Pyrex</td><td>CLS10002L</td><td></td></tr><tr><td>bécher de 50mL</td><td>Pyrex</td><td>CLS100050</td><td></td></tr><tr><td>plaque de puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>feuille d’aluminium</td><td>Alcan Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gélose bactériologique</td><td>BioShop</td><td>AGR001.5</td><td></td></tr><tr><td>filtre à café</td><td>Sans nom marque</td><td>716</td><td></td></tr><tr><td>eau de Javel commerciale 6 %</td><td>Lavo Pro 6</td><td>DIN102358107</td><td></td></tr><tr><td>boîtes de Pétri jetables (10cm x 1.5cm)</td>Boîtes de Pétri <td>jetables FB0875712</td><td></td> <td>Fisherbrand</td></tr><tr><td>(10cm x 2.5cm)</td><td></td>Lunette de dissection Z358762 <td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>Leica MZ75</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Entonnoir</td><td>VWR</td><td>414004-270</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5893-10L</td><td></td></tr><tr><td>boîte de Pétri en verre</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>lame en verre</td><td>MAGNA</td><td>60-1200</td><td></td></tr><tr><td>Papier buvard non pelucheux</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 522-100</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette à faible rétention (200uL)</td><td>LABFORCE</td><td>1159M44</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanal</td><td>Eppendorf research plus</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>gélose nutritive</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70148-100G</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>graines de pois</td><td>Ontario Seed Company</td><td>D-1995-250G</td><td></td></tr><tr><td>solutions de nettoyage des broches</td><td>V& P Scientific</td><td>VP110A</td><td></td></tr><tr><td>pinner</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381N</td><td></td></tr><tr><td>plateaux de rinçage à pinner</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 421</td><td></td></tr><tr><td>réservoir de réactifs avec couvercle pour pipettes multicanaux</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR703459</td><td></td></tr><tr><td>incubateur à agitation</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>I26</td><td></td></tr><tr><td>lame chirurgicale stérile</td><td>MAGNA</td><td>sb21-100-a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>2109 - 1451359</td><td></td></tr><tr><td>saccharose</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr></tbody></table>

cultiver et cribler le nématode parasite végétal ditylenchus dipsaci

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

Les nématodes parasites des plantes (PPN) détruisent plus de 12% des cultures vivrières mondiales chaque année, ce qui équivaut à environ 157 milliards de dollars (USD) perdus chaque année. Avec une population mondiale croissante et des terres arables limitées, le contrôle de l’infestation par les PPN est essentiel à la production alimentaire. Le défi de la maximisation des rendements des cultures est aggravé par les restrictions croissantes sur les pesticides efficaces en raison d’un manque de sélectivité des nématodes. Par conséquent, le développement de nématicides chimiques nouveaux et sûrs est vital pour la sécurité alimentaire. Dans ce protocole, la culture et la collection de l’espèce PPN Ditylenchus dipsaci sont démontrées. D. dipsaci est à la fois économiquement dommageable et relativement résistant à la plupart des nématicides modernes. Les travaux actuels expliquent également comment utiliser ces nématodes dans les criblages de nouvelles nématicides à petites molécules et rendent compte des méthodologies de collecte et d’analyse des données. Le pipeline démontré offre un débit de milliers de composés par semaine et peut être facilement adapté pour une utilisation avec d’autres espèces de PPN telles que Pratylenchus penetrans. Les techniques décrites ici peuvent être utilisées pour découvrir de nouveaux nématicides, qui peuvent, à leur tour, être développés en produits commerciaux hautement sélectifs qui combattent en toute sécurité les PPN pour aider à nourrir un monde de plus en plus affamé.

Des répliques indépendantes révèlent des résultats reproductibles Pour illustrer la variation attendue entre les écrans répliqués, les moyennes et la variation de la mobilité de l’échantillon sont tracées à partir de trois plaques représentatives d’un écran récent (Figure 1). Trois répliques de l’écran ont été réalisées sur trois jours différents. Les trois plaques ont des témoins négatifs (solvant uniquement) (barres plus sombres), et les échantillons dans l’ensemble contenaient des nématicides établis. Les composés restants proviennent d’une bibliothèque personnalisée en cours de caractérisation dans le laboratoire Roy. Comparé à des criblages similaires effectués avec C. elegans avec les mêmes molécules (SC, JK, PJR, résultats non publiés), le taux de réussite avec D. dipsaci est significativement plus faible et de nombreuses plaques de médicaments ne présentent aucune activité (Figure 1A). Certaines plaques ont des impacts entièrement reproductibles (Figure 1B,C), tandis que d’autres varient en activité (Figure 1C). Par rapport aux autres espèces examinées (non représentées), D. dipsaci montre moins de variabilité dans sa réponse aux composés. Quoi qu’il en soit, les répliques sont considérées comme nécessaires dans l’identification des résultats reproductibles.
Les nématicides varient dans leur capacité à immobiliser Ditylenchus dipsaci Sur les sept nématicides caractérisés testés contre D. dipsaci, seul le fluopyrame présente une activité robuste dans le dosage décrit ici (figure 1C). Ceci est cohérent avec les travaux antérieurs montrant que D. dipsaci est tolérant aux nématicides13,14. Le fluopyrame inhibe le complexe II de la chaîne de transport d’électrons de manière sélective des nématodes et est un nématicide commercial utilisé pour contrôler une variété de PPN, y compris Rotylenchulus reniformis et Meloidogyne incognita 4,21,22. Le fluopyrame et l’un des nématicides qui manquaient d’activité à la concentration testée (Oxamyl)23 ont été étudiés plus en détail par une analyse dose-réponse avec D. dipsaci. Le fluopyrame induit un effet dose-dépendant apparent sur la mobilité de D. dipsaci avec une CE50 de 9,3 μM (avec un intervalle de confiance de 95 % compris entre 8,2 et 10,5 μM) (Figure 2A,B). Ce résultat est attendu sur la base des résultats in vitro publiés par Storelli et al., 202013. L’oxamyle n’a pas d’effet significatif sur la mobilité jusqu’à une concentration de 120 μM (p = 0,3632, test t non apparié) (Figure 2C,D).
L’hydroxyde de sodium améliore la sensibilité aux tests Contrairement à l’activité de nage quasi continue de C. elegans en culture liquide18, les animaux de D. dipsaci sont considérablement moins mobiles. Ceci n’est pas rare chez les nématodes parasites en culture16. Pour aider à distinguer les vers « au repos » des vers malades, 40 mM de NaOH sont utilisés au stade du test pour stimuler le mouvement chez les personnes capables (Figure 3)19,20. Cette technique permet d’identifier clairement les petites molécules qui immobilisent les vers, étant donné que tous les vers dans les puits de contrôle négatif se déplacent et produisent un fond exceptionnellement faible de faux positifs à l’écran.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig01v2.jpg"> Figure 1 : Exemples de sortie d’écran. Trois répliques biologiques (cercles ouverts) avec D. dipsaci ont été réalisées contre les petites molécules (60 μM) dans chacune des trois plaques montrées. Les trois plaques ont 0,6% de contrôles de solvant DMSO uniquement (barres plus sombres). Sauf indication contraire avec des témoins de solvants ou des nématicides connus, les puits des trois plaques contiennent des composés semblables à des médicaments relativement peu caractérisés achetés auprès de vendeurs (voir Burns et coll., 2015)18. (A) Une plaque de puits 96 de la bibliothèque de petites molécules n’a aucune molécule ayant une bioactivité observable contre D. dipsaci. (B) Une plaque de puits 96 de la bibliothèque de petites molécules a une seule molécule qui perturbe de manière reproductible la mobilité de D. dipsaci. (C) Plaque médicamenteuse de 96 puits contenant les nématicides caractérisés fluopyram (fluo), iprodione (ipro), abamectine (abam), fluensulfone (flue), tioxazafen (tiox), oxamyl (oxam) et wact-11. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple de résultats positifs et négatifs à l’aide d’un test de mobilité. (A) Exemples de phénotypes terminaux après l’exposition de D. dipsaci à des concentrations croissantes de fluopyrame après 5 jours avant l’ajout de NaOH. (B) Une analyse dose-réponse du mouvement de D. dipsaci après 5 jours d’exposition aux concentrations indiquées de fluopyrame. (C,D) Le même que A,B, sauf pour l’oxamyl. Chaque graphique montre les essais effectués sur deux jours distincts avec trois répétitions chaque jour. L’axe des y de chaque graphique indique la fraction mobile des vers dans chaque puits calculée comme le nombre d’animaux se déplaçant par rapport au nombre total d’animaux dans le puits. Les barres d’erreur sur les deux graphiques représentent l’erreur-type de la moyenne. La barre d’échelle représente 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig03.jpg"> Figure 3 : Mobilité de D. dipsaci après ajout de 40 mM de NaOH. L’effet de l’addition de NaOH aux échantillons de D. dipsaci en présence de solvant témoin (A), de tioxazafène (B) ou de fluopyrame (C) après 5 jours de co-incubation. La barre d’échelle représente 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>

Le présent protocole décrit une méthode fiable et simple pour la culture, la collecte et le dépistage de la dipsacie Ditylenchus.

Cultiver et cribler le nématode parasite végétal Ditylenchus dipsaci

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With ...

Ce protocole permet la découverte de nouveaux nématicides pour lutter contre la dipsacie de Ditylenchus par la technique de culture et les criblages chimiques à débit moyen. La simplicité de cette technique permet de cribler des milliers de composés par semaine pour identifier les composés à potentiel nématicidal. Cette technique peut identifier de nouveaux composés pour tuer les nématodes parasites des plantes des cultures et, par conséquent, augmenter l’approvisionnement alimentaire mondial.Pour commencer, préparez 500 millilitres de gélose nutritive, ou NA, avec 23 grammes par litre de NA et de l’eau ultra-pure. En utilisant la technique stérile, versez 25 millilitres de support NA autoclavé dans 20 boîtes de Petri jetables de 100 millimètres de diamètre et de 15 millimètres de profondeur. Préparez 500 millilitres de Gamborg B5, ou GA media, contenant 3,2 grammes par litre de milieu basal GA avec un minimum de matières organiques, 20 grammes par litre de saccharose, 15 grammes par litre de gélose et de l’eau distillée.En utilisant une technique stérile, versez 50 millilitres de support GA autoclavé dans 10 boîtes de Petri jetables. Pour effectuer la stérilisation des graines, versez 150 graines de pois dans un bécher stérile de deux litres avec une barre d’agitation près d’une flamme de brûleur Bunsen sur un banc de laboratoire. Ajouter 200 millilitres d’éthanol à 95% aux graines et remuer vigoureusement sur la plaque de remuage pendant cinq minutes.Ensuite, versez l’éthanol dans un conteneur à déchets. Versez la solution d’eau de Javel dans le bécher pour immerger complètement les graines. Remuer vigoureusement sur une assiette à remuer pendant 20 minutes.Ensuite, versez l’eau de Javel dans un conteneur à déchets. Versez de l’eau distillée dans le bécher pour immerger les graines et remuez vigoureusement sur une plaque à remuer pendant 20 minutes. Après le lavage final à l’eau, versez les graines stérilisées dans la boîte de Petri en verre.Pour vérifier la contamination, transférez six graines sur chaque plaque NA de 10 centimètres dans la hotte à écoulement laminaire à l’aide d’une pince stérilisée. Disposez les graines autour de la circonférence de la plaque. Enveloppez les assiettes individuellement dans un film d’emballage de laboratoire et incubez-les dans l’obscurité pendant trois jours à 26 degrés Celsius.Dans une hotte à écoulement laminaire, plaquer deux graines non contaminées sur chaque plaque GA avec des pinces stérilisées. Incuber à température ambiante pendant 7 à 10 jours pour permettre aux graines de germer. Préparez 50 millilitres de solution de saccharose de 20 grammes par litre.Filtrer stériliser la solution de saccharose et réserver. Dans une hotte à écoulement laminaire, coupez un morceau de gélose contenant du tissu racinaire dans une plaque de culture existante. Pipette 500 microlitres de solution de saccharose sur une nouvelle plaque GA avec des plants de pois et placer un cube de gélose sur le saccharose.Maintenez la culture dans une boîte recouverte de papier d’aluminium à température ambiante. Pour maintenir la culture, sous-cultiver les nématodes sur des assiettes d’AG fraîches toutes les huit à neuf semaines. Les nématodes sont prêts à être extraits après environ huit semaines.Dans une hotte à écoulement laminaire, coupez la gélose et le tissu racinaire en cubes d’un centimètre avec un scalpel stérile. Transférez les cubes d’agar dans l’entonnoir tapissé de filtre à café et versez lentement de l’eau distillée sur la gélose pour humidifier le filtre à café. Retirez l’entonnoir recouvert de filtre à café du bécher et remplissez le bécher d’eau distillée jusqu’à ce que le niveau d’eau ne touche que le fond du filtre une fois que l’entonnoir recouvert de filtre à café est remplacé.Couvrir l’entonnoir et le bécher recouverts de filtre à café avec du papier d’aluminium. Pour recueillir les vers, retirez l’entonnoir recouvert de filtre à café et aspirez les 40 millilitres d’eau supérieurs du bécher de collecte, sans perturber les vers installés. Recueillir le liquide restant dans un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres avec une pipette sérologique en plastique de 10 millilitres.Pour préparer les plaques d’essai, versez de l’eau distillée en autoclave dans un bac stérile et distribuez 40 microlitres d’eau distillée de l’abreuvoir dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits avec une pipette multicanal. Ajoutez les produits chimiques des plaques de base chimiques à 96 puits aux plaques d’essai en épinglant trois fois dans la plaque chimique. Ensuite, transférez les broches 10 fois dans la plaque d’essai.Éponger sur du papier devant la solution de nettoyage. Pour compter le nombre de nématodes de la collection, remettez d’abord la collection à nouveau en suspension, puis pipetez cinq microlitres de la solution à l’aide d’embouts à faible rétention sur une lame. Comptez le nombre de nématodes dans cinq microlitres à l’aide d’un microscope à dissection.Ensuite, ajustez la concentration à deux vers par microlitre en utilisant de l’eau distillée stérile. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de l’échantillon à chaque puits des plaques de 96 puits avec une pipette multicanal et un bac. Enveloppez les assiettes avec une serviette en papier humide et placez-les dans une boîte.Ensuite, ajoutez une serviette en papier humide supplémentaire pour stabiliser et assurer un mouvement minimal des plaques et fixez-les sur un tampon collant dans un incubateur à agitation de 20 degrés Celsius réglé à 200 tr / min. Observez les plaques le cinquième jour sous un microscope à dissection. Compter le nombre de D.dipsaci mobiles et totaux dans les témoins de solvants DMSO et les puits traités par des médicaments.Si les vers sont immobiles, ajoutez deux microlitres d’hydroxyde de sodium à une molaire à une concentration finale de 40 millimolaires au puits pour stimuler le mouvement. Calculez la proportion de vers mobiles. Dans les écrans D.dipsaci, les puits qui ont produit de manière reproductible des vers mobiles à 0% sont classés comme des résultats forts.Trois plaques de médicament différentes ont été examinées à une concentration de 60 micromolaires, où chaque plaque de médicament a trois répliques biologiques. Les trois plaques comprenaient 6 % des commandes contenant uniquement des solvants DMSO. De nombreuses plaques contenant des médicaments de la bibliothèque de petites molécules manquaient de molécule présentant une bioactivité observable contre D.dipsaci.Certaines plaques avaient des hits entièrement reproductibles, tandis que d’autres contenant des nématicides caractérisés variaient dans leur activité. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne. Ici, le fluopyrame a montré une activité robuste dans le test.Le fluopyrame a induit un effet dose-dépendant apparent sur la mobilité de D.dipsaci avec une EC50 de 9,3-micromolaires. Oxamyl n’a eu aucun effet significatif sur la mobilité jusqu’à une concentration de 120 micromolaires. Oxamyl n’a eu aucun effet significatif sur la mobilité jusqu’à une concentration de 120-micromolaires.L’ajout d’hydroxyde de sodium a amélioré la sensibilité du test dans la détection des vers immobiles. 40 millimolaires d’hydroxyde de sodium ont été utilisés comme critère d’évaluation du test pour stimuler le mouvement chez les individus capables et, par conséquent, distinguer les vers au repos des vers malades. Ce protocole a permis d’identifier des composés dotés de nouveaux mécanismes d’action contre D.dipsaci et d’autres espèces.

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Cultiver et cribler le nématode parasite végétal Ditylenchus dipsaci

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