Name: Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Découvrez l'imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs pour l'histologie en temps réel du cerveau de souris. Cette méthode sans marquage permet un diagnostic tissulaire rapide sans traitement ni coloration.

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Cette étude a été soutenue par NIH R35 GM133435 à D.F.

<ol><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li>
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<li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li>
<li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Le schéma d’imagerie SRS bicolore présenté dans ce protocole repose sur la mise en œuvre correcte de l’imagerie SRS monochrome. Dans l’imagerie SRS monochrome, les étapes critiques sont l’alignement spatial, l’alignement temporel, la profondeur de modulation et le déphasage. La combinaison spatiale des deux faisceaux est réalisée par un miroir dichroïque. Plusieurs rétroviseurs de direction sont utilisés pour un réglage fin lors de l’envoi des faisceaux au miroir dichroïque. Une fois les faisceaux combinés avec le miroir...

Les diagnostics tissulaires traditionnels reposent sur des protocoles de coloration suivis d’un examen au microscope optique. Une méthode de coloration courante utilisée par les pathologistes est la coloration H & E: l’hématoxyline colore les noyaux cellulaires d’un bleu violacé, et l’éosine tache la matrice extracellulaire et le cytoplasme en rose. Cette simple coloration reste la référence en pathologie pour de nombreuses tâches de diagnostic tissulaire, en particulier le diagnostic du cancer. Cependant, l’histopathologie H & E, en particulier la technique de sectionnement congelé utilisée dans un cadre peropératoire, a encore des limites. La procédure de coloration est un processus laborieux impliquant l’incorporation, le sectionnement, la fixation et la coloration des tissus1. Le délai d’exécution typique est de 20 minutes ou plus. Effectuer des H & E pendant le sectionnement congelé peut parfois devenir plus difficile lorsque plusieurs sections sont traitées à la fois en raison de la nécessité d’évaluer les caractéristiques cellulaires ou les modèles de croissance en 3D pour l’évaluation des marges. De plus, les techniques histologiques peropératoires nécessitent des techniciens et des cliniciens qualifiés. La limitation du nombre de pathologistes certifiés par le conseil d’administration dans de nombreux hôpitaux est une contrainte pour la consultation peropératoire dans de nombreux cas. Ces limitations peuvent être atténuées avec les intérêts de développement rapide dans la pathologie numérique et le diagnostic basé sur l’intelligence artificielle2. Cependant, les résultats de coloration H&E sont variables, en fonction de l’expérience du technicien, ce qui présente des défis supplémentaires pour le diagnostic informatisé2.
Ces défis peuvent potentiellement être relevés avec des techniques d’imagerie optique sans étiquette. L’une de ces techniques est la microscopie SRS. SRS utilise des lasers pulsés synchronisés – pompe et Stokes – pour exciter les vibrations moléculaires avec un rendement élevé3. Des rapports récents ont démontré que l’imagerie SRS des protéines et des lipides peut générer des images équivalentes H & E (également connues sous le nom d’histologie Raman stimulée ou SRH) avec des tissus frais intacts, ce qui contourne la nécessité de tout traitement tissulaire, raccourcit considérablement le temps nécessaire au diagnostic et a été adapté en peropératoire4. De plus, l’imagerie SRS peut fournir des images 3D, ce qui offre des informations supplémentaires pour le diagnostic lorsque les images 2D sont insuffisantes5. La SSR est impartiale et génère des images numériques qui sont facilement disponibles pour le diagnostic informatisé. Il apparaît rapidement comme une solution possible pour le diagnostic peropératoire du cancer et l’analyse de la marge tumorale, en particulier dans le cancer du cerveau 6,7,8. Plus récemment, l’imagerie SRS des changements chimiques des tissus a également été suggérée pour fournir des informations diagnostiques utiles qui peuvent aider davantage les cliniciens à stratifier différents types de cancer oustades 9.
Malgré son énorme potentiel dans les applications de diagnostic tissulaire, l’imagerie SRS est principalement limitée aux laboratoires universitaires spécialisés en optique en raison de la complexité associée à la plate-forme d’imagerie, qui comprend des lasers ultrarapides, le microscope à balayage laser et une électronique de détection sophistiquée. Ce protocole fournit un flux de travail détaillé pour démontrer l’utilisation d’une source laser femtoseconde commune pour l’imagerie SRS bicolore en temps réel et la génération d’images pseudo-H & E à partir de tissus cérébraux de souris. Le protocole couvrira les procédures suivantes :
Optimisation de l’alignement et du gazouillis La plupart des schémas d’imagerie SRS utilisent des lasers picosecondes ou femtosecondes comme source d’excitation. Avec les lasers femtosecondes, la bande passante du laser est beaucoup plus grande que la largeur de ligne Raman. Pour surmonter cette limitation, une approche de focalisation spectrale est utilisée pour gazouiller les lasers femtosecondes à une échelle de temps picoseconde afin d’obtenir une résolution spectrale étroitede 10. La résolution spectrale optimale n’est obtenue que lorsque le gazouillis temporel (également connu sous le nom de dispersion de retard de groupe ou simplement dispersion) est correctement adapté à la pompe et aux lasers Stokes. La procédure d’alignement et les étapes nécessaires pour optimiser la dispersion des faisceaux laser à l’aide de tiges de verre hautement dispersives sont démontrées ici.
Étalonnage de fréquence Un avantage de la focalisation spectrale SRS est que l’excitation Raman peut être rapidement réglée en modifiant le délai entre la pompe et les lasers Stokes. Un tel réglage permet une imagerie rapide et une acquisition spectrale fiable par rapport au réglage des longueurs d’onde laser. Cependant, la relation linéaire entre la fréquence d’excitation et le délai nécessite un étalonnage externe. Des solvants organiques avec des pics Raman connus sont utilisés pour calibrer la fréquence Raman pour la focalisation spectrale SRS.
Imagerie bicolore en temps réel Il est important d’augmenter la vitesse d’imagerie dans les applications de diagnostic tissulaire afin de raccourcir le temps nécessaire à l’analyse des échantillons de tissus volumineux. L’imagerie SRS bicolore simultanée des lipides et des protéines évite d’avoir à régler le laser ou le délai, ce qui augmente la vitesse d’imagerie de plus de deux fois. Ceci est réalisé en utilisant une nouvelle technique de modulation orthogonale et une démodulation à double canal avec un amplificateur de verrouillage11. Cet article décrit le protocole de modulation orthogonale et d’acquisition d’images à double canal.
Imagerie SRS en mode épi La majorité des images SRS montrées à ce jour sont effectuées en mode de transmission. L’imagerie en mode épi détecte les photons rétrodiffusés du tissu12. Pour les applications de pathologie, les échantillons chirurgicaux peuvent être assez grands. Pour l’imagerie en mode de transmission, le sectionnement des tissus est souvent nécessaire, ce qui nécessite trop de temps. En revanche, l’imagerie en mode épi peut fonctionner avec des échantillons chirurgicaux intacts. Étant donné que le même objectif est utilisé pour collecter la lumière rétrodiffusée, il n’est pas non plus nécessaire d’aligner un condensateur à grande ouverture numérique requis pour l’imagerie de transmission. Le mode épi est également la seule option lorsque la section des tissus est difficile, comme avec les os. Auparavant, nous avons démontré que pour les tissus cérébraux, l’imagerie en mode épi offre une qualité d’imagerie supérieure pour l’épaisseur des tissus > 2 mm13. Ce protocole utilise un séparateur de faisceau polarisant (PBS) pour collecter les photons diffusés dépolarisés par les tissus. Il est possible de collecter plus de photons avec un détecteur annulaire au détriment de la complexité de l’assemblage personnalisé du détecteur12. L’approche PBS est plus simple à mettre en œuvre (similaire à la fluorescence), la photodiode standard étant déjà utilisée pour la détection du mode de transmission.
Génération d’images Pseudo-H&E Une fois les images SRS bicolores collectées, elles peuvent être recolorées pour simuler la coloration H&E. Cet article démontre la procédure de conversion des images SRS lipidiques et protéiques en images SRS pseudo-H&E pour des applications de pathologie. Le protocole expérimental détaille les étapes critiques nécessaires pour générer des images SRS de haute qualité. La procédure présentée ici n’est pas seulement applicable au diagnostic tissulaire, mais peut également être adaptée à de nombreuses autres applications d’imagerie SRS hyperspectrale telles que l’imagerie médicamenteuse et l’imagerie métabolique14,15.
Configuration système générale requise Le système laser pour ce protocole doit être capable de produire 2 faisceaux laser femtosecondes synchronisés. Les systèmes sont idéalement dotés d’un oscillateur paramétrique optique (OPO) pour le réglage de la longueur d’onde de l’un des faisceaux laser. La configuration de ce protocole utilise un système laser commercial Insight DS+ qui produit deux lasers (un faisceau fixe à 1 040 nm et un faisceau accordable basé sur OPO, allant de 680 à 1 300 nm) avec un taux de répétition de 80 MHz. Les microscopes à balayage laser, qu’ils proviennent de grands fabricants de microscopes ou fabriqués à la maison, peuvent être utilisés pour l’imagerie SRS. Le microscope utilisé est un microscope à balayage laser vertical construit sur un cadre de microscope vertical commercial. Une paire de miroirs galvo de 5 mm est utilisée pour scanner le faisceau laser. Pour les utilisateurs qui choisissent d’adopter un microscope à balayage laser maison, reportez-vous à un protocole publié précédemment pour la construction d’un microscope à balayage laser16.

<table><tbody><tr><td>Lentille achromatique 100 mm</td><td>THORLABS</td><td>AC254-100-B</td><td>Large bande, 650 - 1 050 nm, distance focale de l’objectif achromatique, 100 mm</td></tr><tr><td>Filtre passe-bande 20 MHz</td><td>Minicircuits</td><td>BBP-21.4+</td><td>Filtre passe-bande LC regroupé, 19,2 - 23,6 MHz, 50 & Omega ;</td></tr><tr><td>Lentille achromatique 200 mm</td><td>THORLABS</td><td>AC254-200-B</td><td>Large bande, 650 - 1 050 nm, distance focale de la lentille achromatique, 200 mm</td></tr><tr><td>Demi-plaque d’onde achromatique</td> Union <td>Optic</td><td>WPA2210-650-1100-M25.4 Demi-plaque</td><td>d’onde large bande</td></tr><tr><td>Quart d’onde achromatique</td> Union <td>Optic</td><td>WPA4210-650-1100-M25.4</td><td>Échantillonneur de faisceau quart d’onde large bande</td></tr><tr><td></td><td>THORLABS</td><td>BSN11</td><td>10:90 </td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>THORLABS</td><td>DMSP1000</td><td>D’autres dichroïques avec une longueur d’onde centrale d’environ 1 000 nm peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxyde)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>Solvant pour l’étalonnage du décalage Raman. D’autres solvants avec des pics Raman connus peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Modulateur d’amplitude électro-optique</td><td>THORLABS</td><td>EO-AM-NR-C1</td><td>Deux EOM sont nécessaires pour la modulation orthogonale et l’imagerie à double canal. La version résonante est recommandée afin d’utiliser une tension d’entraînement plus faible.</td></tr><tr><td>Faux H& E Staining Script</td><td>Matlab</td><td></td><td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td></tr><tr><td>Fanout Buffer</td><td>PRL-414B</td><td>Pulse Research Lab</td><td>Buffer 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, pour générer la fréquence d’entraînement EOM et la référence à la</td></tr><tr><td>photodiode rapide</td> verrouillable <td>Détecteur THORLABS</td><td>DET10A2</td><td>Si, 1 ns</td></tr><tr><td>Rise Time Frequency Divider</td><td>PRL-220A</td><td>Pulse Research Lab</td><td>Diviseur TTL Freq. (f/2, f/4, f/8, f/16), pour générer 20 MHz à partir de la sortie laser.</td></tr><tr><td>Tiges de verre hautement dispersives Union</td><td>Optic</td><td>CYLROD01</td><td>Haute dispersion H-ZF52A Lentille à tige 120 mm, SF11 Lentille à tige 100 mm</td></tr><tr><td>Insight DS+</td><td>Newport</td><td></td><td>Système laser capable de produire deux lasers pulsés synchronisés (un faisceau fixe à 1 040 nm et un faisceau accordable, allant de 680 à 1 300 nm) avec un taux de répétition de 80 MHz.</td></tr><tr><td>Amplificateur Lock-In Liquid Instruments</td><td></td><td>Moku Lab</td><td>Amplificateur Lock-in pour extraire le signal SRS de la photodiode. Un instrument Zurich Instrument HF2LI ou un instrument similaire peut également être utilisé.</td></tr><tr><td>Miroirs</td><td>THORLABS</td><td>BB05-E03-10</td><td>Miroir diélectrique à large bande, 750 - 1 100 nm. Des miroirs argentés peuvent également être utilisés.</td></tr><tr><td>Ecran de retard motorisé</td><td>Zaber</td><td>X-DMQ12P-DE52</td><td>Ecran de retard pour le contrôle précis du chevauchement temporel de la pompe et des lasers Stokes. Toute autre scène motorisée devrait fonctionner.</td></tr><tr><td>Condenseur à immersion dans l’huile</td><td>Nikon</td><td>CSC1003</td><td>1.4 NA. D’autres condenseurs avec NA>1.2 peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS7054</td><td>Tout autre oscilloscope avec une bande passante de 400 MHz ou plus devrait fonctionner.</td></tr><tr><td>Déphaseur</td><td>SigaTek</td><td>SF50A2</td><td>Pour le déphasage de la fréquence de modulation</td></tr><tr><td>Photodiode</td><td>Hamamatsu Corp</td><td>S3994-01</td><td>Diode PIN en silicium de grande surface (10 x 10 cm2). D’autres diodes de grande surface et de faible capacité peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Séparateur de faisceau polarisant</td> Union <td>Optic</td><td>PBS9025-620-1000</td><td>Base</td></tr><tr><td>de données</td><td></td><td></td><td>d’indices</td>de réfaction refractiveindex.info</tr><tr><td>réflecteur</td><td>Edmund Optics</td><td>34-408</td><td>BBAR Prisme à angle droit. D’autres prismes ou rétroréflecteurs peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Minicircuits</td> <td>d’amplificateur de puissance RF</td><td>ZHL-1-2W+</td><td>Bloc de gain, 5 - 500 MHz, 50 & Omega ;</td></tr><tr><td>Miroirs à balayage</td><td>Cambridge Technologies</td><td>6215H</td><td>Nous avons utilisé un ensemble de miroirs de 5 mm avec revêtement argenté</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio</td><td>ScanImage Basic</td><td>Laser Logiciel de contrôle de microscope à balayage</td></tr><tr><td>Filtre passe-court</td><td>THORLABS</td><td>FESH1000</td><td>25,0 mm Filtre passe-court premium, longueur d’onde de coupure : 1 000 nm. Pour une suppression efficace des Stokes, deux filtres peuvent être nécessaires.</td></tr><tr><td>Microscope droit</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td>N’importe quel autre cadre de microscope peut être utilisé. Si un microscope à balayage laser est disponible, il peut être utilisé directement. Sinon, il fallait ajouter un scanner galvo et un objectif de balayage au microscope.</td></tr><tr><td>Objectif d’immersion dans l’eau</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>L’objectif multiphoton 25X a une NA de 1,05. D’autres objectifs similaires peuvent être utilisés.</td></tr></tbody></table>

imagerie par diffusion raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est devenue une puissante technique d’imagerie optique pour le diagnostic des tissus. Au cours des dernières années, il a été démontré que le SRS bicolore était capable de fournir des images équivalentes à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) qui permettent un diagnostic rapide et fiable du cancer du cerveau. Cette capacité a permis des applications passionnantes de diagnostic peropératoire du cancer. L’imagerie SRS bicolore des tissus peut être effectuée avec une source laser picoseconde ou femtoseconde. Les lasers femtosecondes ont l’avantage de permettre des modes d’imagerie flexibles, y compris l’imagerie hyperspectrale rapide et l’imagerie SRS bicolore en temps réel. Une approche de focalisation spectrale avec des impulsions laser gazouillées est généralement utilisée avec les lasers femtosecondes pour atteindre une résolution spectrale élevée. 
L’acquisition SRS bicolore peut être réalisée avec modulation orthogonale et détection de verrouillage. La complexité du gazouillis, de la modulation et de la caractérisation des impulsions est un goulot d’étranglement pour l’adoption généralisée de cette méthode. Cet article fournit un protocole détaillé pour démontrer la mise en œuvre et l’optimisation du SRS à focalisation spectrale et de l’imagerie bicolore en temps réel du tissu cérébral de souris en mode épi. Ce protocole peut être utilisé pour un large éventail d’applications d’imagerie SRS qui tirent parti de la capacité d’imagerie spectroscopique et à haute vitesse de SRS.

Optimisation de la résolution spectrale : La dispersion à travers un matériau est affectée par le milieu dispersif (longueur et matériau) et la longueur d’onde. La modification de la longueur de la tige de dispersion affecte la résolution spectrale et la taille du signal. Il s’agit d’une relation donnant-donnant qui peut être pesée différemment selon l’application. Les tiges étirent l’impulsion du faisceau d’être large en fréquence et étroite dans le temps à être étroite en fréquence et large dans le ...

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technique d’imagerie puissante, non destructive et sans étiquette. Une application émergente est l’histologie Raman stimulée, où l’imagerie SRS bicolore aux transitions Raman protéique et lipidique est utilisée pour générer des images de pseudo-hématoxyline et d’éosine. Ici, nous démontrons un protocole pour l’imagerie SRS bicolore en temps réel pour le diagnostic tissulaire.

Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Ce protocole démontrera la mise en œuvre et l’optimisation de la microscopie SRS à focalisation spectrale et comment elle peut être utilisée pour des applications d’histologie Raman stimulées en temps réel. Le principal avantage de cette technique est la vitesse à laquelle les échantillons peuvent être traités une fois que l’instrumentation est correctement alignée, car le SRS ne nécessite pas de traitement et de coloration des tissus. Ce protocole est applicable à d’autres applications SRS, pas seulement à l’histologie.Ces applications comprennent de petites molécules, des médicaments, des cellules et des tissus. Commencez par installer une paire de lentilles achromatiques pour le faisceau de la pompe afin d’agrandir la taille du faisceau laser de deux fois comme point de départ. Placez un objectif de 100 et 200 millimètres à environ 300 millimètres l’un de l’autre.Alignez ensuite le faisceau de la pompe à travers le centre des deux lentilles. Placez ensuite un miroir après la deuxième lentille pour envoyer le faisceau vers un mur à plus d’un mètre de distance. Tracez le faisceau du miroir au mur avec une carte IR et vérifiez si le faisceau change de taille.Collotez le faisceau si le faisceau change de taille en fonction de la distance. Combinez les deux faisceaux laser en installant un miroir dichroïque avec plusieurs rétroviseurs de direction pour le réglage. Optimisez le chevauchement spatial de la pompe et de Stokes en surveillant les faisceaux après le miroir dichroïque à deux positions différentes à environ un mètre l’une de l’autre.Ajustez de manière itérative le rétroviseur de direction suivi du miroir dichroïque pour aligner le faisceau de Stokes avec le faisceau de la pompe. Assurez-vous que les faisceaux combinés sont envoyés au centre des miroirs de balayage du microscope à balayage laser en ajustant une paire de miroirs de direction lorsque les miroirs de balayage sont en position stationnée. Après le condenseur, utilisez une autre paire d’objectifs avec des distances focales de 100 millimètres et 30 millimètres, respectivement, pour relayer le faisceau transmis sur la photodiode, en vous assurant que les deux faisceaux sont contenus dans la photodiode.Installez ensuite deux filtres passe-bas pour bloquer le faisceau Stokes modulé. Placez un échantillonneur de faisceau dans la trajectoire du faisceau de Stokes pour capter 10% du faisceau et l’envoyer à une photodiode rapide pour détecter le train d’impulsions de 80 mégahertz. Prenez l’une des sorties du tampon de fanout et filtrez-la avec un filtre passe-bande pour obtenir une onde sinusoïdale de 20 mégahertz.Utilisez ensuite un atténuateur RF pour ajuster le pic de sortie à la tension de crête à environ 500 millivolts. Envoyez la sortie résultante à un déphaseur, ce qui permet un réglage fin de la phase RF avec une source de tension. Envoyez cette sortie à un amplificateur de puissance RF et connectez la sortie de l’amplificateur à la moe électronique.Après avoir débloqué le faisceau de Stokes, optimisez la profondeur de modulation de la première MOE en plaçant une photodiode dans le trajet du faisceau. Ajustez la tension de la MOE et la plaque quart d’onde jusqu’à ce que la profondeur de modulation apparaisse satisfaisante. Placez une photodiode après le miroir dichroïque pour détecter le faisceau laser.Bloquez d’abord le faisceau de Stokes, puis zoomez sur l’un des pics d’impulsion de la pompe sur l’oscilloscope. Placez un curseur vertical pour marquer la position temporelle de ce pic avec l’oscilloscope. Maintenant, bloquez le faisceau de la pompe et débloquez le faisceau de Stokes.Traduisez l’étage de retard pour faire correspondre temporairement les positions de crête sur l’oscilloscope à la position marquée à l’étape précédente. En calculant la distance de retard requise pour faire correspondre les deux faisceaux, puis en allongeant la trajectoire de la poutre la plus rapide ou en raccourcissant la trajectoire de la poutre la plus lente. Ensuite, préparez un échantillon de lame de microscope avec du DMSO et du ruban adhésif double face comme espaceur pour maintenir l’échantillon entre la lame et un couvercle.Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté du couvercle face à l’objectif du microscope et observez l’échantillon de la pièce I sous éclairage en champ lumineux. Trouvez le foyer de l’échantillon à la fois sur la couche supérieure et inférieure de bulles d’air à l’interface du ruban de verre, puis déplacez le foyer pour qu’il se trouve entre les deux couches du ruban. Ensuite, réglez la sortie du faisceau accordable à 798 nanomètres.En fonction du débit optique du condenseur, ajustez la puissance optique à environ 40 milliwatts chacun pour la pompe et les faisceaux de Stokes au foyer de l’objectif. Ouvrez ensuite l’image de numérisation dans MATLAB et cliquez sur le bouton intitulé focus pour lancer la numérisation. Réglez le rétroviseur avant le scanner galvo pour centrer le signal CC sur l’écran du canal un.Déplacez l’étage de retard motorisé et observez de près la sortie de verrouillage affichée sur l’écran du canal deux. Enfin, ajustez le délai pour maximiser l’intensité du signal CA. Réglez le miroir dichroïque pour centrer le signal SRS sur le canal CA.Ajustez ensuite la phase de l’amplificateur de verrouillage pour maximiser le signal. Après avoir monté l’échantillon, glissez sur le microscope et ajustez la puissance des deux faisceaux à environ 40 milliwatts chacun au foyer de l’échantillon, comme démontré précédemment. Ouvrez l’image de numérisation à partir de MATLAB.Ensuite, trouvez le signal SRS maximal en balayant à travers l’étage de retard correspondant au pic Raman de 2 913 centimètres inverses de DMSO. Acquérir une image SRS correspondant au pic Raman de 2 913 centimètres inverses du DMSO. Ouvrez l’image dans ImageJ et sélectionnez une petite zone au centre du cadre.Utilisez la fonction de mesure pour calculer la moyenne et l’écart-type des valeurs dans la zone sélectionnée. Pour l’étalonnage de l’accès à la fréquence, enregistrez un balayage hyperspectral avec la plage d’étages de retard couvrant les pics Raman de 2, 913 et 2 994 centimètres inverses de DMSO. Enregistrez ensuite les positions de scène correspondant à l’ensemble de données hyperspectrales.Effectuez une régression linéaire pour les positions des étages et les décalages Raman à 2, 913 et 2 994 centimètres inverses. À l’aide de l’équation de régression linéaire, convertissez les positions de retard en fréquences Raman correspondantes. Pour l’étalonnage de la résolution spectrale, estimez la position de l’étage en fonction de la position précédente avec l’augmentation de la longueur du chemin optique due à l’insertion de tiges.Réaligner le chevauchement spatial des poutres en raison de la légère déviation de la poutre lorsque des tiges de verre sont ajoutées. Installez un séparateur de faisceau polarisant, une plaque quart d’onde et une deuxième MOE dans le chemin de faisceau de trempage après la première MOE. Débranchez l’entrée de signal de la deuxième moE, puis branchez l’entrée de signal à la première moE et allumez-la.Modulez le faisceau de Stokes à 20 mégahertz en envoyant le faisceau à travers la première MOE. Ajustez l’inclinaison et la position de la première MOE pour vous assurer que le faisceau est centré à travers le cristal de l’EOM. Préparez un échantillon de lame de tissu avec du ruban adhésif double face, une lame de microscope et du verre de couverture.Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté du couvercle face à l’objectif du microscope. Pour l’imagerie SRS en mode épi, installez une plaque demi-onde avant que le faisceau n’entre dans le microscope pour modifier la polarisation du faisceau entrant dans le microscope. Placez un séparateur de faisceau polarisant au-dessus de l’objectif pour permettre au faisceau rétroréfléchi dépolarisé d’atteindre le détecteur.Ensuite, utilisez une lentille achromée de 75 millimètres et une lentille asphérique de 30 millimètres pour relayer les photons rétrodiffusés de l’ouverture arrière de l’objectif au photodétecteur. Montez le détecteur pour recueillir la lumière rétrodiffusée dirigée par le séparateur de faisceau polarisant. Installez ensuite un filtre pour empêcher le faisceau modulé d’entrer dans le détecteur.La variation de la longueur des tiges affecte la résolution spectrale. Lorsqu’aucune tige de gazouillis en verre n’est utilisée, les deux pics Raman du DMSO ne sont pas résolus du tout. Une augmentation du nombre de tiges de gazouillis de verre commence à résoudre les deux pics à un point satisfaisant.Le gazouillis apparié résout les deux pics et peut être utilisé pour calibrer les positions des étages en fonction de la fréquence. Deux trains d’impulsions retardés de polarisation orthogonale utilisés pour imager les spectres DMSO montrent le délai entre les excitations SRS avec une profondeur de modulation acceptable et une séparation temporelle. En revanche, un mauvais déphasage SRS bicolore donne lieu à des pics inversés ou négatifs.L’imagerie SRS bicolore en temps réel à 2 850 et 2 930 centimètres inverses de tissu cérébral de souris ex vivo est montrée ici. Les images brutes de lipides et de protéines ont été codées par couleur pour produire une seule image représentant les contributions lipidiques et protéiques. La fausse coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a également été réalisée pour imiter la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour des applications pathologiques.Le chevauchement spatial-temporel et l’optimisation de la résolution spatiale sont les étapes les plus importantes pour l’approche de focalisation spatiale de SRS. Cette méthode est généralement applicable à d’autres expériences de microscopie à sonde à pompe telles que la microscopie à absorption transitoire. La méthode permet également l’imagerie de molécules non fluorescentes dans les cellules et les tissus.La méthode présentée ici accélère le temps d’acquisition de l’image pour la traduction future de l’histologie Raman stimulée en clinique.

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