Name: Une approche hautement évolutive pour effectuer des études écologiques sur les nématodes de Caenorhabditis Selfing (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Découvrez une méthode évolutive pour l'isolement et l'identification des nématodes Caenorhabditis en milieu naturel. Cette approche utilise des plateformes mobiles et des bases de données cloud pour améliorer la précision et l'accessibilité des données écologiques.

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Cette recherche a été soutenue par des fonds de démarrage de l’Université Northwestern et un prix CAREER de la National Science Foundation (IOS-1751035), tous deux accordés à E.C.A.

<ol><li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Sivasundar, A., Hey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+from+natural+populations+with+RNAI+reveals+high+outcrossing+and+population+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).</li>
<li>Kiontke, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+coexistence+pattern+of+selfing+genotypes+in+Caenorhabditis+elegans+natural+metapopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations.</a> Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).</li>
<li>Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephemeral-habitat+colonization+and+neotropical+species+richness+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> eLife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Noble, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selfing+is+the+safest+sex+for+Caenorhabditis+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis.</a> eLife. 10, 62587(2021).</li>
<li>Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Males%2C+Outcrossing%2C+and+Sexual+Selection+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+need+more+ecology+for+genetic+models+such+as+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans.</a> Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).</li>
<li>Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans+and+Related+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans and Related Nematodes.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).</li>
<li>Poullet, N., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+isolation+of+C.+elegans+from+the+natural+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PloS one. 16 (10), 0254293(2021).</li>
<li>Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/">https://www.fulcrumapp.com/</a> (2021).</li>
<li>Nematode Isolation Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation</a> (2021).</li>
<li>Nematode Field Sampling Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling</a> (2021).</li>
<li>JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit">https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit</a> (2021).</li>
<li>Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch">https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch</a> (2021).</li>
<li>easyFulcrum. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html">http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</a> (2021).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+the+neuropeptide+receptor+npr-1+is+a+major+determinant+of+Caenorhabditis+elegans+growth+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Caenorhabditis+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Caenorhabditis Nomenclature.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Maintenance+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Maintenance of C. Elegant.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Ce protocole contient des étapes critiques qui doivent être exécutées avec prudence. Par exemple, il est important que les équipes de terrain et d’isolement prennent soin de sélectionner le bon projet de prélèvement dans l’application avant de prélever des échantillons sur le terrain ou d’isoler les nématodes des échantillons en laboratoire. Dans le cas où le mauvais projet de collecte est sélectionné, les enregistrements de données errants sont mieux corrigés dans la base de données Fulcrum à l’aide des outils d’édition d’enregistrements en ligne. Ce processus peut être fastidieux pour de nombreux enregistrements égarés. Toutefois, la base de données conserve toutes les modifications apportées aux enregistrements afin qu’un audit complet des enregistrements de collecte et d’isolement soit possible. Les autres étapes critiques de ce protocole concernent la manipulation d’échantillons prélevés sur le terrain et les nématodes isolés à partir de ces échantillons. Pour s’assurer que les nématodes de Caenorhabditis survivent aux étapes d’échantillonnage et d’expédition, la température des échantillons doit être maintenue entre 4 °C et 25 °C. Des températures supérieures à 25 °C peuvent provoquer la stérilité chez C. elegans14. S’assurer que les échantillons sont transférés des sacs de prélèvement aux plaques de prélèvement dans les cinq jours dans la mesure du possible afin de minimiser la perte pour les nématodes. Une fois les nématodes isolés, il est essentiel qu’ils soient génotypés et cryoconservés avant de périr. Il est difficile de trouver des nématodes vivants sur les plaques S qui ont plus de deux à trois semaines, car la contamination fongique et bactérienne peut rendre les plaques S inhospitalières.
Ce protocole peut être modifié facilement pour s’adapter à différents types de données que les chercheurs peuvent vouloir recueillir sur le terrain. Par exemple, il est facile de personnaliser l’application « Nematode field sampling » avec de nouveaux champs de saisie de données à l’aide de l’interface graphique en ligne de Fulcrum pour l’édition d’applications. De plus, le package d’analyse de données, easyFulcrum, peut prendre en charge ces modifications lors du traitement des nouvelles données15. Une autre modification que les utilisateurs peuvent trouver attrayante est d’utiliser une méthode d’échantillonnage différente sur le terrain. Plutôt que d’échantillonner des substrats discrets, les chercheurs peuvent souhaiter échantillonner de plus grandes zones contenant plusieurs types de substrats. Il est préférable de traiter ces échantillons plus volumineux en laboratoire à l’aide des méthodes d’extraction de l’entonnoir ou du plateau Baermann13. Il est important de noter que l’utilisation d’étiquettes C et d’étiquettes S s’applique toujours à ces techniques et sont donc compatibles avec les applications mobiles.
Les principales limites de ce protocole concernent le temps de manipulation des nématodes avant l’isolement en laboratoire. Premièrement, le délai entre le prélèvement de l’échantillon et l’isolement des nématodes rend impossible l’enregistrement des stades de développement des nématodes sur un échantillon donné au moment du prélèvement. Deuxièmement, la fréquence des mâles et les croisements dans la nature sont des questions évolutives clés pour les nématodes Caenorhabditis auto-identifiés10. Cette méthode n’est pas bien adaptée pour répondre à ces questions, car les nématodes sont susceptibles d’avoir traversé plusieurs générations avant l’isolement. L’isolement retardé signifie qu’il est impossible de prouver directement la fréquence masculine dans la nature. De plus, le retard multigénérationnel au cours des étapes de génotypage signifie que les preuves génomiques de croisement (hétérozygotie) seront érodées avant qu’une souche de nématode puisse être séquencée. Pour identifier l’hétérozygotie dans la nature, la progéniture produite par un nématode directement isolé de la nature est utilisée pour le séquençage2. Une autre limitation potentielle de ce protocole est qu’il est biaisé vers l’identification de Caenorhabditis auto-bloquant. En effet, les nématodes isolés d’espèces auto-autonomes ont plus de chances de proliférer que les croisements obligatoires, qui ne proliféreront que si une femelle fécondée est isolée.
Cette méthode de collecte est basée sur les protocoles de collecte existants13,14. L’avancée majeure de cette technique est l’utilisation de la technologie mobile et des logiciels personnalisés pour faciliter l’organisation de grandes quantités de données écologiques et moléculaires associées à des projets de collecte à grande échelle. Les données écologiques générées à l’aide de ce protocole de collecte peuvent être utilisées pour répondre aux questions en suspens pour les populations naturelles d’espèces de Caenorhabditis. Par exemple, les données générées avec cette méthode ont été utilisées pour découvrir des préférences de niche pour l’espèce à travers les îles hawaïennes. De plus, en séquençant les génomes des nématodes cryoconservés, les chercheurs peuvent étudier comment les modèles de variation génétique sont corrélés avec les données écologiques. Des recherches de ce type peuvent révéler des signatures d’adaptation locale dans les populations de Caenorhabditis et fournir des informations importantes sur la pertinence de la variation génétique dans des contextes naturels8. Pour acquérir une compréhension fonctionnelle de nombreux gènes chez les nématodes de Caenorhabditis, des études écologiques sont probablement nécessaires11. Même pour C. elegans, une grande partie des gènes manque d’annotations fonctionnelles, bien qu’il s’agisse du premier animal multicellulaire à être séquencé et de l’un des animaux les plus étudiés sur Terre. Ce protocole de collecte a été élaboré pour aider à combler cette lacune dans les connaissances en facilitant la collecte des nématodes sauvages de Caenorhabditis et l’étude de leur écologie et de leur diversité génétique naturelle.

Les deux dernières décennies ont suscité un intérêt accru pour l’écologie des nématodes de Caenorhabditis. D’après ces études, nous savons que les espèces de Caenorhabditis en liberté peuvent être isolées des micro-habitats éphémères dans les régions tempérées et tropicales, où elles se nourrissent de proliférations microbiennes associées à la décomposition du matériel végétal, parfois en sympatrie1,2,3,4,5,6,7,8 . Nous avons également appris que l’évolution convergente de l’autofertilisation s’est produite dans le genre à trois reprises, et que l’auto-fécondation est le mode de reproduction dominant pour C. briggsae, C. elegans et C. tropicalis9,10. Parmi ces selfers, C. elegans est l’un des animaux les plus étudiés sur Terre et a été utilisé par les chercheurs pour faire des progrès critiques en biologie. Il est important de noter que les autres espèces de Caenorhabditis possèdent de nombreux avantages expérimentaux de C. elegans et font rapidement progresser les études comparatives dans le genre. Cependant, la nature cryptique de ces nématodes à l’état sauvage rend difficile l’étude de leur écologie et de leur diversité naturelle, ce qui est essentiel pour comprendre les fonctions biologiques de leurs gènes et la façon dont l’évolution a façonné la diversité génétique parmi les espèces10,11.
Le plus grand défi pour étudier l’écologie des nématodes auto-autonomes de Caenorhabditis à l’état sauvage est leur petite taille; les nématodes adultes mesurent souvent 1 mm de long ou moins. Ce défi exige que les chercheurs échantillonnent des substrats dans la nature et tentent de séparer les nématodes d’intérêt des substrats en laboratoire sans pouvoir observer les animaux dans la nature. Parce que même les experts formés trouvent difficile de distinguer les nématodes Caenorhabditis auto-vivants des autres nématodes libres au microscope, les nématodes sont généralement retirés du substrat, isolés et laissés à proliférer avant d’être identifiés par l’identité de la séquence à l’aide de codes-barres moléculaires établis3,12,13,14 . Le temps et les efforts nécessaires pour traiter chaque nématode de cette manière présentent un défi organisationnel, car les chercheurs doivent être en mesure de retracer l’identité de chaque nématode isolé en laboratoire jusqu’au substrat exact et aux données écologiques associées échantillonnées sur le terrain. Ici, nous décrivons un processus étape par étape pour collecter et identifier efficacement les nématodes de Caenorhabditis auto-autoportés sur le terrain et relier fidèlement ces isolats à leurs données spatiales et écologiques associées à grande échelle.
Cette méthode de collecte augmente l’échelle et la précision des enquêtes écologiques en utilisant des plates-formes de collecte de données mobiles, des bases de données basées sur le cloud et l’environnement logiciel R. Fulcrum est une plate-forme de collecte de données personnalisable qui fonctionne avec la plupart des appareils mobiles et permet aux utilisateurs de créer des applications personnalisées pour collecter et organiser des données de localisation (https://www.fulcrumapp.com). Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d’utiliser des applications de collecte de données personnalisées pour organiser des données écologiques spatialement explicites sur le terrain et relier avec précision ces données à l’identité des nématodes isolés en laboratoire. Le protocole explique également comment identifier efficacement les nématodes Caenorhabditis auto-jacents à l’aide de codes-barres moléculaires établis. Les données de ces méthodes peuvent être traitées de manière simple et reproductible avec le progiciel R easyFulcrum15 pour explorer l’écologie et la diversité génétique des populations naturelles de Caenorhabditis.

<table><tbody><tr><td>Étiquettes adhésives</td><td>Avery</td><td>61533</td><td>Impression des étiquettes C et S</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Préparation du</td><td>gel d’agarose</td>Thomas Scientific <td>C748D75</td></tr><tr><td>Sac à dos</td><td></td><td></td><td>Un sac à dos pour chaque membre de l’équipe afin de contenir du matériel, des échantillons, de la nourriture et de l’eau pour la journée.</td></tr><tr><td>Boîtes en carton</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS261</td><td>Stockage des plaques S</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Lyse des néamtodes, SSU et ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Sacs de collecte</td><td>Zip-lock</td><td>NA</td><td>Collecte des substrats Thermomètre</td></tr><tr><td>/hygromètre numérique</td><td>Preciva</td><td>HT-86</td><td>Mesure de la température et de l’humidité</td></tr><tr><td>ambiantes Portée de dissection</td><td>NA</td> NA <td></td><td>Isolement des nématodes, lyse</td></tr><tr><td>Réservoirs jetables</td><td>USA Scientific</td><td>1306-1010</td><td>Alicitation des mélanges maîtres PCR et chargement de</td></tr><tr><td>l’échelle d’ADN du colorant, 1 KB plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td>Visualisation des produits PCR SSU et ITS2</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB4430-2</td><td>Composant du mélange maître PCR</td></tr><tr><td>easyFulcrum R package</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Un progiciel R pour le traitement des données de collecte http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</td></tr><tr><td>solution d’EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Voir le tableau supplémentaire 3 pour la recette</td></tr><tr><td>Éthanol (95 %)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Emballage des échantillons, stérilisation à la cuillère</td></tr><tr><td>Solution de bromure d’éthidium (10 mg/mL)</td><td>VWR</td><td>97064-602</td><td>Visualisation des produits</td></tr> <tr><td>PCR SSU et ITS2Chargeur de batterie externe pour appareil mobile</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Chargeur de batterie externe et câble de charge pour iPhone ou Android</td></tr><tr><td>Flacon (500 mL)</td><td>Fisher Scientific</td> FB501500 <td>préparation de gel</td><td>d’agarose</td></tr><tr><td>Alimentaire</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Emballage en conséquence</td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel Thermo</td><td>Scientific</td><td>B2</td><td>Visualisation des produits SSU et ITS2</td></tr><tr><td>PCR Gel alimentation par électrophorèse</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Visualisation des produits PCR SSU et ITS2</td></tr><tr><td>Colorant de chargement de gel, 6x</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td>Visualisation des produits PCR SSU et ITS2</td></tr><tr><td>Ensemble d’amorces ITS2</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA1687 = amorce directe CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = amorce inverse GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC</td></tr><tr><td>ITS2 amorce de séquençage</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA306 = amorce directe CACTTTCAAGCAACCCGAC</td></tr><tr><td>Tampon de lyse</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Lyse des nématodes, voir le protocole pour la recette</td></tr><tr><td>Micro-ondes</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Préparation de gel d’agarose</td></tr><tr><td>Appareil mobile</td><td>NA</td><td></td><td>NA Téléphone chargé en mode avion. Les positions GPS de l’application Fulcrum sont imprécises par rapport aux positions GPS extraites des images. Ce paramètre vous permet d’utiliser moins d’énergie et d’obtenir des mesures GPS plus précises.</td></tr><tr><td>Plaques NGMA, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>plaques C, voir Andersen et al. 2014 pour le protocole de plaque NGMA.</td></tr><tr><td>Plaques NGMA,</td> plaques <td>Greiner Bio-One</td><td>5662-7102Q</td> de 3,5 cm<td>, voir Andersen et al. 2014 pour le protocole de plaque NGMA.</td></tr><tr><td>Thermomètre infrarouge sans contact</td><td>Etekcity</td><td>B00837ZGRY</td><td>Mesure de la température du substrat</td></tr><tr><td>Essuie-tout</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Essuie-tout pour absorber l’excès d’humidité dans un échantillon en sac.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Scellement de plaques</td></tr><tr><td>Feuille adhésive PCR</td><td>VWR</td><td>60941-126</td><td>Feuille adhésive PCR</td></tr><tr><td>Tampon PCR (10x)</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB3702-7</td><td>PCR Master mix component</td></tr><tr><td>Plaques PCR (96-well)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149K04</td><td>SSU et ITS2 PCRs</td></tr><tr><td>Crayon</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cuillères en plastique</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Placage d’échantillons Prélèvement en</td></tr><tr><td>platine</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Isolement des nématodes, lyse</td></tr><tr><td>Sacs de collecte ziplock pré-étiquetés</td><td>NA</td><td></td><td>NA Paquets de sacs en plastique zip-lock pré-étiquetés avec codes-barres C-label. Chaque paquet doit contenir 25 sacs à code-barres enveloppés d’un élastique.</td></tr><tr><td>La protéinase K</td><td>Sigma</td><td>3115879001</td><td>la lyse des nématodes, ajoutée au tampon de lyse juste avant l’utilisation</td></tr><tr><td>du logiciel R</td><td></td> NA <td>NA</td><td>Logiciel R : Un langage et un environnement pour le calcul statistique https://www.R-project.org/</td></tr> <tr><td>Sac isotherme souple et bloc réfrigérant</td><td>NA</td><td>Collection</td><td>Refroidisseurs et blocs réfrigérants pour garder les échantillons au frais lorsque la température ambiante est supérieure à 25 °C.</td></tr><tr><td>Piles de rechange</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Batteries supplémentaires pour l’équipement d’échantillonnage</td></tr><tr><td>Kit d’amorces SSU</td><td>NA</td><td></td><td>NA oECA1271 = amorce avant TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = amorce inverse CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA</td></tr><tr><td>Capuchons de tubes à bandelettes (12 puits)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V29</td><td>Lyse des nématodes</td></tr><tr><td>Tubes à bandes (12 puits)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V31</td><td>Lyse des nématodes</td></tr><tr><td>Tampon TAE (1x)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Visualisation des produits PCR SSU et ITS2. Voir le tableau supplémentaire 3 pour la recette</td></tr><tr><td>Taq polymérase</td><td>Thomas Scientific</td><td>C775Y45</td><td>PCR Master Mix</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Lyse de Neamtode, SSU et ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Eau</td><td>NA</td><td></td><td>NA Pack en conséquence</td></tr></tbody></table>

une approche hautement évolutive pour effectuer des études écologiques sur les nématodes de caenorhabditis selfing

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans est l’un des principaux organismes modèles en biologie, mais ce n’est que récemment que les chercheurs se sont concentrés sur son écologie naturelle. La relative rareté de l’information sur C. elegans dans son contexte naturel provient des défis liés à l’identification du petit nématode dans la nature. Malgré ces défis, l’accent croissant mis sur l’écologie de C. elegans a entraîné une mine de nouvelles informations concernant sa vie en dehors du laboratoire. L’intensification de la recherche de C. elegans dans la nature a contribué à la découverte de nombreuses nouvelles espèces de Caenorhabditis et a révélé que les nématodes congénériques cohabitent fréquemment à l’état sauvage, où ils se nourrissent de proliférations microbiennes associées à la pourriture du matériel végétal. L’identification de nouvelles espèces a également révélé que le système d’accouplement androdioecious des mâles et des hermaphrodites autofertilisants a évolué trois fois indépendamment au sein de Caenorhabditis. Les deux autres espèces auto-entretenues, C. briggsae et C. tropicalis, partagent les avantages expérimentaux de C. elegans et ont permis des études comparatives sur la base mécaniste de traits importants, y compris l’auto-fécondation. Malgré ces progrès, il reste encore beaucoup à apprendre sur l’écologie et la diversité naturelle de ces espèces importantes. Par exemple, nous manquons encore d’informations fonctionnelles pour beaucoup de leurs gènes, ce qui ne pourrait être atteint que par une compréhension de leur écologie naturelle. Pour faciliter la recherche écologique sur les nématodes Caenorhabditis auto-autonomes, nous avons développé une méthode hautement évolutive pour collecter les nématodes dans la nature. Notre méthode utilise des plates-formes de collecte de données mobiles, des bases de données basées sur le cloud et l’environnement logiciel R pour améliorer la capacité des chercheurs à collecter des nématodes dans la nature, à enregistrer les données écologiques associées et à identifier les nématodes sauvages à l’aide de codes-barres moléculaires.

Ce protocole a été utilisé pour collecter les nématodes Caenorhabditis à plusieurs endroits, y compris Hawaii et la Californie. Le taux de réussite de l’isolement des nématodes Caenorhabditis varie en fonction du lieu de prélèvement, du climat, de l’expérience d’échantillonnage et des types de substrats échantillonnés. Le protocole a été utilisé pour échantillonner largement les îles hawaïennes, où neuf projets de collecte ont été menés sur plusieurs années et saisons. Les taux de réussite de l’isolement pour les espèces de Caenorhabditis auto-autonomes sont presque identiques pour C. briggsae (162 des 4 506 échantillons, 3,6 %) et C. elegans (163 des 4 506 échantillons, 3,6 %), et beaucoup plus faibles pour C. tropicalis (26 sur 4 506 échantillons, 0,58 %)8. Chacune des espèces auto-autoportantes est enrichie sur des substrats de fruits et de fleurs en décomposition par rapport aux autres catégories de substrats. Échantillonnez des substrats de fruits et de fleurs en décomposition si le chercheur tente de maximiser le taux de réussite plutôt que de caractériser les préférences de substrat. Cependant, le taux de réussite varie en fonction de la qualité du substrat choisi. Par exemple, parmi les substrats de fruits et de fleurs, les substrats trop secs, humides ou frais ne produiront probablement pas de nématodes Caenorhabditis .
L’évolutivité de ce protocole de collecte est évidente d’après le nombre de collections qu’une seule paire de chercheurs peut collecter dans la nature. Par exemple, en octobre 2018, deux chercheurs utilisant ce protocole de collecte ont pu collecter un total de plus de 1 000 échantillons en 7 jours à plusieurs endroits sur deux îles hawaïennes. Cette équipe de terrain a expédié les échantillons pendant la nuit au laboratoire, où une équipe de huit chercheurs a isolé plus de 2 000 nématodes des échantillons à leur arrivée. L’un des principaux avantages de ce protocole est qu’il minimise les coûts associés à l’échantillonnage dans des endroits éloignés en réduisant l’équipement et le personnel requis sur le terrain. Grâce à ce protocole, une petite équipe sur le terrain peut se concentrer sur l’échantillonnage tandis que l’équipe d’isolement peut traiter les échantillons dans son établissement d’origine à l’aide d’équipement fragile et lourd comme des microscopes à dissection et des plaques d’agar pour isoler les nématodes. De plus, la mise en œuvre de l’application mobile de collecte de données permet de relier directement toutes les données de terrain associées aux échantillons à l’étiquette C, ce qui permet à l’équipe d’isolement de travailler indépendamment de l’équipe de terrain lors du traitement des échantillons.
Les chercheurs qui utilisent ce protocole de collecte doivent tenir compte des efforts requis pour isoler les nématodes avant un projet de collecte. Les étapes d’isolement et d’identification limitent le débit, et une petite équipe de collecte peut rapidement submerger les isolateurs d’échantillons. De plus, l’espace de laboratoire requis pour traiter de nombreuses collections peut nuire à la recherche en cours (figure 3). De plus, certains nématodes isolés nécessitent un effort supplémentaire pour le génotype. Par exemple, environ 2 % des isolats ne parviennent pas à s’amplifier avec l’ensemble d’amorces PCR SSU après la première tentative de lyse et doivent être relysés pour s’assurer que le matériau de lyse convient à l’amplification avec l’ensemble d’amorces ITS2 (Figure 8). De plus, environ 3 % des isolats ne parviennent pas à produire des séquences de qualité après une première série de séquençage de Sanger. Pour ces isolats, une autre série de lyse, de PCR ITS2 et de séquençage de Sanger est souvent nécessaire, ce qui peut augmenter le temps de main pour l’équipe d’isolement. Il est important de noter que l’identité de la séquence à elle seule n’est pas une preuve suffisante pour justifier une nouvelle espèce de Caenorhabditis (figure 7). Pour justifier correctement l’élevage d’un isolat en tant que nouvelle espèce de Caenorhabditis , des efforts supplémentaires doivent être faits pour effectuer des expériences d’accouplement et établir un spécimen typé13. Une description morphologique formelle du spécimen typé est également préférable, mais pas obligatoire3. Ensemble, ces considérations suggèrent que les chercheurs qui adoptent ce protocole de collecte bénéficieront de tests d’essai des étapes d’isolement et d’identification pour s’assurer que les ressources sont correctement allouées avant le début d’un projet de collecte. Il est important de noter que même les petits projets de collecte peuvent bénéficier de ce protocole, car le processus est hautement reproductible et les données peuvent facilement être auditées à des fins de contrôle de la qualité dans tous les groupes de laboratoires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig01.jpg"> Figure 1: Exemples de substrat. (A) Un fruit pourri idéal est montré au centre de l’image (1), le fruit est presque méconnaissable. Moins de fruits pourris sont montrés à proximité; éviter de goûter aux fruits fraîchement tombés (2). (B) Une fleur idéalement décomposée est représentée en haut (3). Évitez de goûter aux fleurs fraîchement tombées (4). (C) La litière de feuilles sombres sous la couche supérieure de feuilles sèches est idéale lors de l’échantillonnage des nématodes de Caenorhabditis (5). Évitez d’échantillonner la litière de feuilles sèches (6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig02.jpg"> Figure 2 : Application mobile d’échantillonnage de champ de nématodes. (A) Écran initial après l’ouverture de l’application d’échantillonnage de champs de nématodes sur un appareil Apple dans Fulcrum. La flèche rouge en bas à droite pointe vers le bouton + utilisé pour créer un nouvel enregistrement de collection. (B) Exemple d’un nouvel enregistrement de collection affiché sur un appareil Apple. La flèche rouge pointe vers le champ « Projet » en haut de l’écran d’enregistrement de la collection. Assurez-vous de sélectionner le bon projet lors de l’échantillonnage sur le terrain. Le champ de projet correspond par défaut au dernier projet utilisé lors de la création d’enregistrements de collection ultérieurs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig03.jpg"> Figure 3 : Sacs de prélèvement et plaques de prélèvement organisés avant le placage des échantillons. Cette figure montre les échantillons dans des sacs de collecte étiquetés C sur la gauche. Chaque sac de collection est surmonté d’une plaque de 10 cm étiquetée C assortie. Sur la droite se trouvent des plaques de collecte de 10 cm qui contiennent des échantillons après leur transfert des sacs de collecte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig04.jpg"> Figure 4 : Une plaque de prélèvement (plaque C) avec un échantillon correctement transféré. Une plaque en C de 10 cm avec des fruits en décomposition placés sur le bord de la pelouse bactérienne. L’étiquette C est fixée au couvercle de la plaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig05.jpg"> Figure 5 : L’application mobile d’isolation des nématodes. (A) Écran de sélection de l’application dans l’application mobile Fulcrum. La flèche rouge pointe vers l’application Isolation des nématodes. (B) L’écran initial après l’ouverture de l’application Nematode Isolation sur un appareil Apple dans Fulcrum. La flèche rouge en bas à droite pointe vers le bouton + utilisé pour créer un nouvel enregistrement d’isolement. (C) Exemple d’un nouvel enregistrement d’isolement affiché sur un appareil Apple. La flèche rouge pointe vers le champ « Projet » en haut de l’écran d’enregistrement d’isolement. Assurez-vous de sélectionner le bon projet lors de l’isolement. Le champ de projet correspond par défaut au dernier projet utilisé lors de la création des enregistrements d’isolement suivants. (D) Après avoir appuyé sur le champ Sélectionner sous C-label, les utilisateurs appuieront sur le bouton de recherche (flèche rouge) pour trouver l’étiquette C à partir de laquelle ils isolent les nématodes. (E) Une fois l’étiquette C sélectionnée, les utilisateurs photographieront la plaque C à l’aide de l’appareil photo. (F) Les utilisateurs saisissent ensuite s’il y a des nématodes sur la plaque C ou non. Des étiquettes S sont ajoutées à l’enregistrement d’isolement s’il y a des nématodes à isoler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig06.jpg"> Figure 6 : Page de résultats NCBI BLAST. (1) Menu déroulant utilisé pour afficher les résultats BLAST pour toutes les séquences. (2) Description de la séquence en cours sélectionnée dans la liste déroulante. Dans ce cas, les résultats pour S-label S-05554 sont affichés. (3) Le coup BLAST supérieur pour S-05554 est affiché. Le texte violet indique que le lien permettant de visualiser cet alignement a été cliqué. Assurez-vous d’inspecter les alignements à l’œil nu pour identifier de nouvelles espèces possibles de Caenorhabditis, voir l’étape 9.8 ci-dessus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig07.jpg"> Figure 7 : Exemples de visualisation de l’alignement NCBI BLAST. (A) Exemple de séquence de requête ITS2 d’un isolat alignée sur une séquence de sujet C. kamaaina. (1) Le pourcentage d’identité de l’alignement (89%), qui est faible pour un coup BLAST supérieur. (2) Une incompatibilité entre la requête et la séquence d’objet (G à A). (3) Un écart de quatre paires de bases dans la séquence de sujets réalisé par l’algorithme d’alignement; les lacunes dans la requête ou l’objet indiquent un mauvais alignement. (4) Une région généralisée au centre de l’alignement avec de nombreux décalages et lacunes. Une région comme celle-ci suggère que la séquence de requête pourrait provenir d’une nouvelle espèce de Caenorhabditis. Un exemple d’alignement réel d’une nouvelle espèce, C. oiwi, qui a été découverte en 2017, est illustré. (B) Exemple d’un bon alignement entre la séquence de requête ITS2 d’un isolat et une séquence d’objet. (5) Le pourcentage d’identité de l’alignement (99%), ce qui signifie généralement que la séquence de requête provient d’un isolat de la même espèce que le sujet. (6) Une région centrale de l’alignement avec une identité parfaite. Une région comme celle-ci suggère que l’isolat de requête est probablement de la même espèce que le sujet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig08.jpg"> Figure 8 : Produits pcR SSU et ITS2. Le gel supérieur montre les produits PCR générés avec l’ensemble d’apprêt SSU pour 12 échantillons représentatifs. Une échelle d’ADN est incluse à gauche comme référence. Les produits de PCR SSU pour les nématodes Caenorhabditis ont une longueur d’environ 500 pb. Les échantillons 2 à 12 ont été amplifiés avec l’ensemble d’amorces SSU, mais pas l’échantillon un. L’absence d’un amplicon SSU de 500 bp pour le premier échantillon suggère que le matériau de lyse était de mauvaise qualité et que l’échantillon doit être re-lysé. Le gel inférieur montre les produits PCR générés avec l’ensemble d’apprêt ITS2 pour les mêmes 12 échantillons que ceux présentés dans le gel supérieur. L’échelle et les échantillons sont dans la même orientation pour les deux gels. Six des 12 échantillons n’ont pas été amplifiés avec l’ensemble d’amorces ITS2. Les échantillons avec des bandes SSU et ITS2 sont séquencés par Sanger et identifiés par similitude de séquence à l’aide de l’algorithme NCBI BLAST. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Étiquettes C. Un fichier PDF contenant 2500 étiquettes C uniques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/C-labels.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : Étiquettes S. Un fichier PDF contenant 5000 étiquettes S uniques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/S-labels.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Matériel de terrain. Une liste de colisage des matériaux utilisés sur le terrain pour échantillonner les nématodes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 2 : Recettes de PCR et conditions du thermocycleur. Un tableau des recettes de PCR et des conditions des thermocycleurs pour les PCR ITS2 et SSU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 3 : Recettes de tampon d’électrophorèse. Une recette pour une solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,5 M de pH 8,0 et la solution tampon TRIS-acétate-EDTA (TAE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Ce protocole peut être utilisé pour effectuer des études écologiques à grande échelle sur les nématodes de Caenorhabditis auto-identifiés. Le principal avantage de cette méthode est l’organisation et l’analyse efficaces des données écologiques et moléculaires associées aux nématodes collectés dans la nature.

Une approche hautement évolutive pour effectuer des études écologiques sur les nématodes de Caenorhabditis Selfing

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Ce protocole peut être utilisé pour rationaliser l’isolement et l’identification des nématodes de Caenorhabditis de la nature et enregistrer des données écologiques et environnementales importantes associées à l’environnement naturel des nématodes. Les principaux avantages de cette technique sont son évolutivité et sa précision, qui sont rendues possibles en tirant parti des plates-formes de collecte de données mobiles, des bases de données basées sur le cloud et des fonctions de traitement de données standardisées. Pour commencer, identifiez un endroit pour étudier les nématodes de Caenorhabditis.Pour créer un projet Fulcrum, créez un compte avec Fulcrum en ligne à l’aide d’un accord éducatif gratuit et ajoutez l’application d’échantillonnage sur le terrain des nématodes. Ajoutez ensuite l’application d’isolement des nématodes. Imprimez un ensemble d’étiquettes de code QR en tant que C-Labels pour suivre les collections et S-Labels pour suivre les isolements de nématodes.Fixez les étiquettes C aux sacs en plastique Ziploc pour l’emballage. Conservez l’ensemble des étiquettes S pour une utilisation en laboratoire. Sélectionnez l’échantillonnage de champ de nématodes dans le menu déroulant de l’application mobile Fulcrum et appuyez sur plus pour démarrer un nouvel enregistrement dans le projet.Prenez une photo du substrat. Appuyez sur le champ C-Label et choisissez numériser. Scannez le code-barres sur le sac de collecte à l’aide de l’appareil photo de l’appareil mobile, puis appuyez sur Terminé.Appuyez sur le champ substrat et sélectionnez un type de substrat. Mesurez la température de surface du substrat à l’aide du thermomètre sans contact et enregistrez la valeur dans le champ de température du substrat. Mesurez et enregistrez également la température et l’humidité ambiantes.Enregistrez et enregistrez dans Fulcrum en appuyant sur Enregistrer en haut à gauche de l’écran. Collectez une cuillère à soupe du substrat sans bâtons ni autres pièces dures en inversant le sac de collecte comme un gant pour ramasser le substrat, puis scellez le sac. Pour chaque sac Ziploc, notez le C-Label sur le sac et attachez un C-Label assorti au couvercle d’une plaque de 10 centimètres repérée avec des bactéries OP50.Transférez une cuillère à soupe d’échantillon de chaque sac de collecte dans les assiettes en C à l’aide d’une cuillère en plastique propre. Dans l’application Fulcrum, choisissez Isolation des nématodes dans le menu de l’application. Ensuite, créez un nouvel enregistrement d’isolement en appuyant sur l’icône plus en bas à droite.Appuyez sur le bouton de sélection pour trouver l’étiquette C associée à un échantillon. Appuyez sur l’icône de recherche. Appuyez ensuite sur l’icône de numérisation pour scanner le code QR C-Label.Recherchez les nématodes sur la plaque C avec un microscope à dissection. Appuyez sur les vers dans le champ de l’échantillon pour enregistrer la présence de nématodes sur l’échantillon. Si aucun nématode n’est présent, parafilmer la plaque C et la jeter dans un bac à risque biologique.Si des nématodes sont présents, isolez jusqu’à cinq nématodes de la plaque C et transférez chacun sur sa propre plaque S. Ensuite, appuyez sur le champ Plaques marquées S pour entrer la plaque S utilisée pour cette isolation. Appuyez sur le plus en bas à droite.Appuyez sur S-Label, puis cliquez sur scan pour ouvrir la caméra de l’appareil, puis scannez le code QR S-Label sur la plaque S. Appuyez sur le bouton d’enregistrement en haut à droite une fois que toutes les informations ont été ajoutées correctement dans l’enregistrement d’isolement, puis parfilmez les plaques S avec des nématodes isolés et mettez-les de côté dans une zone désignée pour contenir les plaques S avec des nématodes. Connectez-vous au site Web Fulcrum et sélectionnez l’application d’isolation des nématodes.Cliquez sur exporter pour télécharger un fichier zip contenant le s_labeled_plates d’isolement des nématodes. fichier csv. Accédez au modèle de génotypage d’isolat sauvage Google Sheet et copiez Google Sheet.Placez les étiquettes S copiées à partir de l’isolement du nématode s_labeled_plates. colonne csv dans la feuille de génotypage. Vérifiez la prolifération des animaux sur des plaques S 48 heures après l’isolement.Si une plaque S contient des animaux proliférants, entrez-en une dans la colonne de prolifération 48 de la feuille de génotypage, puis déplacez la plaque S dans une boîte étiquetée 48 heures de prolifération case un. Vérifiez à nouveau les plaques S qui ne proliféraient pas 48 heures après l’isolement à 168 heures après l’isolement. Si une plaque S prolifère maintenant, entrez-en une dans la colonne de prolifération 168 sur la feuille de génotypage, puis déplacez la plaque S dans une boîte étiquetée 168 heures de prolifération case un.Filtrez le génotype dans Google Sheet pour n’inclure que les S-Labels dans une zone de prolifération à lyser, puis sélectionnez les colonnes S-Label via les nœuds de lyse. Imprimez une feuille de calcul de lyse pour chaque boîte de prolifération à lyser. Préparer 12 tubes à bandes de puits pour les échantillons à lyser.Décapsulez un tube de bande et ajoutez huit microlitres de tampon de lyse à chaque bouchon avec un pipetter répétitif. Choisissez trois à cinq animaux à partir des plaques sources dans les positions de capuchon indiquées sur la feuille de travail de lyse. Répétez l’opération jusqu’à huit tubes à bande et placez les tubes à bande dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.Retirez les ensembles de tubes à bande et exécutez le programme de lyse dans le thermocycleur. Ensuite, conservez les lysats à moins 80 degrés Celsius pendant une semaine. Retirez les tubes à bande du congélateur à moins 80 degrés Celsius et décongelez le matériau de lyse sur de la glace.Pendant que le matériau de lyse est en train de décongeler, préparez les mélanges maîtres ITS2 et SSU dans des tubes séparés sur de la glace. Ajouter deux microlitres de lysat au puits approprié dans la plaque PCR avec une pipette multicanal à faible volume. Exécutez les PCR avec le programme de thermocyclage approprié et notez les étiquettes S qui donnent des produits DE PCR ITS2 ou SSU dans la feuille de génotypage.Pour chaque échantillon positif ITS2, utilisez le produit ITS2 PCR restant pour le séquençage Sanger et obtenez les fichiers de sortie seq pour chaque S-Label à partir de la plate-forme de séquençage. Accédez au site Web NBCI BLAST dans un navigateur Web pour lancer la recherche BLAST. Pour les séquences de plaque S qui blast à une espèce de Caenorhabditis, entrez le genre complet et le nom d’espèce du blast supérieur dans la colonne ID de l’espèce.Nommez les souches avec des noms uniques, en suivant les conventions de nomenclature Caenorhabditis et entrez les noms des souches dans la colonne Nom de la souche. Pour traiter les données, accédez au site Web Fulcrum et exportez les données brutes du projet à partir de la base de données Fulcrum. Ouvrez un nouveau script R et suivez les instructions de la vignette easyfulcrum pour traiter les données de collecte.Dans NBCI BLAST, les résultats pour S-Label S-05554 montrent que le plus grand succès est Caenorhabditis briggsae. De plus, certains nématodes isolés nécessitent un effort supplémentaire pour le génotype. Par exemple, environ 2 % des isolats ne parviennent pas à s’amplifier avec l’ensemble d’amorces pcR SSU après la première tentative de lyse et doivent être utilisés pour s’assurer que le matériau de lyse convient à l’amplification avec l’ensemble d’amorces ITS2.En suivant cette procédure, les chercheurs peuvent explorer les données écologiques et environnementales associées aux isolats de nématodes sauvages afin d’identifier les emplacements et les caractéristiques du substrat les plus susceptibles d’abriter des espèces de nématodes spécifiques.

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