Interview: présentation des antigènes glycolipides par CD1d et le potentiel thérapeutique de l'activation des cellules NKT

Bonjour, je m'appelle Mitchell Cronenberg et je travaille à l'Institut de La Jolla pour l'allergie et l'immunologie. Je suis en réalité président et directeur scientifique, mais je dirige également un laboratoire de recherche très actif, et c'est bien sûr de l'une de nos technologies que nous allons parler, à savoir les tétramères CD1D. La majeure partie des travaux de mon laboratoire porte sur les lymphocytes T réactifs au CD1D.

Et ces cellules sont uniques car elles reconnaissent les glycolipides plutôt que les peptides. Un autre axe de recherche de mon laboratoire porte sur un sujet complètement différent, à savoir le système immunitaire muqueux et sa régulation. Les molécules CD1 sont des molécules présentatrices d'antigènes, ce qui signifie qu'elles se lient à des antigènes ou à des fragments de protéines ou d'autres molécules, et les présentent à la reconnaissance par les lymphocytes T.

Il existe maintenant deux types vraiment différents de molécules présentatrices d'antigènes. Certaines fixent ou présentent des peptides, tandis que d'autres fixent des lipides et des glycolipides. Les molécules CD1 fixent les lipides et les glycolipides.

C'est leur fonction : elles stabilisent ou présentent ces lipides et glycolipides aux cellules T. Il existe en réalité quatre types différents de molécules CD1, CD1A, CD1B, CD1C et CD1D. Nous nous concentrons en particulier sur le CD1D, qui est probablement le mieux étudié, en partie grâce à l'existence de modèles murins. Le CD1D présente des glycolipides à un type particulier de cellule T appelé cellule T tueuse naturelle, un globule blanc inhabituel possédant des caractéristiques à la fois de la réponse immunitaire innée et adaptative.

Les glycolipides présentés peuvent être des glycolipides endogènes, bien qu'ils ne soient pas très bien caractérisés à ce stade, ou bien des glycolipides microbiens. Les glycolipides dont nous savons qu'ils sont présentés proviennent de deux sources. L'une est constituée des bactéries dites FMS, qui sont probablement les bactéries les plus abondantes dans la biosphère.

Ils vivent dans l'océan, ils vivent dans les plantes, ils vivent dans le sol. Toutefois, ils ne rendent que peu de gens malades. Nous sommes très habitués à vivre avec ces bactéries, je suppose.

Et la deuxième catégorie que nous connaissons, un autre type de glycolipide appelé diglycérol contenant des glycolipides. On les trouve dans Borrelia borre, qui provoque la maladie de Lyme, et probablement dans de nombreux autres agents pathogènes. Nous commençons seulement à découvrir les différents types de bactéries possédant ces glycolipides.

Nous avons donc ce que l'on appelle des glycolipides signal provenant de SMS et des lipides dialyglycériques provenant de Borrelia, ainsi que probablement de nombreux autres qui sont véritablement pathogènes. Ces lipides sont chargés sur des molécules CD1d principalement au niveau des cellules dendritiques, bien qu’elles puissent également concerner les lymphocytes B, les cellules ER du foie et peut-être d'autres types cellulaires. Ces molécules CD1d passent par les lysosomes et les endosomes, où elles se lient probablement à ces lipides, puis transportent le lipide vers la surface cellulaire afin d'être reconnu par les lymphocytes T, notamment les cellules T aux natural killer que j'ai mentionnées précédemment.

L'un des phénomènes qui se produit lorsque vous êtes exposé à une bactérie possédant des glycolipides est l'activation très rapide des cellules T NK. Contrairement aux cellules T conventionnelles, c’est-à-dire les cellules T réactives aux peptides, qui mettent généralement trois ou quatre jours pour déclencher une réponse immunitaire efficace, surtout si elles n’ont pas été préalablement exposées à l’antigène.

En d'autres termes, s'ils sont naïfs. En revanche, les cellules T NK peuvent être activées en quelques heures seulement et commencent alors à produire des cytokines telles que l'interféron gamma, essentiel pour l'élimination bactérienne en un laps de temps très, très court. De ce fait, elles présentent des aspects similaires à la réponse immunitaire innée du modèle.

En étudiant des antigènes modèles, nous savons que la CD1D pénètre dans les endosomes tardifs et les lysosomes, des compartiments intracellulaires très acides où les antigènes glycolipidiques sont chargés dans la CD1, et il existe en effet des protéines de transfert spéciales à l'intérieur des cellules présentatrices d'antigènes, comme les cellules dendritiques, qui aident à charger les lipides dans la molécule CD1D. Avec ces bactéries fona, les bactéries borre et d'autres, nous avons affaire à des bactéries extracellulaires. Ainsi, les antigènes lipidiques doivent être transportés d'une manière ou d'une autre à l'intérieur de la cellule, probablement vers un lysosome, puis chargés dans la molécule CD1.

Ensuite, il y a une activation immédiate de la cellule NKT, et tout cela doit se produire en quelques heures à l'intérieur des sinusoides, dans le foie, dans la rate, peut-être dans la moelle osseuse et d'autres sites où l'on trouve des cellules NKT. La structure tétramérique est essentielle pour définir sans ambiguïté ces cellules T natural killer, qui possèdent ces propriétés innées les distinguant des autres cellules T. Les autres marqueurs disponibles sont en réalité trop ambigus, alors que les tétramères permettent d'identifier les cellules selon la spécificité de leur récepteur d'antigène, fait clé qui les définit en quelque sorte. La conception de tétramères remonte à loin.

Il a été inventé par Mark Davis et John Alman, et l'idée était que le récepteur des lymphocytes T possède une faible affinité, et si vous souhaitez définir ou identifier des cellules selon leur spécificité, les peptides qu'elles reconnaissent ou les complexes de peptides et de molécules présentatrices d'antigène n'ont pas une affinité suffisante, une force de liaison assez élevée pour vous permettre d'identifier la cellule. Ainsi, Mark Davis et John Allman ont mis au point cette technologie des tétramères, une méthode permettant de fabriquer, dans certains cas, des tétramères des molécules présentatrices d'antigène associées à la molécule qu'elles présentent, ce qui augmente fondamentalement l'affinité ou la force de l'interaction. Vous pouvez donc visualiser la cellule spécifique pour un peptide de la grippe et une molécule présentatrice d'antigène particulière, ou tout autre antigène qui vous intéresse.

Technologie très importante, car elle vous permet, par exemple, de voir à quel point un schéma vaccinal pourrait être efficace. Ce que nous avons fait, à partir de la fin des années 1990, c'est qu'initialement j'ai publié un article en 2000 qui a été cité environ 500 fois à ce jour. Ce que nous avons fait, c'est simplement d'adapter cette technologie aux lipides.

Nous avons donc produit des molécules de CD1 solubles et, par des méthodes que je décrirai brièvement, nous avons pu les multimériser, autrement dit les assembler avec des glycolipides spécifiques, et ainsi les utiliser comme réactifs pour tester la présence de récepteurs spécifiques des cellules T. Autrement dit, ceux qui reconnaissent le glycolipide qui nous intéresse associé à CD1D. Les tétramères peuvent être utilisés dans toute situation où l'on souhaite analyser le nombre de cellules T auxiliaires naturelles (NKT), leur état d'activation et leur fonction.

Dans notre laboratoire, cela peut provenir de l'un ou l'autre de plusieurs projets différents. Par exemple, si vous souhaitez savoir si un mutant particulier et une voie de signalisation affectent le développement des cellules T-NK, nous pouvons le déterminer à l'aide de nos tétramères, en évaluant le nombre de cellules T-NK. En outre, il existe d'autres marqueurs, d'autres protéines de surface cellulaire que nous pouvons analyser afin d'évaluer si les cellules T-NK sont matures ou activées. À l'aide des tétramères, après une stimulation antigénique, nous pouvons également déterminer non seulement si elles sont activées, mais aussi quelles cytokines elles produisent.

Ainsi, nous pouvons combiner la coloration par tétramère avec, par exemple, la coloration intracellulaire des cytokines et déterminer quel pourcentage des cellules NKT produit de l'interféron gamma, quel pourcentage produit de l'IL-4, quel pourcentage produit les deux, grâce à la cytométrie en flux multiparamétrique. Nous pouvons poser diverses questions sur la production de cytokines directement ex vivo par ces cellules. Nous pouvons également réaliser d'autres expériences. Par exemple, nous pouvons utiliser les tétramères pour purifier les cellules T NK en vue de leur culture in vitro afin d'étudier leurs interactions avec d'autres types cellulaires, ou même pour leur transfert vers un animal receveur, qui pourrait par exemple présenter un déficit en cellules T NK pour des raisons génétiques.

Nous voulons restaurer cette fonction. Nous pouvons le faire et nous interroger sur le site d’homing des cellules et sur leur mode de fonctionnement. Enfin, je sais que, dans le cas des cellules NKT humaines, des chercheurs ont effectivement utilisé des tétramères pour amplifier des lignées cellulaires in vitro afin de cultiver des cellules à des fins analytiques, et potentiellement même à des fins thérapeutiques.

Eh bien, nous utilisons un système d'expression viral Bao pour produire des tétramères CD1D. Le processus débute donc par un vecteur d'ADN courant contenant un promoteur ainsi que les séquences d'expression de la bêta-2-microglobuline et de la chaîne lourde CD1D. Cette molécule CD1 est ainsi un hétérodimère composé de deux polypeptides.

Nous disposons donc de ce système d'expression à deux promoteurs, et nous infectons des cellules de culture tissulaire d'insectes avec les virus vao, soigneusement titrés comme l'a expliqué notre canal. Ensuite, nous infectons les cellules et nous récupérons, à partir du milieu de culture tissulaire, la protéine exprimée par les cellules. La chaîne lourde CD1D est conçue spécifiquement pour la production de tétramères.

Il y a deux éléments, ou plutôt trois éléments, devrais-je dire, que nous effectuons. Le premier consiste à retirer la partie transmembranaire. Ainsi, nous exprimons une protéine soluble.

Deuxièmement, nous avons ajouté une étiquette hexa-his afin que la protéine puisse être purifiée par chromatographie d'affinité aux ions métalliques. Troisièmement, nous disposons d'un site appelé BirA pour la biotinylation enzymatique. Et ceci constitue l'innovation.

Il était très important, lorsque Davis et Alman ont inventé pour la première fois la technologie de production de tétramères. Ainsi, après avoir récupéré la protéine, elle est purifiée sur une colonne au nickel par chromatographie d'affinité au nickel. Parfois, nous effectuons une chromatographie d'exclusion stérique par la suite.

Ensuite, la protéine peut être biotinylée enzymatiquement par incubation, et une fois biotinylée enzymatiquement, elle formera des tétramères lorsqu'elle sera incubée avec la streptavidine. Mais la protéine soluble CD1 peut être incubée pratiquement toute la nuit dans une solution contenant un glycolipide d'intérêt. Très important, le glycolipide ne doit pas être dissous dans du DMSO, car c'est un diluant ou solvant couramment utilisé pour les glycolipides, mais CD1 est très sensible à ce produit.

Nous utilisons donc généralement un tampon contenant une faible quantité de Tween et du PBS. Ce tampon s'avère très efficace pour dissoudre la plupart de nos glycolipides. Pour la charge dans CD1D, qui semble se produire spontanément, nous utilisons de la streptavidine provenant de n'importe quel fabricant parmi une variété de fournisseurs.

Et il est couplé à des colorants PE, FITC, Erythrine ou phycocyanine PC, et chacun de ces colorants fonctionne très bien et nous donne une excellente coloration. Globalement, la procédure ne diffère donc pas beaucoup des procédures bien caractérisées pour la production de tétramères de classe I du CMH, sauf que nous n'utilisons pas une expression bactérienne, mais une expression par virus bactérien, et bien sûr, nous utilisons des antigènes lipidiques plutôt que des peptides. Un point que je devrais souligner est que les humains possèdent des cellules T NK et qu'elles ont la même spécificité que les cellules T NK de la souris.

Ainsi, cette spécificité existe depuis au moins 60 millions d'années, époque de notre divergence avec les rongeurs. En effet, nous produisons des tétramères humains CD1D selon les mêmes techniques que celles que vous pouvez observer dans la vidéo réalisée ici. Toutefois, les cellules T NK humaines fonctionnent très bien avec les tétramères de souris, et inversement. Par conséquent, nous ne produisons pas systématiquement les tétramères humains, car nous pouvons utiliser nos tétramères de souris pour les études chez l'homme.

Ainsi, de nombreux modèles murins ont montré que les cellules T NK jouent un rôle déterminant dans l'issue de la réponse immunitaire. Cela va de la réponse aux cancers et de la régulation des maladies auto-immunes, à l'élimination des agents infectieux, et même au développement de plaques scléreuses, un processus inflammatoire chronique qui se produit dans les artères.

Il existe certaines interrogations quant à l'importance de ces cellules chez l'homme, où elles sont moins abondantes. De nombreux rapports indiquent qu'elles sont modifiées dans les états auto-immuns, et d'autres études signalent qu'elles sont très enrichies dans les poumons des patients asthmatiques. Bien que ces rapports incluent une étude publiée dans le New England Journal of Medicine, cette question reste controversée. Toutefois, plusieurs études chez l'homme suggèrent que ces cellules pourraient être importantes.

En ce qui concerne les essais cliniques, la stimulation des cellules NKT a été évaluée dans quatre essais de phase I chez des patients atteints de cancer avancé. Il existe quelques preuves d'efficacité, bien entendu, ces patients sont très gravement malades et les études sont en cours pour plusieurs types de cancers différents. Certaines personnes s'intéressent également à l'utilisation de la thérapie par médiation des cellules NK T dans les maladies auto-immunes, bien que cela n'ait pas encore véritablement démarré.

Les tétramères peuvent jouer un rôle dans ces études principalement en ce qui concerne l'analyse de ce qui s'est produit avec les cellules NKT après la thérapie par agoniste. L'idée consiste généralement à utiliser des agonistes glycolipidiques ou, dans certains cas, même des antagonistes glycolipidiques, que d'autres équipes sont en train de développer, selon la réponse et l'état pathologique. Ensuite, on évalue ce qui s'est produit avec les cellules T NK, ce que l'on ferait normalement à l'aide de tétramères.

Un autre usage potentiel consisterait à l'expansion in vitro de cellules NKT humaines. Il est tout à fait envisageable et possible de cultiver de grands nombres de cellules NKT humaines in vitro, par exemple par stimulation antigénique, qui pourrait être réalisée à l'aide de tétramères ou de cellules exprimant les bonnes glycolipides. En plus de l'utilisation de tétramères ou de cellules, il est nécessaire d'ajouter une cytokine.

Mais dans ces conditions, on peut amplifier un grand nombre de cellules T NK humaines. Et un autre groupe au moins à Boston s'intéresse à ce type de thérapie, par opposition à la thérapie basée sur les glycolipides. Une autre partie de mon laboratoire participe à l'étude de l'immunité muqueuse.

La plupart des immunologistes se sont concentrés sur les lymphocytes ou les globules blancs présents dans les ganglions lymphatiques et la rate. Pourtant, la majorité de ces cellules dans notre organisme se trouve probablement dans la muqueuse intestinale, un site où nous abritons également entre 10¹⁴ et 10¹⁵ bactéries. Ainsi, d’un point de vue microbien, nous sommes en grande partie stériles, sauf au niveau de notre intestin.

Et dans l'intestin, nous disposons également d'une très grande quantité de globules blancs. Ces cellules possèdent des propriétés uniques et, en réalité, elles sont relativement peu étudiées. Nous menons donc certaines recherches fondamentales sur ces cellules.

Mais nous étudions également un processus que j'appellerais une dysrégulation immunitaire, au niveau de l'intestin, menant à la maladie inflammatoire de l'intestin, qui correspond essentiellement à des affections immuno-médiées touchant l'intestin grêle ou le côlon, et désignées sous les noms de maladie de Crohn ou de rectocolite ulcéreuse. Et bien que nous réalisions certaines études chez l'humain, la majeure partie de nos travaux porte sur des modèles murins. Nous disposons de modèles murins, que je considère comme très pertinents, pour étudier la dysrégulation du système immunitaire muqueux conduisant à des symptômes semblables à ceux de la maladie de Crohn.

Nous étudions ce processus ainsi que des moyens d'interférer avec celui-ci, dans l'espoir ultime de développer de meilleures thérapies pour les patients souffrant de ces maladies immuno-médiées. En conclusion, nous pourrions réfléchir un peu à l'orientation que prendra l'immunologie au cours des 10 prochaines années environ, bien qu'il soit vraiment difficile de prévoir à 10 ans d'avance. Aussi surprenant que cela puisse paraître.

Je pense que le système immunitaire muqueux est en réalité l'un des principaux domaines de l'immunologie encore peu explorés. Bien qu'un nombre croissant de personnes et d'équipes de premier plan s'intéressent désormais aux études en immunologie muqueuse. Je pense qu'un autre domaine qui aura un impact considérable est la génétique, en particulier la génétique humaine : à mesure que nous progresserons, ou devrais-je dire, que nous avancerons vers le séquençage de 1 000 génomes humains, il deviendra vraiment possible de réaliser des études sur des individus et d'évaluer comment la variabilité de l'ADN influence la réponse immunitaire.

Actuellement, la plupart des meilleures études sur les voies fondamentales impliquent des rongeurs. Les rongeurs, en particulier les souris, sont essentiels à nos recherches. Mais je pense qu'à l'avenir, lorsque nous envisagerons des phénomènes auto-immuns complexes ou d'autres processus qui pourraient se produire chez les individus, nous serons en mesure d'aborder ces questions à partir des polymorphismes génétiques humains.

Nous serons en mesure d'évaluer les polymorphismes, puis d'utiliser ces informations pour tenter de prédire comment cela influencera les réponses immunitaires, et évoluer éventuellement vers ce que j'appellerais, et que d'autres appellent également, des thérapies immunitaires personnalisées ou, de façon plus générale, la médecine personnalisée. Ainsi, la génétique aura un impact considérable. Nous disposons déjà d'excellents outils en génétique murine.

Nous pouvons éliminer n'importe quel gène que nous souhaitons. Nous pouvons éliminer l'expression de gènes dans des types cellulaires spécifiques. Nous pouvons accomplir des choses extraordinaires.

Mais je pense que, à l'avenir, nous allons étudier la compréhension de la réponse immunitaire et de l'immunité du point de vue des réponses humaines.