Analyse à haut débit de la trempe non photochimique dans les cultures à l’aide de la fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion

Cette méthode peut donner un aperçu de la variation génétique de la trempe non photochimique disponible au sein des panels de diversité génétique ou des populations reproductrices. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de dépister un grand nombre de génotypes pour la variation de la trempe non photochimique en une seule journée. Le protocole est présenté pour la glycine max ou le soja, mais peut être adapté pour analyser d’autres espaces végétaux à partir desquels des disques de levage peuvent être collectés.

Pour quelqu’un qui exécute le protocole pour la première fois, la clé est de manipuler le disque de levage pour éviter d’endommager ou de sursaturer les éponges avec de l’eau. Pour commencer, échantillonnez les plantes sur le site du champ 30 jours après la germination. Remplir 1/3 niveau d’eau distillée dans tous les puits d’une plaque de 24 puits.

Étiquetez le couvercle et le côté de la plaque avec les répliques à échantillonner. Tenez la plus jeune feuille entièrement expansée présente au sommet de la plante contre un bouchon en caoutchouc. Appuyez sur un foreur de liège Humboldt numéro deux à travers la feuille et tournez pour couper un disque, en évitant la côte médiane.

Collectez consécutivement cinq disques de la même feuille pour des répliques techniques. Poussez les disques de feuilles hors de l’agrile du liège dans un seul puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’un coton-tige et répétez ceci pour une autre plante du même génotype. Vérifiez que tous les disques de feuilles flottent dans l’eau.

Sinon, déplacez doucement les disques de feuilles collés sur le côté d’un puits en position flottante avec un coton-tige. Passez aux disques d’échantillonnage du tracé suivant. Placez le couvercle et scellez avec un film flexible semi-transparent.

après avoir terminé l’échantillonnage dans toute la plaque de 24 puits. Conservez l’assiette à l’abri de la lumière directe du soleil dans un sac, une boîte ou une glacière vide. Dans un espace de laboratoire propre, tapotez le couvercle de la plaque scellée pour déloger les disques de feuilles collés au couvercle pendant le transport.

Déballez le film et retirez le couvercle. Transférez un disque de feuilles de la première position de la plaque de 24 puits dans une plaque fraîche de 96 puits avec le disque de feuilles tourné vers le bas au fond du puits. Coupez un filtre d’aspirateur nasal en deux.

Trempez le filtre résultant à mi-chemin dans l’eau et tamponnez sur une serviette en papier pour éliminer l’excès de liquide. Insérez le filtre dans le puits avec le disque de feuille pour maintenir l’humidité. Prenez un deuxième disque de feuilles à partir de la première position de la plaque de 24 puits et placez-le face vers le bas dans la position disponible suivante de la plaque de 96 puits.

Trempez la moitié restante du filtre nasal produit dans de l’eau et tamponnez-la sur une serviette en papier avant de l’insérer dans le puits avec le deuxième disque de feuilles. Collez le coin supérieur droit pour aider à orienter la plaque dans l’obscurité pour l’imagerie. Scellez les plaques avec un film flexible semi-transparent et enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium.

Écrivez les ID de tracé et l’ID de plaque sur la feuille d’aluminium. Placez les plaques dans une boîte ou une armoire sombre pendant au moins 30 minutes pour la relaxation des deux premières phases de trempe non photochimique. Utilisez une période d’incubation sombre prolongée d’une heure avant l’imagerie si des phases à long terme de trempe non photochimique sont intéressantes.

Préparez une plaque factice supplémentaire pour la mise au point pendant l’analyse en plaçant un disque de feuille dans chaque coin d’une plaque fraîche de 96 puits et un au centre. Fixez les disques de feuilles avec des filtres nasaux comme avec les plaques précédentes, scellez la plaque et incubez dans l’obscurité à température ambiante et à 50% d’humidité relative. Allumez l’imageur et ouvrez le logiciel d’imagerie.

Cliquez sur Paramètres suivis de Protocole pour ouvrir une fenêtre pour la saisie des étapes dans le protocole expérimental PAM. Définissez les spécifications techniques de la machine fournie dans le manuscrit. Réglez le programme pour qu’il commence par une impulsion saturante pour mesurer l’efficacité quantique maximale de la photosynthèse adaptée à l’obscurité en entrant 20 secondes dans la boîte nommée Après un délai de.

Cliquez sur la case Appliquer l’impulsion et entrez 1 dans la zone intitulée Ce nombre de fois. Réglez l’impulsion PPFD sur 6 152, la longueur d’impulsion sur 800 millisecondes, et cochez la case Prendre des images F prime et FM prime avec toutes les impulsions. Cochez insérer après pour ajouter une deuxième étape au protocole.

Entrez 30 secondes dans la case intitulée Après un délai de. Ensuite, sélectionnez l’option Changer actinique et entrez 50 dans la case intitulée Actinic PPFD pour régler l’intensité lumineuse de la chambre sur 50 PPFD. Cliquez sur Insérer après pour ajouter une nouvelle étape au protocole et entrez 150 secondes dans la zone intitulée Après un délai de.

Sélectionnez Appliquer l’impulsion et entrez 4 dans la case intitulée Ce nombre de fois pour appliquer des impulsions de mesure toutes les 150 secondes quatre fois de suite pendant que la lumière actinique est maintenue à 50 PPFD. Ajustez le délai et l’intensité lumineuse pour chaque étape en fonction des valeurs fournies dans le manuscrit avant d’enregistrer le protocole sous forme de fichier pcl à l’emplacement souhaité. Éteignez la lumière et placez la plaque factice face cachée sur la scène d’échantillonnage de sorte que la surface adaxiale de la feuille pointe vers le haut vers le détecteur et que l’éponge soit orientée vers le bas vers la plate-forme.

Réglez la hauteur de la scène d’échantillonnage de sorte que les disques de feuilles soient à 140 millimètres au-dessus de la base de l’instrument. Cliquez sur l’icône Se connecter/déconnecter à l’appareil photo imageur et à l’appareil photo matériel pour démarrer l’appareil photo. Cliquez sur le symbole de fluorescence de mise au point, représenté par une icône de flèche à deux côtés de couleur rouge avec deux lignes vertes à la base, puis ajustez l’objectif et l’exposition pour mettre la plaque au point.

Cliquez à nouveau sur l’icône de fluorescence de mise au point pour éteindre la lumière clignotante. En travaillant dans l’obscurité, remplacez la plaque factice par la plaque à analyser. Placez-le face vers le bas avec le ruban adhésif à l’extérieur utilisé pour orienter le coin supérieur droit et cliquez sur l’icône de la caméra d’image de carte.

Réglez l’exposition de l’image en ouvrant ou en fermant l’ouverture jusqu’à ce que la barre de la fenêtre contextuelle soit positionnée dans la zone verte. Cliquez sur le bouton Réessayer après chaque réglage de l’ouverture jusqu’à ce que l’exposition soit correctement ajustée et que l’instrument prenne une image. Faites un clic droit sur l’image et sélectionnez Appliquer l’isolation de l’image pour bloquer les signaux d’arrière-plan.

La zone foliaire focalisée sera affichée en gris et l’arrière-plan en bleu. Sélectionnez la zone ou les pixels d’intérêt pour inclure uniquement les disques de feuilles en ajustant l’histogramme et le niveau gamma dans le menu déroulant Modifier l’image en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image. Faites un clic droit sur l’image et sélectionnez Supprimer les coupes hautes et basses pour supprimer les zones surlignées bleu clair.

Faites un clic droit sur l’image et sélectionnez Supprimer les pixels parasites pour supprimer tous les pixels qui ne touchent pas les trois derniers autres pixels. Toutes les zones de l’image qui apparaissent comme des îles isolées seront analysées séparément et incluses dans la sortie finale des données. Cliquez sur l’icône Exécuter le protocole pour démarrer le programme.

Une minuterie apparaîtra en bas de l’écran pour vous informer du temps qu’il reste au protocole pour s’exécuter. Attendez que le protocole soit terminé. Cliquez sur Fichier et Enregistrer sous pour enregistrer les données en tant que fichier igr.

Fermez la fenêtre en cliquant sur la croix rouge en haut à droite de la fenêtre avant de commencer une autre plaque d’échantillonnage. Pour exporter les données de fluorescence de la chlorophylle, ouvrez le fichier igr dans le logiciel d’imagerie et cliquez sur Fichier suivi de Exporter vers le dossier pour créer un nouveau dossier avec tous les fichiers nécessaires. Une mesure typique de la trempe non photochimique dans le soja cultivé en plein champ a montré qu’après un éclair de saturation initial pour déterminer Fv / Fm lorsque les disques foliaires étaient exposés à une faible lumière de 50 micromoles par mètre et par seconde, la trempe non photochimique était inférieure à un.

De plus, lors du transfert à une lumière élevée de 2 000 micromoles par mètre et par seconde, la trempe non photochimique a augmenté jusqu’à la valeur maximale de quatre après 15 minutes. Une mesure échouée a montré une augmentation minime de la trempe non photochimique lors du transfert en haute lumière. Des plaques d’orientation à l’intérieur de l’imageur et un plan clairement défini pour l’échantillonnage et le placage des disques de feuilles sont essentiels pour s’assurer que les données sont liées au génotype correct.

Ce protocole peut quantifier l’impact de variables environnementales telles que la sécheresse et l’excrétion sur la trempe non photochimique ou évaluer la trempe non photochimique à différents niveaux de la canopée pour affiner les modèles de culture.