Exploration de l’interaction biomoléculaire entre le chaperon moléculaire Hsp90 et sa protéine cliente Kinase Cdc37 à l’aide de la technologie de biodétection à effet de champ

FEB est une plate-forme de détection d’interaction ______ _______ sans étiquette et rentable qui offre des mesures rapides et précises. Cette méthode offre une validation des interactions connues ou inconnues et un moyen facile de tester les inhibiteurs potentiels des interactions biomoléculaires. Le principal avantage de FEB est son logiciel automatisé et convivial qui porte l’utilisateur tout au long de l’expérience avec une plate-forme de pipetage à la main ouverte, permettant aux utilisateurs de travailler avec peu ou même pas de formation.

La technologie FEB offre également des applications dans divers domaines des produits pharmaceutiques, de l’analyse biomoléculaire de petites molécules, peptides et protéines, de la validation de médicaments en traduisant facilement l’activité biologique in vitro en efficacité in vivo. En tant que débutant, vous pouvez rencontrer des défis dans le choix des bonnes concentrations d’analyte pour optimiser l’expérience afin d’obtenir une valeur KD fiable. Nous conseillons de prêter attention au processus de fonctionnalisation de la puce et à l’échange de tampon approprié.

Commencez par mélanger des volumes égaux de solution d’EDC et de sulfo-NHS en pipetant de haut en bas. Placez la puce de biocapteur fournie par l’entreprise dans une boîte de Petri en verre avec un couvercle intégré. Toutes les étapes de fonctionnalisation impliquées dans l’activation de la puce sont suggérées à faire dans la boîte de Pétri.

Appliquez 50 microlitres de tampon MES à une molaire sur la puce du biocapteur. Incuber pendant une minute à température ambiante. Ensuite, aspirez le tampon et appliquez 50 microlitres de solution EDC sulfo-NHS immédiatement sur la puce du capteur.

Couvrir la boîte de Petri et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Aspirer la solution EDC sulfo-NHS de la puce et appliquer 50 microlitres de tampon MES à une molaire. Aspirez le tampon MES et rincez la puce deux fois avec 50 microlitres de 1X PBS.

Aspirer le PBS de la puce et ajouter la molécule cible Hsp90. Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez la solution contenant la molécule cible et rincez trois fois avec 50 microlitres de 1X PBS.

Aspirez la solution PBS 1X de la puce et ajoutez 50 microlitres de la solution de trempe. Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Aspirer la solution de trempe d’une puce et ajouter 50 microlitres de la solution de trempe deux.

Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Après cela, aspirez la solution de trempe deux de la puce et rincez la puce cinq fois à l’aide de 50 microlitres de 1X PBS en laissant la dernière gouttelette PBS sur le capteur. Préparer la série de dilution de l’analyte pour Cdc37 dans la plage de concentration souhaitée.

Concevez l’expérience pour inclure au moins huit concentrations d’analytes différentes afin d’obtenir une constante de dissociation fiable, ou valeur KD, et préparez ces différentes dilutions dans le même tampon utilisé pour l’étalonnage et la protéine cible. Placez soigneusement la puce sur l’instrument. Assurez-vous que le logiciel est allumé et que le voyant LED devient vert.

Ensuite, appuyez sur le module Exécuter l’expérience sur le logiciel automatisé et choisissez 10 points avec régénération ou tout autre protocole souhaité. Renseignez les détails tels que le nom de l’opérateur, le nom de l’expérience, la date, le tampon de régénération, la cible immobilisée et l’analyte dans la solution. Appuyez sur le bouton Commencer l’expérience affiché sur le logiciel et suivez les instructions affichées par le logiciel automatisé.

Pour effectuer l’étalonnage de l’instrument, aspirez la solution PBS restante de la puce et appliquez 50 microlitres du tampon d’étalonnage. Appuyez sur le bouton Continuer et attendez cinq minutes jusqu’à ce que l’étape d’étalonnage soit terminée. Le logiciel affiche le point de terminaison déterminé pour l’étape d’étalonnage avec une alarme d’avertissement à suivre.

Ensuite, effectuez une association d’analyte en aspirant le tampon d’étalonnage de la puce et en appliquant 50 microlitres de la concentration d’analyte la plus faible. Appuyez sur le bouton Continuer et attendez cinq minutes jusqu’à ce que l’étape d’association soit terminée. Le logiciel affiche le point de fin de l’étape d’association avec une alarme d’avertissement pour continuer.

Pour effectuer une dissociation d’analyte, aspirez la solution d’analyte de la puce et appliquez 50 microlitres du tampon de dissociation. Appuyez sur le bouton Continuer. Après la durée de l’étape de dissociation, le logiciel affiche le point de terminaison de l’étape de dissociation avec une alarme d’avertissement.

Ensuite, effectuez la régénération de la puce en aspirant la solution de dissociation de la puce et en appliquant 50 microlitres du tampon de régénération. Ensuite, appuyez sur le bouton Continuer. L’étape de régénération prend généralement environ 30 secondes.

Après cela, le logiciel affiche le point final de l’étape de régénération avec une alarme d’avertissement à suivre. Enfin, pour laver la puce, aspirez la solution de régénération de la puce et appliquez 50 microlitres du tampon de lavage. Aspirez la solution de la puce et répétez-la cinq fois.

Laissez la dernière goutte du tampon de lavage sur la puce. Ensuite, appuyez sur le bouton Continuer et attendez 30 secondes jusqu’à ce que la durée de l’étape de lavage soit terminée sur l’écran du logiciel. Répétez les étapes pour chaque concentration d’analyte utilisée.

Les cinq étapes de l’étalonnage, de l’association des analytes, de la dissociation, de la régénération et du lavage cinq fois constituent un cycle. Appuyez sur le bouton Analyse du logiciel d’analyse automatisé à la fin de l’expérience. Une fenêtre d’affichage contenant tous les points expérimentaux apparaîtra.

S’assurer que les concentrations d’analyte utilisées pour le protocole prescrit sont correctes. Appuyez sur le bouton Exécuter l’analyse pour générer automatiquement la valeur KD. Le logiciel génère un diagramme d’ajustement en côte en traçant les concentrations d’analyte par rapport aux réponses I correspondantes à partir desquelles la constante de dissociation à l’équilibre est calculée.

La protéine cible Hsp90 a été immobilisée sur la puce, et pour la première expérience, 10 concentrations de la protéine analytique Cdc37 allant de 25 nanomolaires à 5 000 nanomolaires ont été préparées. Les fichiers de données générés à partir de la première expérience ont été montrés ici. Les données expérimentales surveillées en temps réel sont présentées ici.

L’axe Y correspond à la réponse I dans les unités de biocapteurs, et l’axe X correspond aux différents points temporels et concentrations de l’analyte dans l’expérience. L’image graphique présentée ici représente le tracé d’ajustement en pente généré par le logiciel d’analyse automatisé. L’axe Y correspond à la réponse I dans les unités de biocapteurs, et l’axe X correspond aux différentes concentrations d’analytes dans l’expérience.

L’image graphique présentée ici représente le diagramme d’association généré à l’aide du logiciel d’analyse statistique. L’axe Y correspond à la réponse I à la fin de la phase d’association, et l’axe X correspond aux différentes concentrations de l’analyte Cdc37. Dans la deuxième expérience, un ensemble différent de concentrations allant de 0,4 nanomolaire à 200 nanomolaires a été utilisé, et les fichiers de données générés sont montrés ici.

Les images graphiques représentent le thermogramme ITC de l’interaction Hsp90 et Cdc37. Voici les courbes correspondantes d’évolution de la chaleur obtenues grâce aux injections consécutives de Cdc37 dans Hsp90 à 298,15 Kelvin. La puissance différentielle utilisée ici est fonction du temps.

Les points de données intégrés dans ce graphique désignent la chaleur normalisée correspondante par rapport au rapport de Mueller de Hsp90 à Cdc37. L’approche de pipetage ouvert utilisée ici exige que l’utilisateur ait une maîtrise de base du pipetage à la main, en veillant à ne pas toucher le biocapteur avec la pointe. La reproductibilité du chronométrage des étapes dépend entièrement de l’utilisateur.

Une fois que le chercheur a caractérisé une interaction entre deux biomolécules, nous pouvons effectuer une expérience de dépistage en concevant des inhibiteurs ou des modulateurs potentiels ciblant l’interaction biomoléculaire spécifique à l’aide du système FEB. Cette procédure peut être utilisée pour identifier, vérifier et quantifier l’interaction connue et nouvelle entre les protéines, ainsi que les petites molécules, y compris les médicaments et les peptides.